Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, 2008. / Submitted by Priscilla Brito Oliveira (priscilla.b.oliveira@gmail.com) on 2009-09-25T17:33:51Z No. of bitstreams: 1 Dissert_Julia Poubel Coelho.pdf: 2109130 bytes, checksum: b6ff6344b759c1414a4815506cedb27b (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2010-06-11T15:28:22Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissert_Julia Poubel Coelho.pdf: 2109130 bytes, checksum: b6ff6344b759c1414a4815506cedb27b (MD5) / Made available in DSpace on 2010-06-11T15:28:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissert_Julia Poubel Coelho.pdf: 2109130 bytes, checksum: b6ff6344b759c1414a4815506cedb27b (MD5) Previous issue date: 2008 / A nanobiotecnologia consiste em um campo de pesquisa emergente e promissor. Materiais nanoestruturados, tais como fluidos magnéticos e magnetolipossomas (ML), têm sido propostos como sistemas de entrega de drogas e termoterapia contra o câncer, entre outras aplicações em biomedicina. Em particular, ML são estruturas fisiologicamente estáveis, constituídas por nanopartículas magnéticas (NPM) acondicionadas em uma bicamada fosfolipídica. Uma amostra de ML contendo nanopartículas de maghemita recobertas com citrato encapsuladas em lipossomas (denominada ML-Magh) foi sintetizada com propósitos de aplicações biomédicas. Polietilenoglicol (PEG) foi associado à bicamada lipídica. A proposta deste estudo foi investigar o comportamento biológico de ML-Magh (1,0 × 1014 partículas/ mL), avaliando sua biocompatibilidade/ toxicidade por meio de testes in vitro e in vivo. O tamanho e o potencial de carga de superfície dos ML foram estudados e apresentaram diâmetro médio de 124 nm e carga negativa (potencial zeta, -24,4 mV). Nos testes in vitro, células ductais de glândula submandibular humana (HSG) e células mesangiais (CM) foram cultivadas durante 24 horas na presença de ML-Magh em duas diferentes doses (50 mL and 100 mL). Análises por microscopia de luz mostraram que ML-Magh não induz alterações morfológicas em ambos os tipos celulares. Para os testes in vivo, 100 mL de ML-Magh foram endovenosa ou intraperitonealmente administrada em camundongos fêmeas Swiss (n=5-6). Animais controle (n=3) foram tratados com solução salina tamponada por fosfato (PBS). Os efeitos da amostra ML-Magh foram investigados de 30 minutos até 30 dias após administração, dependendo do teste. A viabilidade de células peritoneais investigada por meio de dois diferentes métodos, exclusão por Nigrosina e Iodeto de Propídio, não foi afetada. A contagem de leucócitos do sangue indicou que ML-Magh não apresenta potencial próinflamatório. Apenas um aumento na população de eosinófilos foi observado, uma hora após administração de ML-Magh, sugerindo um ligeiro processo alérgico. A ausência de genotoxicidade e citotoxicidade foi confirmada respectivamente, pelo teste de micronúcleo e porcentagem de eritrócitos policromáticos. A análise histopatológica realizada em três tecidos mostrou poucos agregados de NPM em pulmões e baço, e nenhum no fígado. Alterações morfológicas não foram encontradas nestes tecidos durante todo o período experimental. Os raros infiltrados inflamatórios observados após tratamento no fígado e nos pulmões também foram vistos nos animais controle. Testes bioquímicos realizados no sangue mostraram alterações irrelevantes, uma vez que as concentrações de alanina aminotransferase (ALT), fosfatase alcalina (FA), uréia e creatinina foram constantes em quase todos os tempos após administração de ML-Magh, sugerindo ausência de danos hepáticos e renais. A determinação dos níveis de ferro sérico mostrou que ML-Magh não alterou significativamente os níveis de ferro, exceto em testes com o dobro (200 mL) da concentração usual. Os dados sugerem que a amostra investigada é biocompatível e tem potencial para ser usada em aplicações biomédicas, especialmente como agentes na terapia contra o câncer, por meio da magnetohipertermia ou sistemas de entrega de drogas. ________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / Nanobiotechnology represents an emerging and promising research field. Nanostructured materials, such as magnetic fluids and magnetoliposomes (MLs), have been proposed for drug-delivery systems and thermal-based cancer therapy amongst other several applications in biomedicine. In particular, MLs are physiologically stable structures, consisting of magnetic nanoparticles (MNPs) wrapped by a phospholipid bilayer. A ML sample containing citrate-coated maghemite nanoparticles encapsulated in liposomes (called ML-Magh) was synthesized for biomedical applications purposes. Polyethylene glycol (PEG) was grafted onto the liposome bilayer. The aim of this work was to investigate the biological behaviour of ML-Magh (1,0 × 1014 particle/ mL), by evaluating their biocompatibility/ toxicity through in vitro and in vivo tests. The particle size and surface charge potential of MLs were determined. They presented a mean particle size of 124 nm and a negative surface charge, as determined by measuring the zeta potential (-24,4 mV). To perform the in vitro test, human submandibular duct cells (HSG) and mesangial cells (CM) were cultivated during 24 hours in the presence of the ML-Magh sample at two different doses (50 mL and 100 mL). Analysis by light microscopy showed that ML-Magh does not induce morphological alterations on both cellular types. For the in vivo tests, 100 mL of the ML-Magh sample were endovenously or intraperitoneally administrated to female Swiss mice (n=5-6). Control animals (n=3) were treated with phosphate buffered saline (PBS). ML-Magh sample effects were investigated from 30 minutes until 30 days after the administration. The viability of peritoneal cells was not affected by the ML-Magh treatment, as investigated by two different methods: nigrosin dye exclusion and propidium iodide exclusion. The leukocytes cytometry indicated that ML-Magh has no pro-inflammatory action. The eosinophil population presented an increase one hour after ML-Magh administration, suggesting a slight allergic process. Absence of genotoxicity and cytotoxicity was confirmed by micronucleus test and polychromatic erythrocyte percentage, respectively. The histopathology analysis performed in three tissues showed few particle clusters in the lungs and spleen. Clusters were not observed in the liver. No morphological alterations were found in these tissues during all the experimental time. The rare inflammatory infiltration observed in the liver and lungs of MLMagh- treated mice was also observed in control animals. Biochemical blood tests showed irrelevant alterations. Concentrations of alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), urea, and creatinine were constant almost all over the experiment, suggesting no hepatic or splenic injury. The levels of serum iron were not affected by ML-Magh treatment. Nevertheless, serum iron levels are dose-dependent. Data suggest that the investigated sample is biocompatible and it has potential to be used in biomedical applications, especially as agents for anticancer therapy through magnetohyperthermia and drug delivery systems.

