Une hyperactivation de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) contribue à la pathogenèse des maladies des vaisseaux. Des travaux antérieurs suggèrent que l’augmentation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc) inhibe la prolifération des CMLV. Provoquer une augmentation d’AMPc préviendrait aussi certaines maladies vasculaires qui sont associées à des altérations dans sa signalisation impliquant l'activité de la protéine kinase A (PKA). Des études ont démontré la contribution du facteur de transcription « early growth response protein-1» (Egr-1) dans la pathogenèse des maladies vasculaires et une surexpression d’Egr-1 a été rapportée dans des modèles d'athérosclérose et d'hyperplasie intimale. Divers agents vasoactifs contrôlent l'expression d’Egr-1 suivant des mécanismes qui ont fait l’objet de plusieurs études mais demeurent incomplètement élucidés. L'angiotensine-II (Ang-II) est l'un des principaux peptides vasoactifs impliqués dans la pathogenèse des maladies vasculaires. Une des voies de signalisation induite par l’Ang-II implique l’augmentation du calcium (Ca2+) intracellulaire. Celle-ci se produit par l’activation de l'entrée de calcium opérée par la relâche des réserves (SOCE) de Ca2+ réticulaire suite à l’activation du récepteur à l’inositol-3-phosphate (IP3R) et le recrutement ultérieur du complexe conducteur formé par la molécule d'interaction stromale 1 (STIM-1) et le canal Orai-1. Bien qu’il ait déjà été démontré que l’expression de l'Egr-1 est régulée par la signalisation calcique en réponse à plusieurs stimuli, l'implication du complexe STIM-1/Orai-1 dans l'expression d'Egr-1 dans la CMLV n’a jamais été étudiée. De même, la question de savoir si la signalisation induite par l'Ang-II conduisant à l'expression d'Egr-1 est modulée par l'AMPc n’a jamais été explorée. Par conséquent, les travaux menés dans cette thèse ont consisté à examiner le rôle de la signalisation du Ca2+ dans l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II dans la CMLV avec une attention particulière portée sur le rôle joué par STIM-1 et Orai-1. En outre, nous avons examiné l'effet de l’augmentation de l’AMPc sur l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II et étudié les voies de signalisation associées. Nos données montrent que l’inhibition du récepteur IP3R et du SOCE par le 2-aminoéthoxydiphénylborate atténue la libération de Ca2+ induite par l’Ang-II et ceci s’accompagne d’une baisse des niveaux d’expression de protéine et d’ARN messager de l’Egr-1. La stimulation de l’expression de l'Egr-1 a également été supprimée à la suite du blocage de la calmoduline et de la protéine kinase CaMKII. De plus, le blocage par interférence d’ARN de l’expression de STIM-1 et Orai-1 a atténué l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II ainsi que la phosphorylation des protéines ERK et CREB. Par ailleurs, l'isoproterenol (ISO) et la forskoline (FSK), deux activateurs de l'adénylate cyclase ont atténué de manière dose-dépendante l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II. Des réponses similaires ont été observées en utilisant des analogues non spécifique (dibutyryl-cAMP) et PKA-spécifique (Benzoyl-cAMP) de l’AMPc, ainsi qu'un inhibiteur à large spectre de l'activité phosphodiesterase intracellualaire (isobutylméthylxanthine). L'inhibition de l'expression d'Egr-1 induite par l’Ang-II s’accompagne d'une augmentation de l’activité de la PKA mesurée par la phosphorylation de la « phosphoprotéine activée par les vasodilatateurs (VASP) », et d’une diminution concomitante de la phosphorylation de la protéine ERK. Le blocage pharmacologique de la PKA a réduit la phosphorylation de VASP et restauré la phosphorylation de la protéine ERK ainsi que l'expression d'Egr-1 en présence de l’Ang-II.
