Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Une augmentation de la génération des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO), tels que le peroxyde d’hydrogène (H2O2), joue un rôle clé dans la pathophysiologie des maladies cardiovasculaires (MCV). La croissance et la prolifération excessives des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) ont été suggérées comme étant les mécanismes à la base de la dysfonction vasculaire. Une implication potentielle du facteur de transcription Early growth response protein-1 (Egr-1) dans le développement des dommages vasculaires a été proposée. Des études ont démontré que le H2O2 augmente l’expression de l’Egr-1 dans les CMLV. Cependant, les voies de signalisation intracellulaire menant à l’expression de l’Egr-1 en réponse au H2O2 restent à établir. L’objectif de cette étude vise à examiner les différentes voies de signalisation impliquées dans l’expression de l’Egr-1 induite par le H2O2 dans les CMLV. Le H2O2 augmente l’expression de l’Egr-1 en fonction du temps et de la dose dans les CMLV A10. Le blocage pharmacologique des tyrosines kinases insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) et c-Src, par AG1024 et PP2 respectivement, atténue l’expression de l’Egr-1 induite par le H2O2, alors que l’AG1478, un inhibiteur de l’epidermal growth factor receptor (EGFR), et le PP3, l’analogue inactif du PP2, n’ont aucun effet sur l’expression de l’Egr-1. Le blocage pharmacologique de l’extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), par UO126, et de la protéine kinase C (PKC), par rottlerin et rö-31-8220, diminue l’expression de l’Egr-1 induite par le H2O2. En résumé, nos résultats suggèrent que le H2O2 déclenche l’expression de l’Egr-1 via l’IGF-1R, la kinase c-Src, l’ERK1/2 et la PKC dans les CMLV. / Increased generation of reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide (H2O2), plays a key role in the pathophysiology of cardiovascular diseases (CVD). Excessive growth and proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMCs) has been suggested as an important contributor of vascular dysfunction. A potential involvement of early growth response protein-1 (Egr-1), a zinc-finger transcription factor, in the development of vascular injury has been proposed. Recent studies have shown that H2O2 increases Egr-1 expression in VSMCs. However, signaling events leading to H2O2-induced Egr-1 expression are not fully understood. Therefore, this study aims to examine the signaling pathways implicated in H2O2-induced Egr-1 expression in VSMC. H2O2 increased Egr-1 expression in a time and dose-dependent fashion in A10 VSMC. Pharmacological blockade of tyrosine kinases insulin-like growth factor-1 receptor (IGF-1R) and c-Src, by AG1024 and PP2 respectively, attenuated H2O2-induced Egr-1 expression, while AG1478, an epidermal growth factor receptor (EGFR) inhibitor, and PP3, the inactive analogue of PP2, have no effect on Egr-1 expression. Pharmacological blockade of extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2), by UO126, and proteine kinase C (PKC), by rottlerin and rö-31-8220, decreased H2O2-induced Egr-1 expression. In summary, our results suggest that H2O2 triggers Egr-1 expression through IGF-1R, c-Src, ERK1/2 and PKC in VSMC.

L'arteriosclerosis és un procés caracteritzat per l'engruximent i enduriment dela paret arterial, aquest procés es troba accelerat en pacients amb insuficiència renalcrònica (IRC). A més a més, aquests pacients pateixen una disminució de la síntesisde 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que comporta altres complicacions comel hiperparatïroidisme secundari (HPT2). Per aquesta raó es comú l'ús de 1,25(OH)2D3en el tractament del HPT2. L'efecte de la 1,25(OH)2D3 en la calcificació de les cèl·lulesde múscul llis (CMLV) està força estudiat, però el seu efecte en la proliferació noés molt clar.Vàrem analitzar l'efecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació de les CMLV perincorporació de BrdU i citometria de flux. Els nostres resultats mostren que la1,25(OH)2D3 indueix la proliferació de manera dosis depenent tant en estat quiescentcom proliferatiu. L'efecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació es correlaciona ambun increment de l'expressió del factor de creixement de l'endoteli vascular (vascularendothelial growth factor, VEGF). A més a més, inhibint l'activitat d'aquest factors'observa que la proliferació induïda per 1,25(OH)2D3 es troba totalment bloquejada.A partir d'aquests resultats vàrem analitzar la zona promotora del VEGF i vàremdetectar la presència de tres zones amb una seqüència molt semblant als elementsde resposta de la vitamina D (VDRE) presents en els gens diana de la 1,25(OH)2D3.A partir de l'anàlisis per