Orientador: Oswaldo Luiz Alves / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-26T03:04:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Simoes_MateusBatista_M.pdf: 4986679 bytes, checksum: 2b115e73f65ae444a8545b2ab4b05173 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As diferenças nas propriedades observadas considerando um material no seu estado bulk e na sua escala nanométrica são, possivelmente, a característica mais marcante e fascinante da nanotecnologia. Os carbon dots são nanomateriais baseados em carbono que apresentam fluorescência quando menores do que 10 nm, mas que podem fluorescer após tratamento da sua superfície, quando em partículas da ordem de até 100 nm. É interessante notar que o comprimento de onda no qual ocorrerá a fluorescência é dependente do tamanho das partículas. Assim, é possível modular a fluorescência controlando o tamanho dos carbon dots, os quais apresentam grande potencial para aplicação em fotocatálise, bioimagem, sensores e optoeletrônica, sendo possível funcionalizar estes materiais, objetivando uma aplicação in vivo, a fim de aumentar sua biocompatibilidade. As sínteses hidrotérmicas vêm despertando interesse para a obtenção dos carbon dots, por ser uma técnica simples, econômico e eficiente. Além disto, é possível obter materiais com grande homogeneidade e com controle de morfologia e tamanho, fatores estes que irão influenciar a fluorescência. Desta forma, o presente trabalho teve como objetivo estudar a influência das condições de síntese hidrotérmica na fluorescência dos carbon dots, realizar a funcionalização deste material e avaliar a capacidade de utilização in vivo do material por meio de ensaios de hemólise. Carbon dots foram obtidos por meio da carbonização hidrotérmica de glicose e as condições de síntese foram otimizadas utilizando-se um planejamento fatorial. Observou-se que temperatura e tempos de síntese elevados e uma menor concentração inicial da fonte de carbono leva a nanopartículas com maior rendimento quântico (variando entre 3,3 e 5,8%). Os carbon dots foram caracterizados por espectroscopia na região do infravermelho, espectroscopia na região do ultravioleta-visível, microscopia eletrônica de transmissão, além de ter seu perfil de fluorescência estudado, sendo que o máximo de excitação ocorre na região do ultravioleta e o máximo de emissão na região do azul. Testes hemolíticos foram realizados com as nanopartículas que apresentaram maior rendimento quântico e mostraram que não há indução de hemólise, demonstrando que o material tem elevado potencial para aplicação in vivo. Por fim, utilizando-se as condições ótimas de síntese, carbon dots também foram obtidos por meio da carbonização hidrotérmica de pectina, demonstrando que o método de síntese é robusto e válido para fontes de carbono alternativas. Os carbon dots obtidos de pectina apresentam um rendimento quântico de 3,6% e foram caracterizados pelas mesmas técnicas utilizadas para os carbon dots de glicose / Abstract: The differences in observed properties considering a material in its bulk state and its nanoscale are possibly the most striking and fascinating feature of nanotechnology. Carbon dots are carbon-based nanomaterials that present fluorescence when smaller than 10 nm, but may fluoresce after treatment of its surface considering particles of the order of until 100 nm. Interestingly, the wavelength at which the fluorescence occurs is dependent on the particle size. Thus, it is possible to modulate the fluorescence controlling the size of the carbon dots, which have great potential for application in photocatalysis, bioimage, optoelectronics and sensors, being possible to functionalize these materials, aiming an application in vivo, in order to increase its biocompatibility. The hydrothermal syntheses have attracted interest for obtaining the carbon dots, being a simple, cheap and efficient technique. Moreover, it is possible to obtain materials with high homogeneity and controlled morphology and size, factors that will influence the fluorescence. Thus, the present work aimed to study the influence of the conditions of hydrothermal synthesis in the fluorescence of carbon dots, perform the functionalization of this material and evaluate the ability to in vivo use of the material by hemolytic trials. Carbon dots were obtained by hydrothermal carbonization of glucose and the synthesis parameters were optimized by a factorial design of experiments. It was observed that higher temperature and time of synthesis and a lower initial concentration of the carbon source leads to nanoparticles with a higher quantum yield (varying between 3.3 and 5.8%). The carbon dots were characterized by infrared spectroscopy, ultraviolet-visible spectroscopy, transmission electron microscopy, beyond to have its fluorescence profile studied, and it was observed that the maximum excitation occurs at the ultraviolet range and the maximum emission at the blue range of the spectrum. Hemolytic trials were performed with the nanoparticles of highest quantum yield, and the results showed that no hemolysis was provoked, demonstrating that he material have a raised potential to in vivo applications. Lastly, with the optimized synthesis parameters, carbon dots were also obtained by hydrothermal carbonization of pectin, evidencing that the synthesis protocol is robust and effectual to alternatives carbon sources. The carbon dots of pectin presented a quantum yield of 3.6% and were characterized by the same techniques utilized to the carbon dots of glucose / Mestrado / Quimica Inorganica / Mestre em Química

Orientador: Oswaldo Luiz Alves / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-19T14:26:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Martinez_DiegoStefaniTeodoro_D.pdf: 3429324 bytes, checksum: cc064a83a4c293e8f0dbeb800c8212cb (MD5) Previous issue date: 2011 / Resumo: Neste trabalho foram estudados aspectos de purificação e caracterização de nanotubos de carbono de parede múltiplas, bem como suas interações com diferentes níveis de organização dos biossistemas. Os nanotubos foram purificados e caracterizados após tratamentos químicos com HNO3, HCl e NaOH em sistema de refluxo convencional, sendo obtido nanotubos com pureza > 98,5 % (livres de ferro) e livres de resíduos carbonáceos. Para expressas os reflexos da interação dos nanotubos purificados com os biossistemas selecionados foi adotada uma abordagem sistêmica (Nível Ecológico > Nível Imunológico > Nível Celular-molecular). Os principais resultados desta interação foram: i) ausência de ecotoxicidade aguda para o organismo aquático Daphnia similis, quando dispersos em biossurfactantes produzidos pelo microorganismo Bacillus subtilis; ii) ausência de efeito mutagênico sobre linhagens de Salmonella typhimurium (Teste de Ames); iii) desenvolvimento de um eficiente processo para tratamento de efluente contendo resíduos carbonáceos provenientes da etapa de purificação dos nanotubos; iv) efeito imunoestimulatório (adjuvante) em camundongos geneticamente selecionados e, v) capacidade de internalização celular e efeito citotóxico em astrócitos primários in vitro, via indução de morte celular programada (apoptose) / Abstract: In this work, aspects of the purification and characterization of multiwalled carbon nanotubes were studied as well as their interactions with different organization levels of biological systems. The carbon nanotubes were purified and characterized after chemical treatments with HNO3, HCl and NaOH under conventional reflux system. It was obtained nanotubes with purity > 98.5% (iron free) and without carbonaceous byproducts. A systemic approach (Ecological level > Immunological level > Cellular-molecular level) was used to represent the carbon nanotube interactions with biological systems. The main results regarding the interactions were: i) absence of acute ecotoxicity to Daphnia similis aquatic organism when the nanotubes were dispersed with biosurfactant produced by Bacillus subtilis microorganism; ii) absence of mutagenic effect to Salmonella typhimurium strains (Ames Test); iii) development of an effective process for effluent treatment containing carbonaceous byproducts originated from carbon nanotube purification process; iv) immunostimulant effect (adjuvant) in genetically selected mice; v) cellular internalization capacity and cytotocity effect on in vitro primary astrocytes by inducting programmed cell death (apoptosis) / Doutorado / Quimica Inorganica / Doutor em Ciências

O melanoma é uma neoplasia de pele invasivo, com maior taxa de morte, sem tratamento efetivo. Nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (LNC) tem sido empregadas com sucesso como carreadores de fármacos hidrofóbicos. Como o eugenol é um composto hidrofóbico com atividades antiproliferativas e pró-apoptóticas em células cancerosas, visamos avaliar os efeitos dos tratamentos com acetileugenol (AC), LNC ou LNC contendo acetileugenol (LNC-AC) em modelo de melanoma in vivo em camundongos C57B6, e a citotoxicidade dos mesmos em células endoteliais (HUVEC) e de melanoma (SK-Mel-28) in vitro. Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamentos i.p. com as LNC ou com LNC-AC (50 mg/kg, 3-10 dia de indução do tumor) induziram toxicidade sistêmica e, somente o tratamento com LNC inibiu o desenvolvimento do melanoma. O tratamento com LNC, mas não com a mistura de triglicerídeos de cadeia média, por via oral, inibiu o desenvolvimento tumoral, sem toxicidade. Adicionalmente, os tratamentos com AC, LNC ou LNC-AC não foram eficazes quando administrados em fase tardia de evolução tumoral (50 mg/kg, 7-17 dia de indução do tumor, via oral); 2) os tratamentos agudos com AC, LNC ou LNC-AC (20 mg/kg, 200 µL, e.v.) não alteraram o número de leucócitos circulantes, mas os tratamentos com LNC ou com LNC-AC reduziram o comportamento de rolling dos leucócitos em vênulas póscapilares do músculo cremaster e causaram hemólise, sendo que este último efeito também foi observado após tratamento in vitro em hemácias murinas; 3) Os estudos in vitro mostraram que as LNC e LNC-AC foram captadas pelas células HUVEC e SK-Mel-28 após 1 hora de incubação; que a incubação com LNC-AC induziu apoptose tardia e necrose com maior eficácia em SK-Mel-28 do que em HUVEC; que as incubações com LNC ou LNC-AC exerceram efeitos antiproliferativos, induzindo parada na fase G2/M do ciclo celular das duas linhagens de células avaliadas; que somente a incubação com AC ou LNC-AC inibiu a adesão ao Matrigel® com maior eficácia na linhagem SK-Mel-28 do que HUVEC; que somente a incubação com as LNC reduziram a expressão de VCAM-1 em HUVEC e que as incubações com LNC ou LNC-AC reduziram a expressão de β3 integrina em SK-Mel- 28; que nenhum dos tratamentos alterou a migração celular das HUVEC ou SK-Mel- 28; que somente a incubação com LNC-AC reduziu os níveis de espécies reativas de oxigênio em HUVEC e SK-Mel-28; que a incubação com LNC ou LNC-AC aumentou a produção de óxido nítrico (NO) pelas duas linhagens de células avaliadas; que o tratamento com L-NAME reverteu os níveis de NO e a inibição sobre a proliferação celular induzida pela incubação com LNC ou LNC-AC e; que o tratamento de células de melanoma murino com LNC ou LNC-AC parece alterar a polarizar os neutrófilos para o fenótipo N1. Associados, os resultados obtidos mostram o tratamento oral com LNC inibe o crescimento do melanoma sem induzir efeitos tóxicos, e que este efeito benéfico pode ser dependente, pelo menos em parte, da nanoencapsulação dos triglicerídios de cadeia média e da supraestrutura da formulação, com toxicidade direta sobre as células de melanoma e possível modulação do microambiente tumoral. / Melanoma is the most invasive skin cancer, with high rates of death without effective treatment. Polymeric lipid-core nanocapsules (LNC) has been successfully used as carriers of hydrophobic drugs. As eugenol is an hydrophobic compound with antiproliferative and pro-apoptotic activity in cancer cells, here we aimed to evaluate the effects of treatments with acetyleugenol (AC), LNC or LNC containing acetyleugenol (LNC-AC) in an in vivo melanoma model in C57BL6 mice and the cytotoxicity of the treatments in vitro, using endothelial (HUVEC) and melanoma (SK-Mel- 28) cells. The results obtained showed that: 1) i.p. treatments with LNC or LNCAC (50 mg/kg, 3-10 days of tumor injection) induced systemic toxicity and, only the treatment with LNC inhibited the melanoma development. Treatment with LNC, but not with mix of triglycerides of medium chain, by oral route, inhibited the tumor development, without toxicity. In addition, the treatments with AC, LNC or LNC-AC were not effective when administered in the late stage of tumor evolution (50 mg/kg, 10-20 days of tumor induction, oral route); 2) the acute treatments with AC, LNC or LNC-AC (20 mg/kg, 200 µL, intravenous route) did not altered the number of circulating leukocytes, but the treatments with LNC or LNC-AC reduced the rolling behavior of leukocytes in postcapillary venules of the cremaster muscle and induced hemolysis. The latter effect was also observed after in vitro treatment using murine erythrocytes; 3) In vitro studies showed that the LNC and LNC-AC suffered uptake by HUVEC and SK-Mel-28 cells after 1 hour of incubation; that the incubation with LNC-AC induced late apoptosis and necrosis more effectively in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that the incubation with LNC or LNC-AC presented antiproliferative effects, by inducing G2M arrest in cell cycle in both cells lines evaluated; that only the incubation with AC or LNC-AC inhibited the adhesion in Matrigel® with more efficaccy in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that only incubtion with LNC reduced the VCAM-1 expression in HUVEC and the incubation with LNC or LNC-AC reduced the β3 integrin expression in SK-Mel-28 cells; that any treatment affected the HUVEC or SK-Mel- 28 migration; that only the incubation with LNC-AC reduced the levels of reactive species of oxygen in HUVEC and SK-Mel-28 cells; that the incubation with LNC or LNC-AC increased the nitric oxide (NO) production by both cell lines used; that the treatment with L-NAME reversed the NO levels and the inhibition on cell proliferation induced by incubation with LNC or LNC-AC and; that the in vitro treatment of murine with LNC or LNC-AC altered the neutrophil polarization to N1 phenotype. Together, results obtained show that the oral treatment with LNC inhibit the melanoma growth without any toxic effect, and that the beneficial effect could be dependent, at least in part, of nanoencapsulation of medium chain triglycerides and the supraestrucuture of the formulation, with direct toxicity on melanoma cells and possible modulation of tumor microenvironment.

Submitted by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T18:19:34Z No. of bitstreams: 1 DIS_JESSICA_CAVALHEIRO_SOARES_PARCIAL.pdf: 613600 bytes, checksum: 2e577069eeb48be6afd6a79bac3f8992 (MD5) / Approved for entry into archive by Caroline Xavier (caroline.xavier@pucrs.br) on 2017-06-30T18:19:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DIS_JESSICA_CAVALHEIRO_SOARES_PARCIAL.pdf: 613600 bytes, checksum: 2e577069eeb48be6afd6a79bac3f8992 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-30T18:19:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DIS_JESSICA_CAVALHEIRO_SOARES_PARCIAL.pdf: 613600 bytes, checksum: 2e577069eeb48be6afd6a79bac3f8992 (MD5) Previous issue date: 2017-02-21 / Recent studies have shown several applications of graphene oxide (GO) in neurology in the imaging area as a contrast agent for diagnostic purposes, for drug delivery of anticarcinogenic drugs, proteins and peptides and in the field of tissue engineering for applications in the regeneration of nervous lesions. Advances in GO applications research in neurology require addressing its potential toxic mechanisms of action. Zebrafish (Danio rerio) has been widely used in neurotoxicological trials due to the homology of biochemical processes and neural structures with vertebrates. To investigate the potential neurotoxic effects of GO exposure in different concentrations at development period, we evaluated in vivo parameters for initial toxicological screening. We found that GO did not induce changes in survival, hatching and spontaneous movement. However, an increase in heart rate at 48 hpf was found and a reduction in body length without altering the ocular area at 5 dpf. Additionally, molecular gene expression analyses of nervous system-related proteins were performed, showing synapsin IIa expression is increased and dopamine transporter (dat) gene expression is reduced, suggesting a potential compensatory mechanism. The evaluation of the locomotion behavior of animals exposed at GO showed an increase in the absolute turn angle. Based on these initial parameters, we performed biochemical analyzes to determination of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) activity and dopamine levels. The exposure at GO did not change AChE activity and decreased dopamine levels. Additionally, the gene expression of B cell lymphoma 2 (bcl2) gene and caspase 3 (casp3) gene were evaluated for the group of larvae exposed to GO, demonstrating an increase of bcl2 and unchanged casp3 expression, suggesting no apoptosis involvement. The tissue and cellular structure of zebrafish larvae brain exposed at GO was evaluated by transmission electron microscopy (TEM) and cell dead by autophagosome formation with loss of cellular architecture was observed most likely due to exposure to the nanomaterial. Further studies are necessary to the complete understanding of the neurological changes observed in zebrafish by exposure to GO and the mechanisms involved in this process, are necessary. / Estudos recentes t?m mostrado diversas aplica??es do ?xido de grafeno (GO) como agente de contraste para fins de diagn?stico, para o endere?amento de drogas (do ingl?s drug delivery) de f?rmacos anticarcinog?nicos, prote?nas e pept?deos e na ?rea de engenharia tecidual para aplica??es na regenera??o de les?es nervosas. O avan?o em pesquisas relacionadas a aplica??es do GO em neurologia exige a investiga??o dos mecanismos de a??o potencialmente t?xicos desencadeados pela exposi??o ao nanomaterial. O zebrafish (Danio rerio) tem sido amplamente utilizado em ensaios neurotoxicol?gicos devido ? homologia de processos bioqu?micos e estruturas neurais com outros vertebrados, vis?veis desde o in?cio de seu desenvolvimento externo. Para investigar os efeitos neurot?xicos da exposi??o a diferentes concentra??es do GO no per?odo de desenvolvimento, foram avaliados diversos par?metros in vivo para avalia??o toxicol?gica preliminar. Foi verificado que o GO n?o induziu altera??es na sobreviv?ncia, eclos?o e movimentos espont?neos. Contudo, o aumento dos batimentos card?acos em 48 hpf foi constatado e redu??o do tamanho do eixo axial, sem altera??o na ?rea ocular em 5 dpf. Adicionalmente, an?lises moleculares da express?o de genes espec?ficos para prote?nas do sistema nervoso foram realizadas mostrando que o GO aumenta a express?o de sinapsina IIa e reduz a express?o do transportador de dopamina (dat), sugerindo um prov?vel mecanismo compensat?rio. A avalia??o da locomo??o dos animais expostos ao GO mostra o aumento do ?ngulo absoluto de virada. Com base nestes par?metros iniciais, foram realizadas an?lises bioqu?micas para a determina??o da atividade da enzima acetilcolinesterase (AChE) e dosagem dos n?veis de dopamina. A exposi??o ao GO n?o alterou a atividade da AChE e reduziu os n?veis de dopamina. Adicionalmente, a express?o do gene de linfoma de c?lulas B2 (do ingl?s B cell lymphoma 2 (bcl2) ) e do gene que codifica para caspase 3 (casp3) foram avaliadas para o grupo de larvas expostas ao GO onde foi mostrado aumento da express?o de bcl2, enquanto que a express?o de casp3 permaneceu inalterada, sugerindo que o GO parece n?o induzir mecanismo de apoptose. A estrutura tecidual e celular do c?rebro de larvas de zebrafish expostas ao GO foi avaliada por microscopia eletr?nica de transmiss?o (TEM) onde morte celular por necrose com perda da arquitetura celular foi constatada. Estudos adicionais para o completo entendimento das altera??es neurol?gicas observadas pela exposi??o ao GO e dos mecanismos envolvidos nesse processo s?o necess?rios.

