Die neuartige Infektionskrankheit Covid-19 breitet sich seit Dezember 2019 von Wuhan, China, in zahlreiche Länder aller Kontinente aus. Durch die rasche Verbreitung der Viruserkrankung und die schnell steigende Zahl an infizierten Personen, rief die WHO im Januar 2020 die „Gesundheitliche Notlage internationaler Tragweite“ aus. Im März desselben Jahres wurde die Situation als Pandemie deklariert. Die Infektionskrankheit wird durch das SARS-CoV-2 hervorgerufen, ein Vertreter aus der Gattung der Betacoronaviren, dessen Genom durch einzelsträngige RNA positiver Polarität (ssRNA) gekennzeichnet ist. Ein zoonotischer Ursprung des Virus aus Fledermäusen wird derzeit aufgrund hoher genetischer Übereinstimmungen als wahrscheinlichste initiale Quelle betrachtet. Die Transmission des SARS-CoV-2 erfolgt über die respiratorische Aufnahme von virushaltigem Aerosol und ruft Symptome wie Husten, Fieber, Geschmacks- und Geruchsstörungen sowie bei schwerem Verlauf auch Pneumonien mit beatmungspflichtigem ARDS (Acute Respiratory Distress Syndrome) hervor. Eine spezifische Therapie für Covid-19 ist bisher nicht etabliert, jedoch sind supportive Maßnahmen sinnvoll, der Einsatz von Remdesivir von der Europäischen Arzneimittel-Agentur zugelassen und die Verwendung von systemischen Kortikosteroiden von der WHO empfohlen. Um die Basisreproduktionszahl für das SARS-CoV-2 gering zu halten, sind infektionspräventive Maßnahmen wie Mund-Nase-Bedeckung, Mindestabstand, regelmäßiger Luftaustausch und das strenge Einhalten von Hygieneregeln wirksam. Die ersten Impfstoffe für die Viruserkrankung Covid-19 stehen seit Dezember 2020 bereit. Da die Vakzine bislang begrenzt zur Verfügung stehen, ist eine frühzeitige Diagnostik und die Nachverfolgung des Infektionsgeschehens weiterhin von großer Bedeutung. Der direkte Erregernachweis des SARS-CoV-2 erfolgt durch einen Nasen-Rachen-Abstrich, der mittels RT-PCR auf replizierendes Virusgenom untersucht wird. Für die Erfassung der asymptomatisch bzw. subklinisch infizierten Personen sind neben dem Antigen-Schnelltest auch serologische Nachweisverfahren notwendig, um die reale Ausbreitung des SARS-CoV-2 nachvollziehen zu können. Ziel dieser Arbeit war es, durch zahlreiche Optimierungen ein valides Protokoll für einen SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA zu etablieren. Der Test sollte einen qualitativen Nachweis zur Detektion der SARS-CoV-2-Immunantwort gegen das Nukleokapsidprotein des Virus möglich machen.
Die in das Protokoll aufgenommenen Optimierungen umfassen u. a. die Konzentration des verwendeten Antigens N-MBP, die Zusammensetzung der Beschichtungs- und Blocklösung, die Probenvolumina, die Verdünnung des Sekundärantikörpers und die Zeit der Substratinkubation für die Farbentwicklung. Für das Protokoll des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA wurde ein Kalibrator entwickelt, um einen normierten Grenzwert für Seropositivität festlegen zu können und ein Antikörper-Konzentrationsstandard etabliert, um die Ergebnisse des Immunassays auch quantitativ interpretieren zu können. Zur Validierung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA wurden 73 Covid-19-Seren von Probanden mit zuvor positivem RT-PCR Testergebnis und 180 Negativkontrollseren bzw. -plasmen verwendet. Die Covid-19-Patienten zeigten eine milde bis moderate Erkrankung oder einen asymptomatischen Infektionsverlauf. Die Covid-19-Seren wurden 2 - 3 Wochen (n = 25) oder über 4 Wochen (n = 48) nach Symptombeginn bzw. positivem RNA-Test gewonnen. Die Spezifität des SARS-CoV-2-N IgG Antikörpertests betrug 99,44 % und die Sensitivität wurde mit 80,82 % ermittelt. Nach 2 - 3 Wochen entnommene Covid-19-Seren wurden dabei mit einer Sensitivität von 80,0 % und mehr als 4 Wochen nach Diagnosestellung gewonnene Seren mit einer Positivrate von 81,3 % erkannt. Weiterhin wurde die Empfindlichkeit des In-house ELISA