Chez les plantes, l'oxyde nitrique (NO) est impliqué dans de nombreux processusbiologiques tels que la germination ou le développement racinaire et intervient dans les réponses àdivers stress biotiques ou abiotiques. Ainsi, en situation de stress en fer, la production de NOconstitue un événement précoce dans la voie de signalisation qui aboutit à l'induction desferritines. Les cibles du NO demeurent toutefois mal connues, mais il est établi qu'un effet majeurest la S-nitrosylation de cystéines dans les protéines. Dans ce travail, nous avons cherché àidentifier les protéines (et les cystéines) qui constituent les cibles moléculaires du NO dans deuxsituations de stress abiotique chez Arabidopsis thaliana. Dans ce but, une démarche deprotéomique post-traductionnelle dédiée, fondée sur la méthode classique dite du «Biotin-switch»(BS), a été privilégiée pour l'identification des protéines nitrosylées. Par ailleurs, afin de pouvoirévaluer les variations de nitrosylation et analyser des réponses physiologiques, nous avonsintroduit une dimension quantitative en combinant le BS à un marquage des thiols par des réactifsdifférant par la présence d'isotopes lourds (Isotope coded affinity tag, ICAT). La méthode ainsidéveloppée (BS-ICAT) a permis de caractériser des variations de nitrosylation de protéines lorsd'un stress ferrique et d'un stress salin. A côté de l'identification de cibles potentielles du NO, lesrésultats ont également attiré l'attention sur certaines limites du BS. Sur cette base, la méthodeBS-ICAT a été utilisée pour revisiter quantitativement le BS. Nous avons montré que le blocagedes thiols libres, étape initiale-clé fondant le BS, n'est que partiel et conduit à l'apparition de fauxpositifs. Simultanément, de nouveaux contrôles de spécificité ont été éprouvés. La combinaisonBS-ICAT constitue l'une des toutes premières tentatives pour la caractérisation quantitative àlarge échelle de réponses de nitrosylation. A côté d'un premier répertoire de sites de Snitrosylationchez les plantes et de l'identification de candidats potentiellement impliqués dans lesréponses aux stress en fer et en sel, l'analyse quantitative permet de proposer une utilisation du BSintégrant ses limites de façon plus contrôlée. Cette analyse souligne le besoin de méthodesalternatives où le marquage soit réalisé directement sur les nitrosothiols. / In plants, nitric oxide (NO) is involved in many biological processes such as germination or roots development and in responses to various biotic and abiotic stresses. Thereby, in iron stress situations, NO production is the earliest signaling pathway event leading to ferritins induction. NO targets remain largely unknown but it is now stated that cysteine S-nitrosylation in proteins is the main NO consequence. The present work aims at identifying NO target proteins in Arabidopsis thaliana in the context of two abiotic stresses. For this purpose, a posttranslational proteomics approach based on the classical “Biotin-Switch” method (BS) was favored to identify nitrosylated proteins. Moreover, in order to estimate changes in nitrosylation and analyze physiological responses, a quantitative dimension combining the BS and a differential isotope based labeling of thiol with the ICAT reagents (Isotope Coded Affinity Tag) was introduced. This method named BS-ICAT allowed us to characterize quantitative variations of S-nitrosylation during an iron and a salt stress. Beside the identification of potential NO targets, our results highlighted limitations of BS method through incomplete free thiol blockage, the key initial step in BS, leading to false positive identifications. Simultaneously, new control have been introduced to test the specificity of the labeling. The combination of BS and ICAT is one the first attempt to quantitatively characterize the NO response at a large scale. This quantitative analysis results in one of the first repertoire of S-nitrosylation sites in plant proteins under abiotic stress and highly suggests a careful use of BS under strict control conditions. Moreover this analysis re-enforces the emerging need for alternative methods where the labeling molecules react directly with the nitrosothiols.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:theses.fr/2012MON20050 |
| Date | 06 April 2012 |
| Creators | Fares, Abasse |
| Contributors | Montpellier 2, Rossignol, Michel, Peltier, Jean-Benoît |
| Source Sets | Dépôt national des thèses électroniques françaises |
| Language | French |
| Detected Language | English |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
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