Nanopartículas poliméricas biodegradáveis têm recebido atenção como carreadores de fármacos ao longo dos últimos anos. Em muitos casos, a segurança destes nanocarreadores não foi demonstrada e pouco se sabe sobre a relação entre as suas características físico-químicas e suas propriedades toxicocinéticas e toxicodinâmicas. A nanotoxicologia está emergindo como uma especialidade importante da nanotecnologia e/ou toxicologia, e refere-se ao estudo da interação de nanoestruturas com sistemas biológicos. Nos últimos anos, a maioria das pesquisas foi centrada em estudos in vitro, entretanto, os resultados destes estudos necessitam também ser avaliados em experimentos in vivo para o avanço na utilização de nanocarreadores na área biomédica. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC), de poli(-caprolactona), após administração intraperitoneal (i.p.) e intradérmica (i.d.) em ratos Wistar. Para a avaliação toxicológica aguda, foi administrada dose única em que se observaram sinais clínicos e fisiológicos, em ambas as vias. Após 14 dias, os animais foram eutanasiados e análises macroscópicas e histopatológicas foram realizadas. Além disso, sangue e urina foram coletados para análises laboratoriais e avaliação de funções teciduais. A avaliação toxicológica subcrônica foi procedida da mesma forma, exceto pela administração de doses repetidas diárias durante 28 dias. As suspensões de nanocápsulas foram preparadas pelo método de precipitação do polímero pré-formado, as quais apresentaram tamanho médio de partícula inferior a 250 nm, índice de polidispersão (IPD) < 1, potencial zeta negativo e pH em torno de 6,7. Os animais tratados pela via i.p. (n=6/grupo) receberam para avaliação da toxicidade aguda: solução salina ou polissorbato 80 (PS80) (12 ml/kg), utilizados como controles e diferentes doses de LNC (18,03, 36,06, e 72,12 × 1012 LNC/kg); no teste de toxicidade subcrônica foram utilizados os mesmos controles porém com doses de 3mL/kg e 6,01, 12,02 ou 18,03 × 1012 LNC/kg. Nos testes de toxicidade aguda, nos animais administrados pela via i.p., foi observada diminuição significativa de peso nos grupos tratados com LNC mesmo após 14 dias da administração (p<0,05). Entretanto no teste subcrônico esta alteração foi transitória, e ocorreu apenas no grupo que recebeu a maior dose até o quinto dia de administração (p<0,05). Houve aumento no peso relativo do baço nos animais que receberam a dose mais alta de LNC (p<0,05) no tratamento agudo. A análise histopatológica em ambos os tratamentos, demonstrou a presença de um granuloma de tipo corpo estranho no fígado e no baço dos animais que receberam a dose mais alta, provavelmente devido ao volume de LNC administrado. Não houve alteração nas análises bioquímicas de dano hepático, renal, dentre outros em todos os grupos tratados. Os dados hematológicos apresentaram uma leve alteração, entretanto foi demonstrada interferência metodológica, evidenciada por testes preliminares in vitro. Além disso, foram avaliados biomarcadores do estresse oxidativo (EO), marcadores inflamatórios e de genotoxicidade. Os resultados dos biomarcadores de oxidação de proteínas e lipídios não foram suficientes para iniciar um processo oxidativo, visto que não houve peroxidação lipídica. Ainda, não houve depleção de antioxidantes, dano ao DNA ou alteração nos marcadores inflamatórios. Nos ratos tratados pela via i.d., foi utilizada solução salina 1,2 ml/kg como grupo controle e uma dose de 7,2 × 1012 LNC/kg de LNC, para um estudo preliminar agudo e solução salina ou PS 80 (0,9ml/kg) e três doses de LNC (1,8, 3,6 ou 5,4 × 1012 LNC/kg) para avaliação da toxicidade subcrônica. No teste de toxicidade aguda, não houve alteração do peso corpóreo, entretanto no teste de toxicidade subcrônica houve uma diminuição reversível do peso no grupo que recebeu PS80 (p<0,05). Os dados histopatológicos não apresentaram alteração. Não houve alteração nos parâmetros bioquímicos, exceto uma leve diminuição da atividade da butirilcolinesterase no grupo que recebeu a dose mais alta (p<0,05). Por outro lado, houve aumento nos leucócitos no grupo que recebeu LNC, no teste de toxicidade aguda e nos grupos que receberam PS 80 e 5,4 × 1012 LNC/kg (p<0,05) após doses repetidas. Em relação à avaliação sanguínea e tecidual dos biomarcadores do EO e dos marcadores inflamatórios, foi observada uma indução nos marcadores de oxidação de proteínas juntamente com uma indução enzimática nos ratos que receberam a dose mais alta, além de uma diminuição dos níveis do IL-10 nos grupos que receberam PS80 e a dose mais alta (p<0.05). Pode-se concluir que nas condições dos experimentos, tanto pela via i.p. quanto pela via i.d., não foram demonstrados danos teciduais, pois os achados laboratoriais foram condizentes com os achados histopatológicos. Além disso, os mecanismos de reparo foram suficientes para contrabalançar eventuais danos oxidativos ou inflamatórios. Assim, o presente trabalho contribui para futuras avaliações toxicológicas de nanocápsulas poliméricas, visto que foram realizadas avaliações agudas e subcrônicas sistemáticas, com marcadores de dano renal precoce e possíveis mecanismos de toxicidade envolvidos após administração por ambas as vias. O aumento na utilização destas nanocápsulas e as lacunas nas informações toxicológicas fazem com que desafios importantes devam ser superados para permitir sua incorporação segura. Com isso, estudos nesta linha podem embasar a avaliação da resposta tóxica e, consequentemente, levar ao estabelecimento de regulamentações para avaliação da toxicidade da maioria das nanopartículas poliméricas biodegradáveis utilizadas como carreadoras de fármacos. / Biodegradable polymeric nanoparticles have received attention as drug carriers over the past years. In many cases, the safety of nanocarriers has not been demonstrated and little is known about the relationship of its physicochemical characteristics and their toxicokinetic and toxicodynamic properties. Nanotoxicology is emerging as an important field of nanotechnology and toxicology, and refers to the study of the interaction of nanostructures with biological systems. In recent years, most research has focused on in vitro studies; however, the results of these studies should also be evaluated trough in vivo experiments, in order to advance in biomedical application of nanocarriers. Thus, the objective of this study was to evaluate the toxicity of lipid-core nanocapsules (LNC), prepared with poly(ɛ-caprolactone), after intraperitoneal (i.p.) and intradermal (i.d.) administration in rats. For acute toxicological evaluation, it was administered a single dose, i.p. and i.d., clinical signs and physiological effects were observed. After 14 days, animals were euthanized and macroscopic and histopathological analyses were done. In addition, blood and urine were collected for laboratory analysis and evaluation of tissue functions. Subchronic toxicological evaluation was similar, except for the administration of repeated doses for 28 days. The suspension of nanocapsules were prepared by interfacial deposition of polymer, which had particle size less than 250 nm, polydispersity index (IPD) <1, negative zeta potential and pH around 6.7. Animals were treated via i.p. (N = 6/group), the doses used for acute toxicity test were: saline or polysorbate 80 (PS80) (12 ml/kg) as controls or three different doses of LNC (18.03, 36.06, e 72.12 × 1012 LNC/kg); for subchronic toxicity test, same controls were used but the doses were 3 ml/kg and 6.01, 12.02 ou 18.03 × 1012 LNC/kg administered daily for 28 days. In acute toxicity test, with i.p. administration, groups treated with LNC presented a significant reduction in relative weight even after 14 days of administration (p<0.05); however in the subchronic test, this change was transient, and occurred only in the group receiving the highest dose until the fifth day of administration (p<0.05). There was an increase in relative weight of spleen in animals that received the highest dose of LNC (p<0.05) in acute treatment. Histopathological analysis in both the treatments, showed a granulomatous foreign body reaction in liver and spleen of animals receiving the highest dose, probably because the volume of LNC administered. There were no changes in biochemical parameters of liver or kidney damage, among all treated groups. Hematological data showed a slight change; however it was demonstrated an interference of the methodology, further evidenced by preliminary in vitro tests. Furthermore, we evaluated biomarkers of oxidative stress (OS), inflammatory and genotoxicity markers. The results of the oxidation of proteins and lipids biomarker were not sufficient to initiate an oxidative process, since no lipid peroxidation occurred. Still, no depletion of antioxidants, DNA damage or change