Specific amino acids (i.e. arginine, citrulline, aspartic acid, histamine, glutamic acid and taurine) play significant roles in a number of physiological processes such as neurotransmission, inflammation and cell proliferation. Analytical methods that are capable of measuring these compounds in small volumes are important for in vivo sampling strategies and single cell analysis. Electrophoresis-based methods (e.g. capillary (CE) and microchip (ME) electrophoresis) with fluorescence detection have been applied to determine various biological compounds due to the high separation efficiency, simplicity, very low sample and solvent volume consumption and short analysis time. In this study, selected amino acids were off-line derivatized with naphthalene-2,3-dicarboxaldehyde/cyanide (NDA/CN-). NDA itself is not fluorescent, but can react with primary amines in the presence of cyanide to produce N-substituted 1-cyanobenz[f]isoindole (CBI) derivatives, which are fluorescent. Run conditions (e.g. buffer additives, organic solvent and separation voltage) were optimized for both methods (CE and ME) to obtain baseline separation of the six analytes. Excitation was accomplished using a diode laser (λex = 445 nm and λem = 490 m). Based on five-point calibration curves, both methods showed good linearity in the range of 10 to 0.1 µmolL-1 for each amino acid. Precision with %RSDs of less than 6.9 and 13.2% was obtained from CE and ME, respectively. For CE, the number of plates (N) was greater than 150 000/m, resolution values were more than 3.4 and migration time was between 11.2 to 18.2 min. ME offered a better efficiency (N > 300 000/m) and resolution (Rs > 3.9) with a much shorter analysis time (3.8 min) than the CE method. Limits of detection and quantification were significantly lower than the concentrations measured in microdialysis sample (MD) for both methods. According to the results with MD, it was possible to identify and quantify all analytes using CE and ME method. A portable fluorescence detection system for use with microchip electrophoresis was developed. Using the portable system with ME, limits of detection for the analytes of interest were 250 nmolL-1 – 1.3 μmolL-1, which were adequate for most analyte detection in brain microdialysis samples. (P.S.: some expressions without training) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Aminoácidos específicos (arginina, citrulina, ácido aspártico, histamina, ácido glutâmico e a taurina) apresentam funções importantes em vários processos fisiológicos, tais como neurotransmissão, inflamação e proliferação celular. Métodos analíticos que são capazes de quantificar estes compostos utilizando baixo volume de amostra são importantes para estratégias de amostragem in vivo e análises de célula única. Métodos baseados em eletroforese, como eletroforese capilar (EC) e microchip eletroforético (ME), com detecção por fluorescência têm sido utilizados para determinar vários compostos biológicos, devido à elevada eficiência de separação, simplicidade, baixo consumo de amostra, volume do solvente e o curto tempo de análise. Neste estudo, os aminoácidos selecionados foram derivatizados off-line com naftaleno-2,3-dicarboxaldeído/cianeto (NDA / CN-). NDA não é por si só fluorescente, mas pode reagir com aminas primárias na presença de cianeto para produzir 1-cianobenz[f]isoindoline N-substituídos (CBI), que são derivados fluorescentes. As condições de execução, incluindo aditivos no tampão, solvente orgânico e voltagem de separação foram otimizados para ambos os métodos (EC e ME) visando obter adequada resolução de separação para seis analitos. A excitação foi conseguida utilizando um laser de diodo (λex = 445 nm e λem = 490 m). Com base nas curvas analíticas com cinco pontos, os dois métodos demonstraram uma boa linearidade no intervalo de 10 a 0,1 µmolL-1 para cada aminoácido. Precisão com RSD% menor do que 6,9 e 13,2% foram obtidos a partir da técnica de EC e ME, respectivamente. Para EC, o número de pratos teóricos (N) foi maior do que 150 000 / m, com valores de resolução maiores que 3,4; sendo que o tempo de migração variou entre 11,2-18,2 min. ME ofereceu uma melhor eficiência (N> 300 000 / m) e resolução (Rs> 3,9) com um tempo de análise muito mais curto (3,8 minutos) do que o método aplicando EC. Os limites de detecção e quantificação para ambos os métodos foram significativamente menores do que as concentrações medidas nas amostras de microdiálise (MD). De acordo com os resultados com MD, foi possível identificar e quantificar todos os analitos usando o método de EC e ME. Um sistema portátil de detecção de fluorescência para ser utilizado com microchip eletroforético foi desenvolvido. Usando o sistema portátil com o ME, os limites de detecção para os analitos de interesse foram 250 nmolL-1 – 1,3 μmolL-1, que são adequados para a detecção da maioria dos analitos nas amostras de microdiálise cerebral. (OBS.: algumas expressões sem formação)
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.repositorio.ufal.br:riufal/1854 |
| Date | 17 February 2016 |
| Creators | Costa, Elton Elias Melo |
| Contributors | Galdino, Fabiane Caxico de Abreu, http://lattes.cnpq.br/4203326795155880, Lunte, Susan M., http://lattes.cnpq.br/7007001583530368, Santos, Diógenes Meneses dos, http://lattes.cnpq.br/5063053743763729, Vermelho, Marcos Vinícius Dias, http://lattes.cnpq.br/2876196606157039, Bortoluzzi, Janaína Heberle Dias, http://lattes.cnpq.br/2876196606157039, Santos, Josué Carinhanha Caldas, http://lattes.cnpq.br/3735618604163061 |
| Publisher | Universidade Federal de Alagoas, Brasil, Programa de Pós-Graduação em Química e Biotecnologia, UFAL |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFAL, instname:Universidade Federal de Alagoas, instacron:UFAL |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | bitstream:http://www.repositorio.ufal.br:8080/bitstream/riufal/1854/2/license.txt, bitstream:http://www.repositorio.ufal.br:8080/bitstream/riufal/1854/1/Determina%C3%A7%C3%A3o+de+amino%C3%A1cidos+neuroativos+em+amostras+de+microdi%C3%A1lise+utilizando+eletroforese+capilar+e+microchips+com+detec%C3%A7%C3%A3o+por+fluoresc%C3%AAncia.pdf |
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