Immunoprecipitació de Cromatina (ChIP) detectem un VDREen el promotor del VEGF on el receptor de la vitamina D (VDR) s'uneix desprésde tractar les CMLV amb 1,25(OH)2D3.Després vàrem plantejar un model diferent per comparar l'efecte de la 1,25(OH)2D3i el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el procés de proliferació i de calcificació in vitro, ex vivoi in vivo. Vàrem observar un increment de la proliferació en les CMLV, els anellsd'artèria aorta i en rates amb IRC tractades amb 1,25(OH)2D3, però no en els tractamentsamb 19-nor-1,25(OH)2D2. També vàrem determinar l'efecte que poden tenir aqueststractaments en la pressió arterial i ambdòs tractaments incrementen la tensió arterialsistòlica (TAS) de manera significativa, en canvi la 1,25(OH)2D3 no incrementa ladiastòlica (TAD) de la mateixa manera que el 19-nor-1,25(OH)2D2. La pressió del pols(PP) incrementa significativament en els animals tractats amb 1,25(OH)2D3.vL'arteriosclerosis és un procés caracteritzat per l'engruximent i enduriment dela paret arterial, aquest procés es troba accelerat en pacients amb insuficiència renalcrònica (IRC). A més a més, aquests pacients pateixen una disminució de la síntesisde 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que comporta altres complicacions comel hiperparatïroidisme secundari (HPT2). Per aquesta raó es comú l'ús de 1,25(OH)2D3en el tractament del HPT2. L'efecte de la 1,25(OH)2D3 en la calcificació de les cèl·lulesde múscul llis (CMLV) està força estudiat, però el seu efecte en la proliferació noés molt clar.Vàrem analitzar l'efecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació de les CMLV perincorporació de BrdU i citometria de flux. Els nostres resultats mostren que la1,25(OH)2D3 indueix la proliferació de manera dosis depenent tant en estat quiescentcom proliferatiu. L'efecte de la 1,25(OH)2D3 en la proliferació es correlaciona ambun increment de l'expressió del factor de creixement de l'endoteli vascular (vascularendothelial growth factor, VEGF). A més a més, inhibint l'activitat d'aquest factors'observa que la proliferació induïda per 1,25(OH)2D3 es troba totalment bloquejada.A partir d'aquests resultats vàrem analitzar la zona promotora del VEGF i vàremdetectar la presència de tres zones amb una seqüència molt semblant als elementsde resposta de la vitamina D (VDRE) presents en els gens diana de la 1,25(OH)2D3.A partir de l'anàlisis per Immunoprecipitació de Cromatina (ChIP) detectem un VDREen el promotor del VEGF on el receptor de la vitamina D (VDR) s'uneix desprésde tractar les CMLV amb 1,25(OH)2D3.Després vàrem plantejar un model diferent per comparar l'efecte de la 1,25(OH)2D3i el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el procés de proliferació i de calcificació in vitro, ex vivoi in vivo. Vàrem observar un increment de la proliferació en les CMLV, els anellsd'artèria aorta i en rates amb IRC tractades amb 1,25(OH)2D3, però no en els tractamentsamb 19-nor-1,25(OH)2D2. També vàrem determinar l'efecte que poden tenir aqueststractaments en la pressió arterial i ambdòs tractaments incrementen la tensió arterialsistòlica (TAS) de manera significativa, en canvi la 1,25(OH)2D3 no incrementa ladiastòlica (TAD) de la mateixa manera que el 19-nor-1,25(OH)2D2. La pressió del pols(PP) incrementa significativament en els animals tractats amb 1,25(OH)2D3.Posteriorment, vàrem analitzar les diferències en la calcificació en les ratestractades amb els dos compostos i a l'analitzar el calci i el fosfat del sèrum, observemun increment significatiu de calci en els dos tractaments. Després vàrem estudiarlas àrees calcificades de l'artèria aorta on observem un increment clar en les ratestractades amb 1,25(OH)2D3 que no va ser observat en les rates tractades amb 19-nor-1,25(OH)2D2. També mostrem la ratio de la túnica mitja respecte el lumen ipodem observar un increment significatiu en les rates tractades amb 1,25(OH)2D3.Finalment vàrem analitzar el procés de calcificació in vitro en les CMLV onvàrem observar un clar increment del contingut de calci en aquestes cèl·lules desprésdel tractament amb 1,25(OH)2D3, cosa que no vàrem observar en les cèl·lules tractadesamb 19-nor-1,25(OH)2D2. També vàrem observar un major increment en les cèl·lulestractades amb 1,25(OH)2D3 de l'expressió de RANKL, una citoquina essencial en elprocés d'osteoclastogènesis secretada pels osteoblasts (en el nostre cas probablementper cèl·lules semblants a osteoblasts).Per tant, els nostres resultats suggereixen que la 1,25(OH)2D3 estimula laproliferació mitjançant el factor de creixement VEGF y la calcificació de les CMLV.En canvi, el 19-nor-1,25(OH)2D2 solament presenta un lleu efecte en la proliferació. / La arteriosclerosis es un proceso caracterizado por el engrosamiento yendurecimiento de la