in inflammatory markers was observed. In rats treated via i.d., saline was used as control (1.2 ml/kg) and a dose of 7.2 × 1012 LNC/kg of LNC to a preliminary acute study, and saline or PS 80 (0.9ml/kg) used as controls or three doses of LNC (1.8, 3.6 ou 5.4 × 1012 LNC/kg) for subchronic toxicity evaluation. In acute toxicity test, there was no change in relative body weight, however, a decreased was found for the group receiving PS 80 in subchronic test (p <0.05). No histopathological alteration was found. Also, there was no change in biochemical parameters, except a slight decrease of butyrylcholinesterase activity in the group receiving the highest dose (p<0.05). Moreover, in acute toxicity test, it was found an increase in white blood cells in group receiving LNC; these increasing also occurred after repeate dose test, in PS 80 and 5.4 × 1012 LNC/kg of LNC groups (p <0.05). Regarding blood and tissue biomarkers of OS and inflammatory markers, an induction in protein oxidation marker along with antioxidant induction in rats which received the highest dose were observed, also reduced levels of IL-10 in rats that received the higher dose and PS80 (p <0.05). It can be concluded that, under the experimental conditions, for i.p. and i.d. administration, tissue damage was not found, since laboratorial analysis results were consistent with histopathological findings. Furthermore, mechanisms of repair were sufficient to offset oxidative damage or inflammation.Thus, this study contributes to future toxicological evaluations of polymeric nanocapsules, since a systematic acute and subchronic evaluation with early renal damage markers and possible mechanisms of toxicity involved after ip and id routes were performed. The increase in the use of these nanocapsules and the gaps in toxicological information make important to overcome these challenges in order to allow its safe incorporation. Thus, studies in this line are important to evaluate toxic response, and lead to establishing rules for evaluating the toxicity of most biodegradable polymer nanoparticles used as carrier of drugs.

De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) estimam-se que os agrotóxicos causam anualmente 70 mil intoxicações agudas e crônicas que evoluem para óbito. Dentre eles, o paraquat (PQ) é o que apresenta maior taxa de mortalidade, sendo responsável por cerca de 13% de todos os casos registrados, principalmente devido a falta de um tratamento efetivo. O principal mecanismo de toxicidade proposto está associado ao ciclo redox do PQ, onde ocorre a formação de espécies reativas (ERs) de oxigênio e nitrogênio, levando ao estresse oxidativo (EO). Na literatura há relatos do uso de antioxidantes para casos de intoxicação do PQ. Dessa maneira, nesse trabalho avaliou-se o uso de melatonina associada a nanocápsulas de núcleo lipídico (Mel-LNC) na proteção contra os danos causados pelo PQ, uma vez que o uso da nanotecnologia melhorou a atividade antioxidante dessa molécula. Para tal utilizou-se o sistema in vitro, linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar (A549), e o modelo alternativo in vivo, Caenorhabditis elegans. Mel-LNC e nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) foram preparadas de acordo com o método de deposição do polímero pré-formado. Ambas as formulações foram caracterizadas avaliando tamanho de partícula, potencial zeta e pH, e para Mel-LNC foram determinadas a concentração de melatonina e porcentagem de encapsulação. Os resultados encontrados estão de acordo com os parâmetros já validados para essas formulações. Foi possível verificar que as formulações MEL-LNC e LNC se mantiveram estáveis nos meios de cultura utilizados nos ensaios in vitro e in vivo. No estudo in vitro foi observado que o tratamento com ambas as formulações não causaram diminuição da viabilidade nem dano de DNA na linhagem celular utilizada. Além disso, foi verificado a internalização da Mel-LNC utilizando-se a formulação marcada com rodamina B, sendo possível verificar uma intensa fluorescência vermelha ao redor do núcleo da célula. O pré-tratamento com Mel-LNC foi capaz de aumentar a viabilidade celular e diminuir o dano oxidativo de DNA causado pelo paraquat após 24 horas de exposição, porém isso não ocorreu quando as células foram pré-tratadas com melatonina livre. No estudo com o modelo alternativo C. elegans, foi utilizada uma formulação de Mel-LNC marcada com rodamina B (Mel-LNC-RoB), a fim de verificar a absorção dessa formulação pelo nematoide. Foi possível observar que a internalização da Mel-LNC no C. elegans ocorre principalmente pela via oral, uma vez que se verificou uma intensa fluorescência no intestino do nematoide após o tratamento com a Mel-LNC-RoB e após três horas, essa fluorescência se distribuiu pelo restante do corpo, apresentando inúmeros pontos de fluorescência fora do intestino. Com relação à avaliação do efeito protetor nesse modelo alternativo in vivo, pode-se inferir que o pré-tratamento com Mel-LNC aumentou a sobrevida, diminuiu a produção de espécies reativas (ERs) e manteve o desenvolvimento normal dos nematoides após a exposição ao PQ, sendo que isso não foi verificado quando os mesmos foram pré-tratados com melatonina livre. Além disso, verificou-se que as nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) são seguras para o uso no modelo C. elegans, uma vez que apresentou alto valor para a dose letal 50 (DL50), e alterações no desenvolvimento e produção de ERs somente ocorreram em doses mais elevadas que as utilizadas em nossos experimentos. Dessa maneira, a formulação de Mel-LNC mostrou-se um promissor candidato para estudos futuros nos casos de intoxicação por paraquat. / According to estimations by World Health Organization (WHO), pesticides are responsible for 70 thousand acute intoxication cases that lead to death per year. Among these compounds, paraquat (PQ) presents the highest mortality rate, about 13% of all registered cases, especially for the lack of effective treatment. The major mechanism of toxicity proposed is associated to its redox cycle, in which oxygen and nitrogen reactive species (RS) are generated culminating in oxidative stress (OS). Some reports in the literature support the use of antioxidants for PQ intoxication cases. The present study aimed to evaluate the use of melatonin-loaded lipid-core nanocapsules (Mel-LNC) in the protection against PQ-induced damages, considering that nanotechnology has improved the antioxidant activity of this molecule. For this purpose, an in vitro system composed by lung adenocarcinoma (A549) cell line, and the in vivo alternative model of Caenorhabditis elegans have been utilized. Mel-LNC and unloaded lipid-core nanocapsules were prepared by self-assembly and characterized by particle sizing, zeta potential and pH, and for Mel-LNC formulation it was determined the drug content and encapsulation efficiency. The results are in agreement with the parameters already validated for these formulations. It was possible verify that Mel-LNC and LNC formulations remained stable in the culture medium utilized in in vitro and in vivo experiments. Results from in vitro studies showed that none of the formulations induced reduction in cell viability or DNA damage in treated cells. Besides, it was observed the internalization of Mel-LNC marked with rhodamine B, showing an intense red fluorescence around the cell nucleus. Pretreatment with Mel-LNC was able to enhance cell viability and diminish DNA oxidative damage caused by paraquat after 24h exposure, which could not be observed when cells were pretreated with Mel. In the study with the alternative model C. elegans, a rhodamine (Ro)-linked Mel-LNC formulation was prepared in order to assess the absorption of the formulation by the nematode. Mel-LNC uptake in C. elegans was found to occur mainly by the oral route, once an intense fluorescence was observed in the intestine after treatment with Mel-LNC-RoB, which after 3h distributed to the rest of the body, presenting numerous fluorescence dots outside the intestine. In relation to the evaluation of protection with the in vivo alternative model, results indicate that pretreatment with Mel-LNC increased survival rate, reduced the production of reactive species and maintained the normal development of nematodes after paraquat exposure, while the same observations were not found after pretreatment with free melatonin. In addition, the lipid-core nanocapsules (LNC) were found to be safe in the C. elegans model, due to its high lethal dose (LD50) value, and development alterations and RS production only occurred in the higher doses than those utilized in our experiments. Therefore, the Mel-LNC formulation demonstrated to be a promising candidate for future studies aiming treatment of paraquat intoxication cases.