in einer prospektiven diagnostischen Studie mit der Sensitivität von sieben kommerziellen Nukleokapsid- oder S-Glykoprotein-basierten Antikörpertests verglichen, um den Nutzen der Tests für den klinischen Einsatz bewerten zu können. Die Sensitivitäten der Antikörperassays lagen bei 64,4 - 93,2 %. Die empfindlichsten Tests erkannten 95,8 - 100 % der über 4 Wochen nach Symptombeginn gewonnenen Covid-19-Seren als positiv. Seren, die 2 - 3 Wochen nach positivem RNA-Test entnommen wurden, wurden mit einer geringeren Sensitivität erkannt, was darauf hindeutet, dass der optimale Zeitpunkt für serologische Testungen später als 3 Wochen nach Ausbruch der Infektionskrankheit liegen sollte. Antikörpertests, die das Nukleokapsid- bzw. das S-Glykoprotein als Antigen verwendeten, zeigten vergleichbare Sensitivitätswerte auf. Dies bedeutet, dass sowohl N- als auch S-basierte Antiköpertests für die serologische Diagnostik geeignet sind. Nukleokapsidprotein und S-Glykoprotein-basierte Antikörperassays zeigten außerdem Unterschiede in der Detektion einer positiven oder negativen Immunreaktion bei den untersuchten Covid-19-Seren. Eine kombinierte Auswertung von seriellen Tests unter separater Verwendung beider Antigene könnte somit die Positivrate bei der Untersuchung von Covid-19-Seren steigern.:INHALTSVERZEICHNIS
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS III
1 EINFÜHRUNG 1
1.1 SARS-CoV-2: Virale Struktur und Replikation 1
1.2 Covid-19: Pathogenese und Krankheitsbild 3
1.3 Epidemiologie und Herkunft 6
1.4 Diagnostik 8
1.5 Therapie 11
1.6 Prävention 12
1.7 Impfung 12
2 AUFGABENSTELLUNG 15
3 MATERIALIEN UND METHODEN 16
3.1 Materialien 16
3.1.1 Geräte 16
3.1.2 Chemikalien 16
3.1.3 Proteine 17
3.1.4 Seren 17
3.1.5 Immunoreagenzien 18
3.1.6 Sonstige Materialien 18
3.2 Methoden 18
3.2.1 Allgemein verwendete Lösungen 18
3.2.2 Ethikantrag 19
3.2.3 Probanden 19
3.2.4 Probenentnahme 20
3.2.5 Probenaufarbeitung 20
3.2.6 Nukleokapsidprotein (N) und Maltose-bindendes Protein (MBP) 20
3.2.7 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) 22
3.2.8 Kommerzielle Antikörpertests 23
3.2.9 Auswertung und Statistik 24
4 ERGEBNISSE 28
4.1 Optimierung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA 28
4.1.1 Beschichtung mit Nukleokapsid-Fusionsprotein 28
4.1.2 Einfluss der Antigenkonzentration in der Beschichtungslösung 29
4.1.3 Einfluss der Auftauhäufigkeit des N-MBP-Antigens 31
4.1.4 Variation der Beschichtungslösung 33
4.1.5 Beschichtungs- und Probenvolumina 34
4.1.6 Blocklösung 35
4.1.7 Substratinkubationszeit 36
4.1.8 Sekundärantikörperverdünnung 38
4.1.9 Stabilisierung des Protokolls mit CANDOR®-Reagenzien 40
4.2 Validierung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA 42
4.2.1 Herstellung eines Kalibrators 42
4.2.2 Bestimmung der Sensitivität 44
4.2.3 Bestimmung der Spezifität 46
4.2.4 Herstellung eines Antikörper-Konzentrationsstandards 47
4.2.5 Intra-Assay und Inter-Assay-Variabilität 49
4.3 Protokoll des SARS-CoV-2-N IgG Antikörper ELISA 50
4.4 Vergleich der diagnostischen Sensitivität von SARS-CoV-2-Nukleoprotein- und Glykoprotein-basierten Antikörpertests 53
5 DISKUSSION 58
5.1 Ergebnisse der diagnostischen Validierungsstudie 58
5.2 Eignung und Verwendung des Nukleokapsidproteins als Antigen für den SARS-CoV-2 IgG Antikörper ELISA 61
5.3 Validität und Limitationen 62
5.4 Ausblick und Bedeutung des SARS-CoV-2-N IgG Antikörpertests 64
6 ZUSAMMENFASSUNG 67
LITERATURVERZEICHNIS 70
ANLAGEN 89
ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 92
LEBENSLAUF 93
PUBLIKATIONSVERZEICHNIS 95
DANKSAGUNG 96
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:88856 |
| Date | 04 January 2024 |
| Creators | Schnurra, Carolin |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/updatedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.1016/j.jcv.2020.104544 |
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