pared de las arterias. Este proceso se encuentra acelerado enpacientes con insuficiencia renal crónica (IRC). Además, estos pacientes sufren unadisminución de la síntesis de 1,25-dihidroxivitamina D3 (1,25(OH)2D3) que les conducea otras complicaciones como el hiperparatiroidismo secundario (HPT2). Por estarazón el uso de 1,25(OH)2D3 es común en el tratamiento del HPT2. El efecto de la1,25(OH)2D3 en la calcificación de las células de músculo liso (CMLV) está bastanteestudiado, pero su efecto en la proliferación no está muy claro.Analizamos el efecto de la 1,25(OH)2D3 en la proliferación de las CMLV porincorporación de BrdU y citometría de flujo. Nuestros resultados muestran que la1,25(OH)2D3 induce la proliferación de las CMLV de una manera dosis dependientetanto en estado quiescente como proliferativo. El efecto de la 1,25(OH)2D3 en laproliferación se correlaciona con un incremento de expresión del factor de crecimientodel endotelio vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF). Además, al inhibirla actividad de este VEGF observamos que la proliferación inducida por la 1,25(OH)2D3se encuentra totalmente bloqueada.A partir de estos resultados analizamos la zona promotora de VEGF y observamosla presencia de 3 zonas con secuencias muy parecidas a los elementos de respuestade la vitamina D (VDRE) presentes en los genes diana de la 1,25(OH)2D3. A partirdel análisis por Inmunoprecipitación de Cromatina (ChIP) detectamos un VDRE enel promotor del VEGF donde el receptor de la vitamina D (VDR) se une tras eltratamiento con 1,25(OH)2D3.Luego planteamos un modelo distinto para comparar el efecto de la 1,25(OH)2D3y el 19-nor-1,25(OH)2D2 en el proceso de proliferación y de calcificación in vitro,ex vivo e in vivo en un modelo de ratas IRC. Observamos un incremento de laproliferación en las CMLV, los anillos de arteria aorta y en los animales tratados con1,25(OH)2D3 pero no en los tratamientos con 19-nor-1,25(OH)2D2. Tambiéndeterminamos el efecto de ambos tratamientos en la presión arterial y ambostratamientos incrementan la TAS de manera significativa, en cambio la 1,25(OH)2D3no aumenta la TAD de la misma manera que el 19-nor-1,25(OH)2D2. La presión delpulso incrementa significativamente en los animales tratados con 1,25(OH)2D3.Posteriormente, analizamos las diferencias en la calcificación en ratas tratadascon los dos compuestos y al analizar el calcio y fosfato del suero observamos unincremento significativo del calcio en los dos tratamientos. También determinamosla ratio media/lumen donde podemos observar un incremento significativo en lasratas tratadas con 1,25(OH)2D3. A continuación, estudiamos las áreas calcificadasde la arteria aorta y determinamos un claro incremento en las ratas tratadas con1,25(OH)2D3 que no es observado en las tratadas con 19-nor-1,25(OH)2D2.Finalmente, analizamos el proceso de calcificación in vitro en las CMLV yobservamos un incremento claro del contenido de calcio en estas células despuésdel tratamiento con 1,25(OH)2D3 que no fue observado en el tratamiento con 19-nor-1,25(OH)2D2. También observamos un incremento mayor en las células tratadascon 1,25(OH)2D3 de la expresión de RANKL, una citoquina esencial en el procesode osteoclastogénesis, secretada por los osteoblastos (en nuestro caso probablementepor células parecidas a osteoblatos).Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la 1,25(OH)2D3 estimula laproliferación mediante el factor de crecimiento VEGF y la calcificación de las CMLV.En cambio el 19-nor-1,25(OH)2D2v solamente presenta un leve efecto en la calcificación. / Atherosclerosis is a complex process characterized by an increase in the wallthickness due to accumulation of cells and extracellular matrix between theendothelium and the smooth muscle cell wall. This process is accelerated in patientswith chronic renal failure. In these patients, decreased sinthesis of 1,25-DihydroxyvitaminD3 (1,25(OH)2D3) leads to secondary complications, like hyperparathyroidism, beingtreatment with 1,25(OH)2D3 a common practice. The effect of 1,25(OH)2D3 on vascularsmooth muscle cells (VSMC) calcification has been widely studied, but the role of1,25(OH)2D3 on VSMC proliferation remains obscure.We have analyzed the effects of 1,25(OH)2D3 in the proliferation of VSMC. Wefound that 1,25(OH)2D3 induces a dose-dependent increase in VSMC proliferationin quiescent cells and in cells stimulated to grow. The effect of 1,25(OH)2D3 onVSMC proliferation is mediated by an increase of the expression of vascular endothelialgrowth factor (VEGF), since the inhibition of VEGF activity totally blunted the1,25(OH)2D3-induced VSMC proliferation. These results led us to study the promoterzone of VEGF gene. In this sequence we detected three putative sequences resemblingvitamin D