O melanoma é uma neoplasia de pele invasivo, com maior taxa de morte, sem tratamento efetivo. Nanocápsulas poliméricas de núcleo lipídico (LNC) tem sido empregadas com sucesso como carreadores de fármacos hidrofóbicos. Como o eugenol é um composto hidrofóbico com atividades antiproliferativas e pró-apoptóticas em células cancerosas, visamos avaliar os efeitos dos tratamentos com acetileugenol (AC), LNC ou LNC contendo acetileugenol (LNC-AC) em modelo de melanoma in vivo em camundongos C57B6, e a citotoxicidade dos mesmos em células endoteliais (HUVEC) e de melanoma (SK-Mel-28) in vitro. Os resultados obtidos mostraram que: 1) tratamentos i.p. com as LNC ou com LNC-AC (50 mg/kg, 3-10 dia de indução do tumor) induziram toxicidade sistêmica e, somente o tratamento com LNC inibiu o desenvolvimento do melanoma. O tratamento com LNC, mas não com a mistura de triglicerídeos de cadeia média, por via oral, inibiu o desenvolvimento tumoral, sem toxicidade. Adicionalmente, os tratamentos com AC, LNC ou LNC-AC não foram eficazes quando administrados em fase tardia de evolução tumoral (50 mg/kg, 7-17 dia de indução do tumor, via oral); 2) os tratamentos agudos com AC, LNC ou LNC-AC (20 mg/kg, 200 &#181;L, e.v.) não alteraram o número de leucócitos circulantes, mas os tratamentos com LNC ou com LNC-AC reduziram o comportamento de rolling dos leucócitos em vênulas póscapilares do músculo cremaster e causaram hemólise, sendo que este último efeito também foi observado após tratamento in vitro em hemácias murinas; 3) Os estudos in vitro mostraram que as LNC e LNC-AC foram captadas pelas células HUVEC e SK-Mel-28 após 1 hora de incubação; que a incubação com LNC-AC induziu apoptose tardia e necrose com maior eficácia em SK-Mel-28 do que em HUVEC; que as incubações com LNC ou LNC-AC exerceram efeitos antiproliferativos, induzindo parada na fase G2/M do ciclo celular das duas linhagens de células avaliadas; que somente a incubação com AC ou LNC-AC inibiu a adesão ao Matrigel® com maior eficácia na linhagem SK-Mel-28 do que HUVEC; que somente a incubação com as LNC reduziram a expressão de VCAM-1 em HUVEC e que as incubações com LNC ou LNC-AC reduziram a expressão de &#946;3 integrina em SK-Mel- 28; que nenhum dos tratamentos alterou a migração celular das HUVEC ou SK-Mel- 28; que somente a incubação com LNC-AC reduziu os níveis de espécies reativas de oxigênio em HUVEC e SK-Mel-28; que a incubação com LNC ou LNC-AC aumentou a produção de óxido nítrico (NO) pelas duas linhagens de células avaliadas; que o tratamento com L-NAME reverteu os níveis de NO e a inibição sobre a proliferação celular induzida pela incubação com LNC ou LNC-AC e; que o tratamento de células de melanoma murino com LNC ou LNC-AC parece alterar a polarizar os neutrófilos para o fenótipo N1. Associados, os resultados obtidos mostram o tratamento oral com LNC inibe o crescimento do melanoma sem induzir efeitos tóxicos, e que este efeito benéfico pode ser dependente, pelo menos em parte, da nanoencapsulação dos triglicerídios de cadeia média e da supraestrutura da formulação, com toxicidade direta sobre as células de melanoma e possível modulação do microambiente tumoral. / Melanoma is the most invasive skin cancer, with high rates of death without effective treatment. Polymeric lipid-core nanocapsules (LNC) has been successfully used as carriers of hydrophobic drugs. As eugenol is an hydrophobic compound with antiproliferative and pro-apoptotic activity in cancer cells, here we aimed to evaluate the effects of treatments with acetyleugenol (AC), LNC or LNC containing acetyleugenol (LNC-AC) in an in vivo melanoma model in C57BL6 mice and the cytotoxicity of the treatments in vitro, using endothelial (HUVEC) and melanoma (SK-Mel- 28) cells. The results obtained showed that: 1) i.p. treatments with LNC or LNCAC (50 mg/kg, 3-10 days of tumor injection) induced systemic toxicity and, only the treatment with LNC inhibited the melanoma development. Treatment with LNC, but not with mix of triglycerides of medium chain, by oral route, inhibited the tumor development, without toxicity. In addition, the treatments with AC, LNC or LNC-AC were not effective when administered in the late stage of tumor evolution (50 mg/kg, 10-20 days of tumor induction, oral route); 2) the acute treatments with AC, LNC or LNC-AC (20 mg/kg, 200 &#181;L, intravenous route) did not altered the number of circulating leukocytes, but the treatments with LNC or LNC-AC reduced the rolling behavior of leukocytes in postcapillary venules of the cremaster muscle and induced hemolysis. The latter effect was also observed after in vitro treatment using murine erythrocytes; 3) In vitro studies showed that the LNC and LNC-AC suffered uptake by HUVEC and SK-Mel-28 cells after 1 hour of incubation; that the incubation with LNC-AC induced late apoptosis and necrosis more effectively in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that the incubation with LNC or LNC-AC presented antiproliferative effects, by inducing G2M arrest in cell cycle in both cells lines evaluated; that only the incubation with AC or LNC-AC inhibited the adhesion in Matrigel® with more efficaccy in SK-Mel-28 than in HUVEC cells; that only incubtion with LNC reduced the VCAM-1 expression in HUVEC and the incubation with LNC or LNC-AC reduced the &#946;3 integrin expression in SK-Mel-28 cells; that any treatment affected the HUVEC or SK-Mel- 28 migration; that only the incubation with LNC-AC reduced the levels of reactive species of oxygen in HUVEC and SK-Mel-28 cells; that the incubation with LNC or LNC-AC increased the nitric oxide (NO) production by both cell lines used; that the treatment with L-NAME reversed the NO levels and the inhibition on cell proliferation induced by incubation with LNC or LNC-AC and; that the in vitro treatment of murine with LNC or LNC-AC altered the neutrophil polarization to N1 phenotype. Together, results obtained show that the oral treatment with LNC inhibit the melanoma growth without any toxic effect, and that the beneficial effect could be dependent, at least in part, of nanoencapsulation of medium chain triglycerides and the supraestrucuture of the formulation, with direct toxicity on melanoma cells and possible modulation of tumor microenvironment.