En résumé, nos données démontrent que la voie STIM-1/Orai-1 /Ca2+ médie l'expression de l'Egr-1 induite par l'Ang-II dans la CMLV et suggèrent que la suppression de la réponse à l’Ang-II menant à l’expression de l'Egr-1 peut expliquer les effets vasoprotecteurs de l’AMPc. En outre, ces travaux montrent que les mécanismes moléculaires de régulation de l’expression d’Egr-1 en réponse aux signaux externes culminent vers la modulation des cascades de signalisation en aval de la protéine ERK dans les CMLV. / Aberrant vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferative responses contribute to the development of neointimal lesions. Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is believed to inhibit VSMC proliferation, and vascular diseases are associated with impairments in cAMP-induced signalling responses involving protein kinase A (PKA) signaling. An enhanced expression of the early growth response protein-1 (Egr-1), a zinc finger transcription factor, has been reported in models of vascular diseases and, a crucial role of Egr-1 in regulating the expression of genes implicated in neointimal formation leading to atherogenesis has been suggested. Various vasoactive factors have been shown to modulate Egr-1 expression in VSMC via mechanisms which remain to be completely understood. Angiotensin-II (Ang-II) is one of the key vasoactive peptides implicated in the pathogenesis of vascular diseases. Ang-II elevates intracellular calcium (Ca2+) through activation of voltage-gated calcium channels as well as store-operated calcium channels. The store-operated calcium entry (SOCE) involves an inositol-3-phosphate receptor (IP3R)-coupled depletion of endoplasmic reticular Ca2+ and a subsequent activation of the stromal interaction molecule 1 (STIM-1) /Orai-1 complex. Although Egr-1 has been demonstrated to be upregulated in a Ca2+-dependent fashion in response to several stimuli, the involvement of STIM-1/Orai-1-dependent signaling in Egr-1 expression in VSMC has never been addressed. Besides, whether Ang-II-induced signaling leading to Egr-1 expression is modulated by cAMP-dependent signaling pathway remains unexplored. Therefore, in the present studies, we have examined the role of Ca2+ signaling in Ang-II-induced Egr-1 expression in VSMC and investigated the contribution of STIM-1 or Orai-1. Additionnaly, we have examined the effect of cAMP on Ang-II-induced expression of Egr-1 and have investigated the associated signalling pathways. Pharmacological blockade of IP3R and SOCE by 2-aminoethoxydiphenylborate (2-APB) decreased Ang-II-induced Ca2+ release and attenuated Ang-II-induced enhanced expression of Egr-1 protein and mRNA levels. Egr-1 upregulation was also suppressed following blockade of calmodulin and CaMKII. Furthermore, RNA interference-mediated depletion of STIM-1 or Orai-1 attenuated Ang-II-induced Egr-1 expression, as well as Ang-II-induced phosphorylation of ERK1/2 and CREB. Moreover, isoproterenol (ISO) and forskolin (FSK), two respective receptor and non-receptor activators of adenylate cyclase, attenuated Ang-II-induced Egr-1 expression in a dose-dependent fashion. Similar responses were observed using non-specific (dibutyryl-cAMP) and PKA-specific (Benzoyl-cAMP) analogs of cAMP, as well as a broad spectrum inhibitor of intracellular phosphodiesterase activity (isobutylmethylxanthine). The inhibition of Ang-II-induced Egr-1 expression was accompanied by an increase in serine 157 phosphorylation of the vasodilator-activated phosphoprotein (VASP), a marker of PKA activity, and this was associated with a concomitant decrease in ERK phosphorylation. Pharmacological blockade of PKA using H89 decreased VASP phosphorylation, restored Ang-II-induced ERK phosphorylation and abolished ISO- and FSK-mediated inhibition of Ang-II-induced Egr-1 expression.
In summary, our data demonstrate that STIM-1/Orai-1/Ca2+-dependent signaling pathways mediate Ang-II-induced Egr-1 expression in A-10 VSMC and suggest that PKA-mediated suppression of Ang-II-induced Egr-1 expression and phosphorylation of ERK may be among the mechanisms by which cAMP exerts its vasoprotective effects. In addition, our data supports the notion that stimuli-induced regulation of Egr-1 expression involves the participation of signaling cascades downstream of ERK in VSMC.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/19027 |
| Date | 12 1900 |
| Creators | Simo Cheyou, Estelle Rolande |
| Contributors | Srivastava, Ashok |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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