response elements (VDRE). Using chromatin immunoprecipitation (ChIP)analysis we determined one VDRE in VEGF promoter that binds to the vitamin Dreceptor (VDR) after treatment with 1,25(OH)2D3.Then, we aimed to study the effect of 1,25(OH)2D3 and 19-nor-1,25-(OH)2D2in VSMC proliferation and calcification in vitro, ex vivo and in vivo in a model ofchronic renal failure (5/6 nephrectomy). We found an increase in proliferation invitro, ex vivo in aortic rings incubated with 1,25(OH)2D3 and in animals treated with1,25(OH)2D3 for 8 weeks. Furthermore, 19-nor-1,25-(OH)2D2 treatment did notincrease VSMC proliferation. We determined the effect of 1,25(OH)2D3 and 19-nor-1,25-(OH)2D2 in blood pressure. Both treatment increased SBP significantly. However19-nor-1,25-(OH)2D2 induced a significant increase in DBP which was not seen inthe 1,25(OH)2D3 treated animals. The pulse pressure increased significantly with1,25(OH)2D3 treatment. Then, we analized calcium and phosphate serum levels inrats and we observed a significant elevation of serum calcium in both treatments.This elevation was not different between 1,25(OH)2D3 and 19-nor-1,25-(OH)2D2. Theratio media/lumen area increased significantly in the 1,25(OH)2D3-treated group.Finally, we studied the calcified areas and we noticed a clear increase of calcificationin rats treated with 1,25(OH)2D3 compared with control and 19-nor-1,25-(OH)2D21,25(OH)2D3 stimulated VSMC proliferation and calcification in vivo. In contrast, 19-nor-1,25-(OH)2D2 had a slight effect in proliferation process with no effect oncalcification, despite the increases in plasma calcium observed in both groups.Finally, we evaluated the calcification proces in VSMC in vitro. Firstly, wedetermined calcium content in VSMC treated with 1,25(OH)2D3 or 19-nor-1,25-(OH)2D2 and we observed an increase of VSMC calcification only in cells treatedwit 1,25(OH)2D3. Moreover, we analized different osteoblastic markers and wedetected that RANKL expression incresased 5 fold in 1,25(OH)2D3 treatment.Therefore, this results suggest that 1,25(OH)2D3 stimulate vascular smooth musclecells through VEGF mediated pathway. 1,25(OH)2D3 stimulate calcification processtoo. Analog of vitamin D, 19-nor-1,25-(OH)2D2 only present slight efect in VSMCcalcification.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L’Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) est un peptide vasoconstricteur qui joue un rôle proéminent dans la progression des maladies cardiovasculaires, grâce à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), ainsi que par l'hyperactivation des voies de signalisation qui promeuvent la croissance et l'expression aberrante des gènes. Les histones désacétylases (HDACs), par leur aptitude à modifier le statut d'acétylation des résidus lysine dans les protéines d'histones et non-histones, régulent la transcription des gènes. Des études récentes ont montré qu'une activation accrue des HDACs, notamment HDAC5, est associée à des troubles vasculaires tels que l'athérosclérose. Cependant, le rôle de l'IGF-1 dans l'activation des HDACs par phosphorylation demeure mal caractérisé. Donc, dans les études présentes, on a examiné l’effet de l’IGF-1 sur la phosphorylation de HDAC5 dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) de type A10 et on a identifié les voies de signalisation impliquées dans ce processus. Le traitement des CMLV avec l’IGF-1 a augmenté la phosphorylation de HDAC5 sur la serine 498 de manière temps- et dose-dépendante. La pré-incubation des cellules avec l’AG1024, un inhibiteur pharmacologique du récepteur membranaire à l’IGF-1, a significativement atténué la phosphorylation d’HDAC5 induite par l'IGF-1. Par contre, le prétraitement avec l’AG1478, un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique, n'a pas eu d'effet significatif sur les niveaux de phosphorylation d’HDAC5. En outre, le blocage pharmacologique de la voie MAP kinase avec divers inhibiteurs (PD98059, UO126, SP600125 et SB203580) n’a pas abrogé la phosphorylation d’HDAC5, cependant les inhibiteurs de la voie protéine kinase B (PKB)/PI3-K, SC-66 et wortmannine respectivement, ont complètement aboli la phosphorylation d’HDAC5 induite par l’IGF-1. Ces données ont été confirmées par des expériences d’immunofluorescence et de silençage génique de PKB par interférence d’ARN. En outre, le prétraitement des cellules avec le diphénylèneiodonium (DPI) et l’apocynine, deux inhibiteurs de la NAD(P)H oxydase, ainsi que l'antioxydant N-acétyl-cystéine (NAC), a atténué la phosphorylation de HDAC5 et de PKB par l’IGF-1. De plus, le silençage génique de Nox4, la principale NAD(P)H oxydase des CMLV, a atténué la phosphorylation d’HDAC5 induite par l’IGF-1. De plus, l’utilisation des techniques d’extraction nucléaire a indiqué que le SC-66 et le DPI inhibent l’exportation nucléaire de HDAC5 induit par IGF-1. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1 induit la phosphorylation et l’exportation nucléaire de HDAC5 de façon ERO et PKB-dépendante dans les CMLV. / Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), a potent mitogenic and vasoactive factor, has been shown to play a role in the development of cardiovascular diseases. This occurs through the generation of reactive oxygen species (ROS) as well as through the hyperactivation of mitogenic and growth promoting signaling pathways and the subsequent alteration in gene expression. Histone deacetylases (HDACs), by their ability to modify the acetylation status of the lysine residues in histone and non-histone proteins, regulate gene transcription. Recent studies have demonstrated that a heightened activation of HDACs, notably HDAC5, is associated with vascular disorders such as atherosclerosis. However, a role of IGF-1 in HDAC phosphorylation and activation has not been investigated. Therefore, in the present studies, we examined the effect of IGF-1 on the phosphorylation of HDAC5 in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and identified the signaling pathways involved in this process. Treatment of A10 VSMCs with IGF-1 enhanced the phosphorylation of HDAC5 at serine 498 in a time and dosedependent fashion. Pretreatment of cells with AG1024, a selective pharmacological inhibitor of IGF-1R, significantly inhibited IGF-1-induced HDAC5 phosphorylation in A10 VSMCs whereas AG1478, a selective inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGFR), did not have an inhibitory effect on the levels of phospho-HDAC5. Pharmacological blockade of the MAPK pathway with PD98059, UO126, SP600125 and SB203580 had no effect on HDAC5 phosphorylation, whereas inhibitors of the PI3K/ PKB pathways, wortmannin and SC-66 respectively, almost completely attenuated IGF- 1-induced HDAC5 phosphorylation. These findings were confirmed by immunofluorescence localization of phospho-HDAC5 and by siRNA-induced silencing of PKB. In addition, pretreatment of A10 VSMCs with Diphenyleneiodonium (DPI) and apocynin, two NAD(P)H oxidase inhibitors, as well as the antioxidant N-Acetyl-Cysteine (NAC), resulted in an attenuation of IGF-1-induced HDAC5 and PKB phosphorylation. Furthermore, siRNA-induced silencing of Nox4, the main NADPH oxidase expressed in VSMC, inhibited IGF-1 induced HDAC5 phosphorylation. Moreover, IGF-1-induced phosphorylation of HDAC5 resulted in its nuclear export, which was reversed by blockade of PKB by SC-66 or NAD(P)H oxidase inhibition by DPI. In summary, these data demonstrate that IGF-1 induces the phosphorylation and nuclear export of HDAC5 in a Nox4-derived ROS- and PKB-dependent fashion in VSMCs.

Un remodelage vasculaire anormal est à la base de la pathogenèse des maladies cardio-vasculaires (MCV) telles que l’athérosclérose et l’hypertension. Des dysfonctionnements au niveau de la migration, l’hypertrophie et la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) sont des évènements cellulaires qui jouent un rôle primordial dans le remodelage vasculaire. L’insulin-like growth factor 1 (IGF-1), puissant facteur mitogène, contribue au développement des MCV, notamment via l’activation des protéines MAPK et PI3-K/PKB, composantes clés impliquées dans les voies de croissance cellulaire. Ces molécules sont également impliquées dans la modulation de l’expression de nombreux facteurs de transcription, incluant le facteur Egr-1. Egr-1 est régulé à la hausse dans différents types de maladies vasculaires impliquant les voies de signalisation de croissance et de stress oxydant qui par ailleurs peuvent être déclenchées par l’IGF-1. Cependant, la question d’une possible modulation de l’expression d’Egr-1 dans les CMLV demeure inabordée; plus spécifiquement, la caractérisation de la voie de signalisation reliant l’action d’IGF-1 à l’expression d’Egr-1 reste à établir. Dans cette optique, l’objectif de cette étude a été d’examiner l’implication de MAPK, PKB et des dérivés réactifs de l’oxygène (DRO) dans l’expression d’Egr-1 induite par l’IGF-1 dans les CMLV. L’IGF-1 a induit une augmentation marquée du niveau protéique de l’Egr-1 en fonction du temps et de la concentration utilisés. Cette augmentation a été inhibée en fonction des doses d’agents pharmacologiques qui ciblent les voies de signalisation de MAPK, PKB et DRO. De plus, l’expression du facteur de transcription, Egr-1, en réponse de l’IGF-1, a été atténuée suite à un blocage pharmacologique des processus cellulaires responsables de la synthèse d’ARN et de synthèse protéique. Pour conclure, on a démontré que l’IGF-1 stimule l’expression d’Egr-1 via les voies de signalisation, impliquant