Nanopartículas poliméricas biodegradáveis têm recebido atenção como carreadores de fármacos ao longo dos últimos anos. Em muitos casos, a segurança destes nanocarreadores não foi demonstrada e pouco se sabe sobre a relação entre as suas características físico-químicas e suas propriedades toxicocinéticas e toxicodinâmicas. A nanotoxicologia está emergindo como uma especialidade importante da nanotecnologia e/ou toxicologia, e refere-se ao estudo da interação de nanoestruturas com sistemas biológicos. Nos últimos anos, a maioria das pesquisas foi centrada em estudos in vitro, entretanto, os resultados destes estudos necessitam também ser avaliados em experimentos in vivo para o avanço na utilização de nanocarreadores na área biomédica. Com isso, o objetivo deste trabalho foi avaliar a toxicidade de nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC), de poli(-caprolactona), após administração intraperitoneal (i.p.) e intradérmica (i.d.) em ratos Wistar. Para a avaliação toxicológica aguda, foi administrada dose única em que se observaram sinais clínicos e fisiológicos, em ambas as vias. Após 14 dias, os animais foram eutanasiados e análises macroscópicas e histopatológicas foram realizadas. Além disso, sangue e urina foram coletados para análises laboratoriais e avaliação de funções teciduais. A avaliação toxicológica subcrônica foi procedida da mesma forma, exceto pela administração de doses repetidas diárias durante 28 dias. As suspensões de nanocápsulas foram preparadas pelo método de precipitação do polímero pré-formado, as quais apresentaram tamanho médio de partícula inferior a 250 nm, índice de polidispersão (IPD) < 1, potencial zeta negativo e pH em torno de 6,7. Os animais tratados pela via i.p. (n=6/grupo) receberam para avaliação da toxicidade aguda: solução salina ou polissorbato 80 (PS80) (12 ml/kg), utilizados como controles e diferentes doses de LNC (18,03, 36,06, e 72,12 × 1012 LNC/kg); no teste de toxicidade subcrônica foram utilizados os mesmos controles porém com doses de 3mL/kg e 6,01, 12,02 ou 18,03 × 1012 LNC/kg. Nos testes de toxicidade aguda, nos animais administrados pela via i.p., foi observada diminuição significativa de peso nos grupos tratados com LNC mesmo após 14 dias da administração (p<0,05). Entretanto no teste subcrônico esta alteração foi transitória, e ocorreu apenas no grupo que recebeu a maior dose até o quinto dia de administração (p<0,05). Houve aumento no peso relativo do baço nos animais que receberam a dose mais alta de LNC (p<0,05) no tratamento agudo. A análise histopatológica em ambos os tratamentos, demonstrou a presença de um granuloma de tipo corpo estranho no fígado e no baço dos animais que receberam a dose mais alta, provavelmente devido ao volume de LNC administrado. Não houve alteração nas análises bioquímicas de dano hepático, renal, dentre outros em todos os grupos tratados. Os dados hematológicos apresentaram uma leve alteração, entretanto foi demonstrada interferência metodológica, evidenciada por testes preliminares in vitro. Além disso, foram avaliados biomarcadores do estresse oxidativo (EO), marcadores inflamatórios e de genotoxicidade. Os resultados dos biomarcadores de oxidação de proteínas e lipídios não foram suficientes para iniciar um processo oxidativo, visto que não houve peroxidação lipídica. Ainda, não houve depleção de antioxidantes, dano ao DNA ou alteração nos marcadores inflamatórios. Nos ratos tratados pela via i.d., foi utilizada solução salina 1,2 ml/kg como grupo controle e uma dose de 7,2 × 1012 LNC/kg de LNC, para um estudo preliminar agudo e solução salina ou PS 80 (0,9ml/kg) e três doses de LNC (1,8, 3,6 ou 5,4 × 1012 LNC/kg) para avaliação da toxicidade subcrônica. No teste de toxicidade aguda, não houve alteração do peso corpóreo, entretanto no teste de toxicidade subcrônica houve uma diminuição reversível do peso no grupo que recebeu PS80 (p<0,05). Os dados histopatológicos não apresentaram alteração. Não houve alteração nos parâmetros bioquímicos, exceto uma leve diminuição da atividade da butirilcolinesterase no grupo que recebeu a dose mais alta (p<0,05). Por outro lado, houve aumento nos leucócitos no grupo que recebeu LNC, no teste de toxicidade aguda e nos grupos que receberam PS 80 e 5,4 × 1012 LNC/kg (p<0,05) após doses repetidas. Em relação à avaliação sanguínea e tecidual dos biomarcadores do EO e dos marcadores inflamatórios, foi observada uma indução nos marcadores de oxidação de proteínas juntamente com uma indução enzimática nos ratos que receberam a dose mais alta, além de uma diminuição dos níveis do IL-10 nos grupos que receberam PS80 e a dose mais alta (p<0.05). Pode-se concluir que nas condições dos experimentos, tanto pela via i.p. quanto pela via i.d., não foram demonstrados danos teciduais, pois os achados laboratoriais foram condizentes com os achados histopatológicos. Além disso, os mecanismos de reparo foram suficientes para contrabalançar eventuais danos oxidativos ou inflamatórios. Assim, o presente trabalho contribui para futuras avaliações toxicológicas de nanocápsulas poliméricas, visto que foram realizadas avaliações agudas e subcrônicas sistemáticas, com marcadores de dano renal precoce e possíveis mecanismos de toxicidade envolvidos após administração por ambas as vias. O aumento na utilização destas nanocápsulas e as lacunas nas informações toxicológicas fazem com que desafios importantes devam ser superados para permitir sua incorporação segura. Com isso, estudos nesta linha podem embasar a avaliação da resposta tóxica e, consequentemente, levar ao estabelecimento de regulamentações para avaliação da toxicidade da maioria das nanopartículas poliméricas biodegradáveis utilizadas como carreadoras de fármacos. / Biodegradable polymeric nanoparticles have received attention as drug carriers over the past years. In many cases, the safety of nanocarriers has not been demonstrated and little is known about the relationship of its physicochemical characteristics and their toxicokinetic and toxicodynamic properties. Nanotoxicology is emerging as an important field of nanotechnology and toxicology, and refers to the study of the interaction of nanostructures with biological systems. In recent years, most research has focused on in vitro studies; however, the results of these studies should also be evaluated trough in vivo experiments, in order to advance in biomedical application of nanocarriers. Thus, the objective of this study was to evaluate the toxicity of lipid-core nanocapsules (LNC), prepared with poly(ɛ-caprolactone), after intraperitoneal (i.p.) and intradermal (i.d.) administration in rats. For acute toxicological evaluation, it was administered a single dose, i.p. and i.d., clinical signs and physiological effects were observed. After 14 days, animals were euthanized and macroscopic and histopathological analyses were done. In addition, blood and urine were collected for laboratory analysis and evaluation of tissue functions. Subchronic toxicological evaluation was similar, except for the administration of repeated doses for 28 days. The suspension of nanocapsules were prepared by interfacial deposition of polymer, which had particle size less than 250 nm, polydispersity index (IPD) <1, negative zeta potential and pH around 6.7. Animals were treated via i.p. (N = 6/group), the doses used for acute toxicity test were: saline or polysorbate 80 (PS80) (12 ml/kg) as controls or three different doses of LNC (18.03, 36.06, e 72.12 × 1012 LNC/kg); for subchronic toxicity test, same controls were used but the doses were 3 ml/kg and 6.01, 12.02 ou 18.03 × 1012 LNC/kg administered daily for 28 days. In acute toxicity test, with i.p. administration, groups treated with LNC presented a significant reduction in relative weight even after 14 days of administration (p<0.05); however in the subchronic test, this change was transient, and occurred only in the group receiving the highest dose until the fifth day of administration (p<0.05). There was an increase in relative weight of spleen in animals that received the highest dose of LNC (p<0.05) in acute treatment. Histopathological analysis in both the treatments, showed a granulomatous foreign body reaction in liver and spleen of animals receiving the highest dose, probably because the volume of LNC administered. There were no changes in biochemical parameters of liver or kidney damage, among all treated groups. Hematological data showed a slight change; however it was demonstrated an interference of the methodology, further evidenced by preliminary in vitro tests. Furthermore, we evaluated biomarkers of oxidative stress (OS), inflammatory and genotoxicity markers. The results of the oxidation of proteins and lipids biomarker were not sufficient to initiate an oxidative process, since no lipid peroxidation occurred. Still, no depletion of antioxidants, DNA damage or change in inflammatory markers was observed. In rats treated via i.d., saline was used as control (1.2 ml/kg) and a dose of 7.2 × 1012 LNC/kg of LNC to a preliminary acute study, and saline or PS 80 (0.9ml/kg) used as controls or three doses of LNC (1.8, 3.6 ou 5.4 × 1012 LNC/kg) for subchronic toxicity evaluation. In acute toxicity test, there was no change in relative body weight, however, a decreased was found for the group receiving PS 80 in subchronic test (p <0.05). No histopathological alteration was found. Also, there was no change in biochemical parameters, except a slight decrease of butyrylcholinesterase activity in the group receiving the highest dose (p<0.05). Moreover, in acute toxicity test, it was found an increase in white blood cells in group receiving LNC; these increasing also occurred after repeate dose test, in PS 80 and 5.4 × 1012 LNC/kg of LNC groups (p <0.05). Regarding blood and tissue biomarkers of OS and inflammatory markers, an induction in protein oxidation marker along with antioxidant induction in rats which received the highest dose were observed, also reduced levels of IL-10 in rats that received the higher dose and PS80 (p <0.05). It can be concluded that, under the experimental conditions, for i.p. and i.d. administration, tissue damage was not found, since laboratorial analysis results were consistent with histopathological findings. Furthermore, mechanisms of repair were sufficient to offset oxidative damage or inflammation.Thus, this study contributes to future toxicological evaluations of polymeric nanocapsules, since a systematic acute and subchronic evaluation with early renal damage markers and possible mechanisms of toxicity involved after ip and id routes were performed. The increase in the use of these nanocapsules and the gaps in toxicological information make important to overcome these challenges in order to allow its safe incorporation. Thus, studies in this line are important to evaluate toxic response, and lead to establishing rules for evaluating the toxicity of most biodegradable polymer nanoparticles used as carrier of drugs.

