Diese Arbeit beinhaltet Ergebnisse der ersten klinischen Studie zur Charakterisierung der mechanischen Eigenschaften von Zellen in einem Tumor mit der dafür notwendigen Probengröße. Dies ermöglichte die Erstellung eines umfassenden Bildes von Subpopulationen innerhalb eines Tumors mit großem diagnostischem Potential. Die Änderung der Einzelzellmechanik von Tumorzellen wird durch Veränderung des Zytoskeletts, einem komplexes Polymernetzwerk in Zellen, hervorgerufen. Mit Hilfe von Zellgiften wurde das Zytoskelett gezielt manipuliert, um den Einfluss einzelner Faktoren auf die Biomechanik zu bestimmen.
Aus Gewebeproben von Brustkrebspatienten wurden Zellen mit Hilfe enzymatischer Aufspaltung des extrazellulären Kollagennetzwerkes isoliert. Als Kontrollsystem wurden Primärzellen aus Brustreduktionsgewebe und aus Fibroadenomen, gutartigen Gewebeneubildungen der Brustdrüse, verwendet. Unter Einsatz des Optischen Stretchers, einer Zweistrahl-Laserfalle, wurden suspendierte Zellen für zwei Sekunden einer konstanten Zugspannung ausgesetzt und das Deformations- wie auch das anschließende Relaxationsverhalten beobachtet.
Dabei ergaben sich wesentliche Unterschiede zwischen Tumor- und Kontrollproben. Neben Zellen mit ähnlichen Steifigkeiten, enthielten Tumorproben Subpopulationen sehr weicher Zellen, wie sie in Normalgewebe nicht zu finden sind. Desweiteren war das Relaxationsverhalten der Tumorzellen stärker elastisch dominiert. Einzelne Zellen kontrahierten sogar aktiv gegen die Zugspannung. Versuche, das Zytoskelett mittels Zellgiften künstlich in einem Zustand zu bringen, der in Krebszellen beobachtet wurde, ergaben zwar ebenfalls die Zunahme weicherer Zellen, jedoch war das Relaxationsverhalten eher viskos dominiert. Fluoreszenzaufnahmen des Aktin-Zytoskeletts sowie der fokalen Adhäsionen, die das Aktin-Netzwerk der Zelle mit dem Substrat verankern, zeigten Veränderungen bei Krebszellen im Vergleich zu Kontrollen.
Darüber hinaus wurden Einflussfaktoren auf die Zellmechanik untersucht. Neben Kulturbedingungen, beeinflussen auch Alter und Medikation das biomechanische Verhalten. Die Steifigkeit der Krebszellen scheint vom Ursprungsgewebe beeinflusst zu werden, sodass Zellen verschiedener Krebsarten Steifigkeiten in unterschiedlichen Regimes zeigen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern wichtige Informationen für unser Verständnis der Karzinogenese und bilden die Grundlage für eine neue diagnostische Methode zur Bestimmung der Tumoraggressivität. Eine gezielte Untersuchung der gefundenen Subpopulationen in einem Tumor könnte dabei helfen, neue Therapieansätze zu entwickeln und damit die hohen Rezidivraten aggressiver Tumore zu vermindern.:Bibliographische Beschreibung 3
1 Introduction 10
2 Background 13
2.1 Cancer development and diagnosis 13
2.2 Biomechanics of cells 16
2.2.1 Cytoskeletal changes in cancer cells 17
2.2.2 Micro-mechanical measurement techniques 21
2.2.3 Interaction of laser light with cells: physical principles of the Optical Stretcher 25
2.2.4 Physical models of cell rheology 29
2.3 Cancer cell motility 35
2.4 Tumor boundaries 38
3 Materials and Methods 40
3.1 Sample preparation 40
3.1.1 Cell lines 40
3.1.2 Primary cells from breast reduction 41
3.1.3 Solid tissue samples 41
3.1.4 Drug treatment 48
3.1.5 Fluorescent staining 49
3.2 The Optical Stretcher 50
3.2.1 Experimental Setup 50
3.2.2 Data analysis 52
3.2.3 Reproducibility of Optical Stretcher measurements 52
3.2.4 Laser induced heating in optical traps 54
3.3 Rheometer measurements of collagen gels 57
4 Experimental Results 58
4.1 Parameter space of Optical Stretcher measurements 58
4.2 How well defined are primary tissues? 60
4.2.1 Cells adapt mechanical properties to culture conditions 60
4.2.2 Individual and cell type differences 64
4.3 Characterization of human primary breast cancer cells 68
4.3.1 Malignant tissues comprise an increased number of softer cells 69
4.3.2 Tumor cells show a strong relaxation behavior 73
4.3.3 Single cells contract against applied stress 75
4.4 Changing the biomechanical phenotype - induced alterations of the F-actin network 76
5 Discussion 80
5.1 Measurement bias and impact factors 80
5.2 Softening as an effect of cytoskeletal reorganization in cancer cells 84
5.3 Mechanism of cytoskeletal reorganization 86
5.4 Cells on their way of breaking the boundary 89
6 Conclusion and Outlook 92
Appendix 94
A Cell culture protocols 94
A.1 Used materials and devices for cell culture 94
A.2 Thawing of cells 95
A.3 Medium exchange 96
A.4 Passaging and preparation for measurement 96
A.5 Collagen gel preparation 97
A.6 Culturing specifics for each cell line used 98
A.7 Tissue dissociation protocol for human mamma carcinoma 98
A.8 Fluorescent staining 99
B Additional graphs 101
Bibliography 103
Acknowledgements 114
Curriculum Vitae 115
Selbständigkeitserklärung 116
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:12506 |
| Date | 22 April 2014 |
| Creators | Wetzel, Franziska |
| Contributors | Käs, Josef A., Fabry, Ben, Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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