ERK1/2/JNK, PI3K/PKB. On a également proposé que les DRO jouent un rôle important dans ce processus. Dans l’ensemble, nous avons suggéré un nouveau mécanisme par lequel l’IGF-1 promeut la prolifération et l’hypertrophie cellulaire, processus à la base des anomalies vasculaires. / Aberrant vascular remodelling underlies the pathogenesis of major cardiovascular diseases (CVD), such as atherosclerosis and hypertension. Abnormal growth, migration and proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) are believed to play a critical role in vascular remodelling. IGF-1, potent mitogen, is believed to contribute to the development of CVD through the hyperactivation of proliferative and growth promoting pathways including mitogen-activated protein kinase (MAPK) and protein kinase B (PKB) pathways. It has also been implicated in modulating the expression of multiple transcription factors, including the early growth response protein-1 (Egr-1). Egr-1 upregulation has been observed in different models of vascular diseases implicating growth and redox signalling such as observed in response to IGF-1. However, modulation of Egr-1 expression by IGF-1 in VSMC, more specifically the signaling pathways involved in this process remain poorly characterized. Therefore, in the present studies, we investigated the implication of MAPK, PKB and ROS in IGF-1-induce Egr-1 expression in VSMC. IGF-1 induced a marked increase in Egr-1 protein level in a time and dose-dependent fashion. This increase was dose dependently inhibited by different pharmacological inhibitors targeting MAPK, PKB and reactive oxygen species (ROS) generation. Furthermore, pharmacological inhibitors of RNA and protein synthesis also attenuated IGF-1-induce response on Egr-1 expression. In conclusion, we showed that IGF-1 stimulates the expression of Egr-1 through ERK1/2/JNK and PI3K/PKB. We also propose that ROS generation plays an important role in this response. Overall, we propose a novel mechanism through which IGF-1 may exert its deleterious responses in vascular abnormalities.

La voie de signalisation des phosphoinositides joue un rôle clé dans la régulation du tonus vasculaire. Plusieurs études rapportent une production endogène de l’angiotensin II (Ang II) et de l’endothéline-1 (ET-1) par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) de rats spontanément hypertendus (spontaneously hypertensive rats : SHR). De plus, l’Ang II exogène induit son effet prohypertrophique sur les CMLVs selon un mécanisme dépendant de la protéine Gqα et de la PKCẟ. Cependant, le rôle de l’axe Gqα/PLCβ/PKCẟ dans l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal de l’hypertension artérielle n’est pas encore étudié. L’objectif principal de cette thèse est d’examiner le rôle de l’axe Gqα/PLCβ1 dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs provenant d’un modèle animal d’hypertension artérielle essentielle (spontaneously hypertensive rats : SHR). Nos premiers résultats indiquent que contrairement aux CMLVs de SHR âgés de 12 semaines (absence d’hypertrophie cardiaque), les CMLVs de SHR âgés de 16 semaines (présence d’hypertrophie cardiaque) présentent une surexpression protéique endogène de Gqα et de PLCβ1 par rapport aux CMLVs de rats WKY appariés pour l’âge. L’inhibition du taux d’expression protéique de Gqα et de PLCβ1 par des siRNAs spécifiques diminue significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. De plus, la surexpression endogène des Gqα et PLCβ1, l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR de 16 semaines ont été atténués significativement par des antagonistes des récepteurs AT1 (losartan) et ETA (BQ123), mais pas par l’antagoniste du récepteur ETB (BQ788). L’inhibition pharmacologique des MAPKs par PD98059 diminue significativement la surexpression endogène de Gqα/PLCβ1 et le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. D’un côté, l’inhibition du stress oxydatif (par DPI, inhibiteur de la NAD(P)H oxidase, et NAC , molécule anti-oxydante), de la molécule c-Src (PP2) et des récepteurs de facteurs de croissance (AG1024 (inhibiteur de l’IGF1-R), AG1478 (inhibiteur de l’EGFR) et AG1295 (inhibiteur du PDGFR)) a permis d’atténuer significativement la surexpression endogène élevée de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. D’un autre côté, DPI, NAC et PP2 atténuent significativement l’hyperphosphorylation de la molécule c-Src, des RTKs (récepteurs à activité tyrosine kinase) et de la molécule ERK1/2. Dans une autre étude, nous avons aussi démontré que la PKCẟ montre une hyperphosphorylation en Tyr311 dans les CMLVs de SHR comparées aux CMLVs de WKY. La rottlerin, utilisée comme inhibiteur spécifique de la PKCẟ, inhibe significativement cette hyperphosphorylation en Tyr311 dépendamment de