A vasculopatia crônica do transplante constitui um dos principais obstáculos para o sucesso do transplante de órgãos a longo prazo. Caracteriza-se pela formação de uma camada neoíntima, que culmina no estreitamento da luz do vaso com consequente isquemia e falência do órgão transplantado. Embora diversos mecanismos imunológicos tenham sido descritos, a patogênese da vasculopatia crônica do transplante ainda não foi esclarecida e continua sem tratamento específico. Neste contexto, estratégias com alvos imunomodulatórios são de extrema importância. Dentre estas possíveis estratégias destaca-se a talidomida, uma droga que apresentada potentes propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias e que recentemente voltou a ter indicações clínicas. Assim, os objetivos do presente estudo foram: 1) Padronizar o modelo experimental de vasculopatia crônica do transplante no modelo experimental de transplante de aorta, pois este modelo mimetiza as principais características observadas na parede do vaso durante o processo de rejeição; 2) Analisar o efeito da talidomida sobre as alterações morfológicas vasculares (histologia para Verhoeff), componentes celulares (expressão de a-actina, atividade proliferativa, número de macrófagos e linfócitos T, através de imuno-histoquímica), além da participação da apoptose (técnica de TUNEL); 3) Avaliar o potencial efeito anti-inflamatório e imunomodulador da talidomida neste modelo, através da análise da expressão de mediadores da resposta imune (TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, IL-4 e IL-10), bem como a atividade do NFkB e o envolvimento das subunidades p50 e p65 no enxerto vascular. Foram utilizados ratos machos das linhagens isogênicas específicas, Fisher 344 e Lewis, distribuídos em 3 diferentes grupos (32 por grupo): ISO (transplante isogênico de aorta, Fisher para Fisher); ALO (transplante alogênico de aorta, Fisher para Lewis); ALO+TALID (transplante alogênico de aorta tratado com talidomida (200mg/Kg/dia/gavagem)). Os animais foram acompanhados por um período de 30 dias e, em seguida, sacrificados. Os resultados obtidos demonstraram que a padronização do modelo experimental de transplante de aorta foi viabilizada dentro de uma sequência metodológica extremamente precisa e reprodutível. Como esperado, os animais do grupo ISO não apresentaram sinais de rejeição no enxerto vascular, mantendo íntegra a arquitetura das camadas do vaso. Por outro lado, animais do grupo ALO desenvolveram vasculopatia crônica do transplante caracterizada pelo espessamento das camadas íntima e adventícia. Na camada média evidenciou-se diminuição das VSMC e acentuado rompimento das fibras elásticas. Além disso, os animais do grupo ALO apresentaram aumento da expressão de a-actina acompanhada de intensa atividade proliferativa celular, particularmente nas camadas neoíntima e adventícia, provavelmente pela migração das VSMC para a camada íntima. A análise por IH revelou intenso infiltrado de macrófagos, linfócitos T, além de apoptose presente em todas as camadas do aloenxerto. A expressão gênica e a concentração tecidual dos mediadores da resposta imune TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g e IL-10 também foram significativamente aumentadas no grupo ALO. Esses achados associaram-se com a ativação do NFkB, bem como o envolvimento dos dímeros p50 e p65. O tratamento com talidomida promoveu um efeito vasculoprotetor através da redução da camada neoíntima e da inflamação local. Além disso, induziu diminuição da expressão gênica e da concentração tecidual dos mediadores TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, bem como aumento da IL-4 e IL-10. A talidomida também diminuiu a ativação do NFkB. Conclusão: os resultados do presente estudo indicam que o modelo experimental de vasculopatia crônica do transplante constitui um modelo adequado para estudar as alterações nas camadas do vaso durante o processo de rejeição ao aloenxerto. A talidomida exerceu um efeito vasculoprotetor, atenuando a formação da neoíntima e do processo inflamatório local, bem como dos mediadores da resposta imune, provavelmente devido as suas propriedades anti-inflamatórias e imunomodulatórias / Chronic transplant vasculopathy is a major obstacle for the long-term success of organ transplantation. It is characterized by the formation of neointimal layer that culminate in the narrowing of the vessel lumen with consequent ischemia and failure of the transplanted organ. Although several immunological mechanisms have been described, the pathogenesis of chronic transplant vasculopathy remains unclear and continues without specific treatment. In this context, immunomodulatory strategies are extremely important. Among these possible strategies stands out thalidomide, a drug that display a potent antiinflammatory and immunomodulatory properties and recently have returned to clinical indications. The aims of this study were: 1) To standardize the experimental model of chronic transplant vasculopathy, induced in an experimental model of aortic transplantation, because this model mimics the key features observed in the vessel wall during the rejection process; 2) To analyze the effects of thalidomide on vascular morphological (Verhoeff staining), cellular components (a-actin expression, proliferative activity, number of macrophages and T lymphocytes by immunohistochemistry), and the participation of apoptosis (TUNEL assay); 3) To evaluate the antiinflammatory and immunomodulatory potential effects of thalidomide in this model by analyzing the mediator expression of the immune response (TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, IL-4 e IL-10), as well as the NFkB activity and involvement of p50 and p65 subunits in the vascular graft. We used male rats from the specific inbred strains, Fisher 344 and Lewis, divided into 3 different groups (32 per group). ISO (isogeneic aortic transplantation, Fisher to Fisher); ALO (allogeneic aortic transplantation, Fisher to Lewis); ALO+THALID (allogeneic aortic transplantation treated with thalidomide (200mg/Kg/day/gavage)). The animals were followed during a period of 30 days and then sacrificed. The results showed that the standardizing of the experimental model of aortic transplantation was possible within a sequence highly accurate and reproducible methodology. As expected, the animals of the ISO showed no sign of graft rejection keeping the entire layered architecture of the vessel. On the other hand, the ALO group developed chronic transplant vasculopathy characterized by thickness of the intima and adventitia. Furthermore, ALO group animals showed increase of a-actin expression accompanied by an intense cellular proliferative activity, particularly in the neointima and adventitia layers, probably due to VSMC migration to the intima. Analysis by IH revealed intense infiltration of macrophages and T lymphocytes, as well as apoptosis in all layers of the allograft. The gene expression and tissue concentrations of the mediators of immune response TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, and IL-10 were also significantly higher in the ALO group. These findings were associated with the NFkB activation, as well as the involvement of p50 and p65 dimers. Treatment with thalidomide promoted a vascular protective effect by reducing the neointimal formation and local inflammation. Moreover, induced a decrease in the gene expression and tissue concentration of the inflammatory mediators TNF-a, IL-1b, IL-6, IL-2, INF-g, as well as increase of IL-4 and IL-10. Thalidomide also decreased the NFkB activation. Conclusion: the results of this study indicate that experimental model of chronic transplant vasculopathy is an appropriate model to study changes in the vessel layers during the process of allograft rejection. Thalidomide promoted a vascular protective effect, attenuating neointimal formation and local inflammation, as well as mediators of immune response, probably due to its anti-inflammatory and immunomodulatory properties
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22092014-162614 |
| Date | 25 February 2014 |
| Creators | Santana, Alexandre Chagas de |
| Contributors | Noronha, Irene de Lourdes |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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