Chez les plantes, l'oxyde nitrique (NO) est impliqué dans de nombreux processusbiologiques tels que la germination ou le développement racinaire et intervient dans les réponses àdivers stress biotiques ou abiotiques. Ainsi, en situation de stress en fer, la production de NOconstitue un événement précoce dans la voie de signalisation qui aboutit à l'induction desferritines. Les cibles du NO demeurent toutefois mal connues, mais il est établi qu'un effet majeurest la S-nitrosylation de cystéines dans les protéines. Dans ce travail, nous avons cherché àidentifier les protéines (et les cystéines) qui constituent les cibles moléculaires du NO dans deuxsituations de stress abiotique chez Arabidopsis thaliana. Dans ce but, une démarche deprotéomique post-traductionnelle dédiée, fondée sur la méthode classique dite du «Biotin-switch»(BS), a été privilégiée pour l'identification des protéines nitrosylées. Par ailleurs, afin de pouvoirévaluer les variations de nitrosylation et analyser des réponses physiologiques, nous avonsintroduit une dimension quantitative en combinant le BS à un marquage des thiols par des réactifsdifférant par la présence d'isotopes lourds (Isotope coded affinity tag, ICAT). La méthode ainsidéveloppée (BS-ICAT) a permis de caractériser des variations de nitrosylation de protéines lorsd'un stress ferrique et d'un stress salin. A côté de l'identification de cibles potentielles du NO, lesrésultats ont également attiré l'attention sur certaines limites du BS. Sur cette base, la méthodeBS-ICAT a été utilisée pour revisiter quantitativement le BS. Nous avons montré que le blocagedes thiols libres, étape initiale-clé fondant le BS, n'est que partiel et conduit à l'apparition de fauxpositifs. Simultanément, de nouveaux contrôles de spécificité ont été éprouvés. La combinaisonBS-ICAT constitue l'une des toutes premières tentatives pour la caractérisation quantitative àlarge échelle de réponses de nitrosylation. A côté d'un premier répertoire de sites de Snitrosylationchez les plantes et de l'identification de candidats potentiellement impliqués dans lesréponses aux stress en fer et en sel, l'analyse quantitative permet de proposer une utilisation du BSintégrant ses limites de façon plus contrôlée. Cette analyse souligne le besoin de méthodesalternatives où le marquage soit réalisé directement sur les nitrosothiols. / In plants, nitric oxide (NO) is involved in many biological processes such as germination or roots development and in responses to various biotic and abiotic stresses. Thereby, in iron stress situations, NO production is the earliest signaling pathway event leading to ferritins induction. NO targets remain largely unknown but it is now stated that cysteine S-nitrosylation in proteins is the main NO consequence. The present work aims at identifying NO target proteins in Arabidopsis thaliana in the context of two abiotic stresses. For this purpose, a posttranslational proteomics approach based on the classical “Biotin-Switch” method (BS) was favored to identify nitrosylated proteins. Moreover, in order to estimate changes in nitrosylation and analyze physiological responses, a quantitative dimension combining the BS and a differential isotope based labeling of thiol with the ICAT reagents (Isotope Coded Affinity Tag) was introduced. This method named BS-ICAT allowed us to characterize quantitative variations of S-nitrosylation during an iron and a salt stress. Beside the identification of potential NO targets, our results highlighted limitations of BS method through incomplete free thiol blockage, the key initial step in BS, leading to false positive identifications. Simultaneously, new control have been introduced to test the specificity of the labeling. The combination of BS and ICAT is one the first attempt to quantitatively characterize the NO response at a large scale. This quantitative analysis results in one of the first repertoire of S-nitrosylation sites in plant proteins under abiotic stress and highly suggests a careful use of BS under strict control conditions. Moreover this analysis re-enforces the emerging need for alternative methods where the labeling molecules react directly with the nitrosothiols.

Acteurs des mécanismes moléculaires de signalisation cellulaire, les espèces réactives de l'oxygène (ROS) et les espèces réactives de l'azote (RNS) agissent comme des molécules signal transférant des informations extracellulaires ou intracellulaires et induisant des réponses spécifiques. Les ROS/RNS agissent principalement via un ensemble de modifications post-traductionnelles réversibles des résidus thiols sur les protéines parmi lesquelles la nitrosylation et la glutathionylation apparaissent comme des éléments jouant un rôle important dans de nombreux processus cellulaires fondamentaux et impliqués dans nombre de maladies humaines. Bien que présents chez les organismes photosynthétiques, ces modifications ont été moins étudiées. Mon projet était d'étudier, in vivo, chez l'algue Chlamydomonas reinhardtii, la dynamique de la nitrosylation et de la glutathionylation, en utilisant une combinaison d'approches multidisciplinaires incluant protéomique, biochimie et biologie moléculaire. En réponse au stress nitrosatif, 492 protéines S-nitrosylées in vivo et 392 sites de nitrosylation ont été identifiés par spectrométrie de masse. Ces protéines participent à un large éventail de processus biologiques tels que la photosynthèse et la réponse au stress. Avec une stratégie similaire, l’analyse de la glutathionylation en réponse à des stresses physiologiques de forte lumière et de choc thermique, a révélé des voies spécifiques de réponse au stress. En parallèle, la dépendance redox des mécanismes moléculaires sous-jacents a été examinée pour la GAPDH cytoplasmique et l’isocitrate lyase, mais aussi la triosephosphate isomérase et la phosphoglycérate kinase chloroplastiques. / Actors of the molecular mechanism of cell signaling, reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) act as signaling molecules to transfer extracellular or intracellular information and elicit specific responses. ROS/RNS mainly act through a set of reversible post-translational modifications of thiol residues on proteins among which nitrosylation and glutathionylation have emerged as key elements playing a major role in numerous fundamental cell processes and implicated in a broad spectrum of human diseases. Despite ROS and RNS are present in photosynthetic organisms, such modifications have been less studied. My project was to investigate in the green algae Chlamydomonas reinhardtii, the in vivo dynamics of nitrosylation and glutathionylation, using a combination of multidisciplinary approaches including proteomic, biochemistry and molecular biology. In response to nitrosative stress, 492 in vivo s-nitrosylated proteins and 392 sites of nitrosylation were identified by mass spectrometry. These proteins were found to participate in a wide range of biological processes and pathway such as photosynthesis, stress response and carbohydrate metabolism. Employing a similar strategy, analysis of glutathionylation in response to physiological stresses, specifically high light and heat stress revealed specific stress dependent targeted pathways. In a second part, the redox dependence of the underlying molecular mechanisms was examined for the cytoplasmic GAPDH and ICL, but also the chloroplastic TPI and PGK. This work has highlighted the existence of a strong interplay between these redox modifications. a complex redox network