la concentration. L’inhibition de l’activité de la PKCẟ par la rottlerin a été aussi associée à une atténuation significative de la surexpression protéique endogène de Gqα/PLCβ1 et l’hypertrophie des CMLVs de SHR. De plus, l’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, en amont du stress oxydatif, a permis d’inhiber significativement l’activité de la NADPH, le taux de production élevée de l’ion superoxyde ainsi que l’hyperphosphorylation de la molécule ERK1/2, de la molécule c-Src et des RTKs. À notre surprise, nous avons aussi remarqué une surexpression protéique de l’EGFR et de l’IGF-1R dans les CMLVs de SHR à l’âge de 16 semaines. L’inhibition pharmacologique de l’activité de la PKCẟ, de la molécule c-Src et du stress oxydatif a permis d’inhiber significativement la surexpression protéique endogène de ces RTKs. De plus, l’inhibition de l’expression protéique de l’EGFR et de la molécule c-Src par des siRNA spécifiques atténue significativement le taux d’expression protéique élevé de Gqα et de PLCβ1 ainsi que le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR. Des siRNAs spécifiques à la PKCẟ ont permis d’atténuer significativement le taux de synthèse protéique élevé dans les CMLVs de SHR et confirment le rôle important de la PKCẟ dans les mécanismes moléculaires de l’hypertrophie des CMLVs selon une voie dépendante du stress oxydatif. En conclusion, ces résultats suggèrent un rôle important de l’activation endogène de l’axe Gqα-PLCβ-PKCẟ dans le processus d’hypertrophie vasculaire selon un mécanisme impliquant une activation endogène des récepteurs AT1/ETa, de la molécule c-Src, du stress oxidatif, des RTKs et des MAPKs. / Vascular Gqα signaling has been shown to regulate cardiovascular contractility and growth. Vascular smooth muscle cells (VSMC) from SHR have been shown to exhibit enhanced endogenous production of angiotensin II (Ang II) and endothéline-1 (ET-1). In addition, exogenous Ang II was shown to induce VSMC hypertrophy through Gqα and PKCẟ signaling. However, studies on the role of Gqα/PLCβ1 proteins and PKCẟ signaling in VSMC hypertrophy in animal model of essential hypertension are lacking. The objective of the present thesis is to examine the role of Gqα/PLCβ1 proteins and the associated signaling pathways in VSMC hypertrophy using spontaneously hypertensive rats (SHR). VSMC from 16 week-old SHR (presence of cardiac hypertrophy) and not from 12 week-old SHR (absence of cardiac hypertrophy) exhibited enhanced levels of Gqα/PLCβ1 proteins as compared to age-matched Wistar-Kyoto (WKY) rats. The knockdown of Gqα and PLCβ1 in VSMC from 16 week-old SHR by antisense oligodeoxynucleotides and/or siRNA resulted in attenuation of protein synthesis. In addition, the enhanced expression of Gqα/PLCβ1 proteins, enhanced phosphorylation of ERK1/2 and enhanced protein synthesis in VSMC from SHR were attenuated by Ang II AT1 and ET-1 ETA receptor antagonists losartan and BQ123, respectively, but not by ETB receptor antagonist BQ788. In addition, PD98059 decreased the enhanced expression of Gqα/PLCβ1 and protein synthesis in VSMC from SHR. Since oxidative stress has been shown to be increased in hypertension, we tested the role of oxidative stress in enhanced expression of Gqα and PLCβ1 proteins and VSMC hypertrophy in SHR and further explore the underlying mechanisms responsible for this response. The increased expression of Gqα and PLCβ1 proteins as well as increased protein synthesis exhibited by VSMC from SHR were significantly attenuated by antioxidants: N-acetylcysteine (NAC), a scavenger of superoxide anion, DPI, an inhibitor of NAD(P)H oxidase, PP2 (c-Src inhibitor), AG1024 (IGFR inhibitor), AG1478 (EGFR inhibitor) and AG1295 (PDGFR inhibitor). In addition, the levels of IGF-1R and EGFR proteins and not of PDGFR were also enhanced in VSMC from 16 week-old SHR which were attenuated significantly by NAC, DPI and PP2. Furthermore, the inhibition of oxidative stress and c-Src molecule also attenuated the enhanced phosphorylation of IGF-1R, PDGFR, EGFR and EKR1/2 in VSMC from SHR. To further confirm our results, the knockdown of EGFR and c-Src with specific siRNA was also associated with a significant decrease in the enhanced expression of Gqα and PLCβ1 proteins and enhanced protein synthesis in VSMC from SHR. In another study we showed also that VSMC from 16 week-old SHR exhibit enhanced phosphorylation of PKCδ at Tyrosine 311 (Tyr311) as compared to VSMCs from WKY rats which was attenuated by rottlerin (PKCδ inhibitor) in a concentration dependant-manner. Furthermore, rottlerin also attenuated the increased production of superoxide anion, NAD(P)H oxidase activity, c-Src phosphorylation and ERK1/2 phosphorylation in VSMC from SHR. In addition, rottlerin and PKCδ-siRNA also