De acordo com dados da Organização Mundial da Saúde (OMS) estimam-se que os agrotóxicos causam anualmente 70 mil intoxicações agudas e crônicas que evoluem para óbito. Dentre eles, o paraquat (PQ) é o que apresenta maior taxa de mortalidade, sendo responsável por cerca de 13% de todos os casos registrados, principalmente devido a falta de um tratamento efetivo. O principal mecanismo de toxicidade proposto está associado ao ciclo redox do PQ, onde ocorre a formação de espécies reativas (ERs) de oxigênio e nitrogênio, levando ao estresse oxidativo (EO). Na literatura há relatos do uso de antioxidantes para casos de intoxicação do PQ. Dessa maneira, nesse trabalho avaliou-se o uso de melatonina associada a nanocápsulas de núcleo lipídico (Mel-LNC) na proteção contra os danos causados pelo PQ, uma vez que o uso da nanotecnologia melhorou a atividade antioxidante dessa molécula. Para tal utilizou-se o sistema in vitro, linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar (A549), e o modelo alternativo in vivo, Caenorhabditis elegans. Mel-LNC e nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) foram preparadas de acordo com o método de deposição do polímero pré-formado. Ambas as formulações foram caracterizadas avaliando tamanho de partícula, potencial zeta e pH, e para Mel-LNC foram determinadas a concentração de melatonina e porcentagem de encapsulação. Os resultados encontrados estão de acordo com os parâmetros já validados para essas formulações. Foi possível verificar que as formulações MEL-LNC e LNC se mantiveram estáveis nos meios de cultura utilizados nos ensaios in vitro e in vivo. No estudo in vitro foi observado que o tratamento com ambas as formulações não causaram diminuição da viabilidade nem dano de DNA na linhagem celular utilizada. Além disso, foi verificado a internalização da Mel-LNC utilizando-se a formulação marcada com rodamina B, sendo possível verificar uma intensa fluorescência vermelha ao redor do núcleo da célula. O pré-tratamento com Mel-LNC foi capaz de aumentar a viabilidade celular e diminuir o dano oxidativo de DNA causado pelo paraquat após 24 horas de exposição, porém isso não ocorreu quando as células foram pré-tratadas com melatonina livre. No estudo com o modelo alternativo C. elegans, foi utilizada uma formulação de Mel-LNC marcada com rodamina B (Mel-LNC-RoB), a fim de verificar a absorção dessa formulação pelo nematoide. Foi possível observar que a internalização da Mel-LNC no C. elegans ocorre principalmente pela via oral, uma vez que se verificou uma intensa fluorescência no intestino do nematoide após o tratamento com a Mel-LNC-RoB e após três horas, essa fluorescência se distribuiu pelo restante do corpo, apresentando inúmeros pontos de fluorescência fora do intestino. Com relação à avaliação do efeito protetor nesse modelo alternativo in vivo, pode-se inferir que o pré-tratamento com Mel-LNC aumentou a sobrevida, diminuiu a produção de espécies reativas (ERs) e manteve o desenvolvimento normal dos nematoides após a exposição ao PQ, sendo que isso não foi verificado quando os mesmos foram pré-tratados com melatonina livre. Além disso, verificou-se que as nanocápsulas de núcleo lipídico (LNC) são seguras para o uso no modelo C. elegans, uma vez que apresentou alto valor para a dose letal 50 (DL50), e alterações no desenvolvimento e produção de ERs somente ocorreram em doses mais elevadas que as utilizadas em nossos experimentos. Dessa maneira, a formulação de Mel-LNC mostrou-se um promissor candidato para estudos futuros nos casos de intoxicação por paraquat. / According to estimations by World Health Organization (WHO), pesticides are responsible for 70 thousand acute intoxication cases that lead to death per year. Among these compounds, paraquat (PQ) presents the highest mortality rate, about 13% of all registered cases, especially for the lack of effective treatment. The major mechanism of toxicity proposed is associated to its redox cycle, in which oxygen and nitrogen reactive species (RS) are generated culminating in oxidative stress (OS). Some reports in the literature support the use of antioxidants for PQ intoxication cases. The present study aimed to evaluate the use of melatonin-loaded lipid-core nanocapsules (Mel-LNC) in the protection against PQ-induced damages, considering that nanotechnology has improved the antioxidant activity of this molecule. For this purpose, an in vitro system composed by lung adenocarcinoma (A549) cell line, and the in vivo alternative model of Caenorhabditis elegans have been utilized. Mel-LNC and unloaded lipid-core nanocapsules were prepared by self-assembly and characterized by particle sizing, zeta potential and pH, and for Mel-LNC formulation it was determined the drug content and encapsulation efficiency. The results are in agreement with the parameters already validated for these formulations. It was possible verify that Mel-LNC and LNC formulations remained stable in the culture medium utilized in in vitro and in vivo experiments. Results from in vitro studies showed that none of the formulations induced reduction in cell viability or DNA damage in treated cells. Besides, it was observed the internalization of Mel-LNC marked with rhodamine B, showing an intense red fluorescence around the cell nucleus. Pretreatment with Mel-LNC was able to enhance cell viability and diminish DNA oxidative damage caused by paraquat after 24h exposure, which could not be observed when cells were pretreated with Mel. In the study with the alternative model C. elegans, a rhodamine (Ro)-linked Mel-LNC formulation was prepared in order to assess the absorption of the formulation by the nematode. Mel-LNC uptake in C. elegans was found to occur mainly by the oral route, once an intense fluorescence was observed in the intestine after treatment with Mel-LNC-RoB, which after 3h distributed to the rest of the body, presenting numerous fluorescence dots outside the intestine. In relation to the evaluation of protection with the in vivo alternative model, results indicate that pretreatment with Mel-LNC increased survival rate, reduced the production of reactive species and maintained the normal development of nematodes after paraquat exposure, while the same observations were not found after pretreatment with free melatonin. In addition, the lipid-core nanocapsules (LNC) were found to be safe in the C. elegans model, due to its high lethal dose (LD50) value, and development alterations and RS production only occurred in the higher doses than those utilized in our experiments. Therefore, the Mel-LNC formulation demonstrated to be a promising candidate for future studies aiming treatment of paraquat intoxication cases.