attenuated the enhanced protein synthesis in VSMCs from SHR. The increased expression of Gqα, PLCβ1, IGF-1R and EGFR exhibited by VSMC from SHR were also attenuated by rottlerin in a concentration dependant manner. Rottlerin also inhibited significantly the enhanced phosphorylation of IGF-1R, PDGFR and EGFR in VSMCs from SHR and WKY. These results suggest that the enhanced levels of endogenous Ang II and ET-1 enhanced the expression of Gqα/PLCβ1 proteins in VSMC from 16 week-old SHR and result in VSMC hypertrophy. On the other hand, the enhanced oxidative stress, c-Src and PKCẟ activation, through the transactivation of growth factor receptors and MAPK signaling contribute to enhanced expression of Gqα and PLCβ1 proteins and resultant enhanced protein synthesis.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Il est admis que le Transforming Growth Factor-bêta (TGF-ß) est athéroprotecteur. Son apport bénéfique dans l'athérosclérose semble être contrarié par l'Interleukine-1-bêta (IL-1ß) qui est l'archétype des cytokines pro-inflammatoires. Notre but est, d'une part, de comprendre la régulation transcriptionnelle du TGF-ß dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLv) humaines, dans l'athérome carotidien humain à partir des données du transcriptome obtenues sur 32 patients à la fois dans les plaques athéromateuses (ATH) et dans le tissu avoisinant macroscopiquement sain (TMS) et, d'autre part, d'étudier l'antagonisme des effets du TGF-ß et de l'IL-1ß sur des CMLv en culture provenant du TMS. Nous avons abordé nos problématiques par deux approches : (1) une analyse bioinformatique de données transcriptomiques issues de biopuces. (2) une étude in vitro sur des CMLv de la carotide humaine. in vitro. Grace à l'analyse in silico nous avons montré que l'implication de KLF6 dans la transcription du TGFB1 était assez spécifique des cellules musculaires lises vasculaires (CMLv). Nos résultats permettent également de proposer de nouveaux FT potentiels, spécifiques des CMLv (SLC2A4RG, GABP et SALL2), qui pourraient favoriser le rôle athéroprotecteur de TGFB1 dans les CMLv de la carotide. Enfin, il semble qu'il existe un équilibre entre les FT activateurs ou inhibiteurs de l'expression de TGFB1 qui permet d'en moduler finement la transcription. Notre approche in vitro, à montre que l'IL-1ß induisait un phénotype inflammatoire associé à une activité élastolytique consécutive, pour l'essentiel, à l'augmentation de l'expression de la cathépsine S (CTSS). La neutralisation du TGF-ß endogène dé-réprime l'expression de la CTSS et exerce un effet additif à celui de l'IL-1ß sur l'expression de l'enzyme. En conclusion, l'expression du TGFB1 dans les CMLv étant soumise à un contrôle transcriptionnel spécifique du type cellulaire, il est envisageable de développer des approches pharmacologiques qui permettent de maintenir l'expression du TGFB1 dans la paroi artérielle au niveau requis pour qu'il y exerce ses effets athéroprotecteurs / It is accepted that the TGF-β is atheroprotective. Its beneficial contribution atherosclerosis seems to be opposed by IL -1β that is the archetype of the pro-inflammatory cytokines. Our goal is, first, to understand the transcriptional regulation of TGF-β in human vSMCs in carotid atherosclerosis from the transcriptomic data obtained from 32 patients in both atherosclerotic plaques (ATM) and in the adjacent macroscopically intact tissue (MIT) and, secondly, to study the antagonism of the effects of TGF-β and IL-1β on vSMCs cultured from MIT samples. We followed two approaches: (1) a bioinformatic analysis of transcriptomic data from the microarrays; (2) an in vitro study of the human vSMCs. In silico, we have shown that the involvement of KLF6 in the transcription of TGFB1 was specific to the vSMCs. Our results also identify potential new transcription factors (SLC2A4RG, GABP and SALL2) that are vSMC-specific and could promote the atheroprotective role of TGFB1 in carotid vSMCs. The balance between the FT activating or inhibiting the expression of TGFB1 allows the fine tuning of its transcription. Our in vitro approach showed that IL-1β induces in the vSMCs an inflammatory phenotype associated with an elastolytic activity resulting mainly from the increase in the expression of cathepsin S (CTSS). Neutralization of endogenous TGF-β in the vSMCs de-represses the expression of the CTSS and exerts an additive effect to that of IL-1β on the expression of the enzyme. In conclusion, the expression of TGFB1 in the vSMCs is submitted to a cell-specific transcriptional control. It is possible to develop pharmacological approaches that maintain the expression the expression of TGFB1 in the arterial wall at the level required allowing TGF-β1 to exert its atheroprotective effects