Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En France la prise en charge des grandes douleurs fait toute sa place à la morphine. Cependant la prise prolongée de morphine entraîne la tolérance et la dépendance. Une stratégie de protéomique différentielle a été entreprise afin d'identifier les adaptations cellulaires à un traitement par la drogue dans des cellules SH-SY5Y. Nous avons montré, notamment, qu'un traitement chronique entraîne la dégradation par le protéasome des protéines Gbeta et Ggamma2. Aussi, le niveau de dégradation de Gbeta est corrélé avec le niveau de sensibilisation de l'adénylyl cyclase (AC), phénomène impliqué dans la dépendance à la morphine. Globalement, l'analyse protéomique a permis de détecter environ 50 protéines et une centaine de phosphoprotéines modulées par la drogue. Mes travaux ont permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire responsable de la sensibilisation de l'AC et surtout suggèrent pour la première fois que le protéasome est impliqué dans les effets chroniques de la morphine.

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Les cellules ganglionnaires de la rétine (CGR) projettent dans le corps genouillé latéral dorsal (CGLd) et le colliculus supérieur (CS). Initialement, les projections établissent des connexions imprécises avec les cibles puis elles se raffinent grâce à des mécanismes activité-dépendant. D’abord, j’ai cherché à déterminer la contribution de la libération synaptique dans le raffinement des cartes visuelles en utilisant un modèle où Rim 1 et 2, protéines essentielles à la libération synaptique calcium-dépendante, sont délétées dans les CGRs. J’ai montré que la libération synaptique était nécessaire à la ségrégation œil spécifique dans le CGLd mais pas dans le CS, qu’elle était impliquée dans le raffinement de la topographie de la projection ipsilatérale mais qu’elle n’était pas impliquée dans la rétinotopie des projections controlatérales dans le CS. Ensuite, j’ai cherché à identifier un microdomaine de signalisation AMPc au niveau des cônes de croissance impliqué dans le raffinement des projections rétiniennes. La compartimentation spatiale des signaux AMPc pourrait expliquer qu’ils soient capables de réguler des voies de signalisation distinctes de façon spécifique. J’ai montré que la perturbation des signaux AMPc dans les radeaux lipidiques entraine des défauts de raffinement des projections dans le CS tandis que leur perturbation à la membrane mais en dehors des radeaux lipidiques n’entraine pas de défauts. J’ai aussi montré que la perturbation de la signalisation AMPc dans une petite fraction de CGRs d’un œil suffit à perturber largement la carte œil spécifique, suggérant une coopération entre les projections nécessaire à leur raffinement. / Retinal ganglion cells (RGCs) project to the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) and to the superior colliculus (SC). Initially, retinal projections establish imprecise connections with the target cells then refine through activity-dependent mechanisms.First, I studied the role of synaptic release in the visual maps refinement, using a mouse model where Rim 1 and 2, which are proteins important for calcium-dependent synaptic release, are deleted in the RGCs. I found that synaptic release is important for eye specific segregation in the dLGN but not in the SC, that it is involved in the refinement of the ipsilateral projection topography but that it is not involved in the contralateral projection retinotopy in the SC.Second, I identified a microdomain of cAMP signaling in growth cones involved in the refinement of retinal projections. The spatial compartmentation of cAMP signals could explain the fact that cAMP signals are able to regulate specifically different signaling pathways. I found that cAMP signals perturbation within the lipid rafts of the RGCs induces defects in the refinement of retinal projections in the SC while their perturbation at the membrane level but outside the lipid rafts does not induce defects.I also showed that cAMP signaling perturbation only in a fraction of RGCs in one eye is sufficient to extensively disturb the eye specific map, suggesting that a cooperation between the projections is necessary for their refinement.

L’AMPc est un messager important de la régulation neurohormonale du cœur. En activant ses effecteurs, l’AMPc régule de nombreuses fonctions cellulaires telles que l'expression de gènes, le couplage excitation-contraction et le métabolisme cellulaire. Chez les mammifères, l'AMPc est produit par une famille d’adénylate cyclases au sein de plusieurs compartiments subcellulaires solubles ou membranaires. L'existence et le rôle de la signalisation des nucléotides cycliques dans les mitochondries ont été postulés, mais n'ont pas encore été démontrés. De plus, son implication dans la régulation de la mort cellulaire est encore inconnue. Dans cette thèse, nous avons démontré l'expression locale de plusieurs acteurs de la signalisation de l'AMPc dans les mitochondries cardiaques, à savoir une forme tronquée soluble AC (sACt) et la protéine d'échange directement activées par AMPc 1 (Epac1). Nous avons montré un rôle protecteur pour sACt contre la mort cellulaire, l'apoptose, ainsi que la nécrose de cardiomyocytes primaires. Lors de la stimulation par du bicarbonate (HCO3-) et du Ca2+, la sACt produit de l’AMPc, qui à son tour stimule la consommation d'oxygène, une augmentation du potentiel mitochondrial de membrane (ΔΨm) et la production d'ATP. L’AMPc est limitant pour l’entrée matricielle de Ca2+ via l’uniport calcique mitochondrial (MCU) et, en conséquence, prévient la transition de perméabilité mitochondriale (MPT). En outre, dans les mitochondries isolées de cœurs de rats défaillants, la stimulation de la voie de l'AMPc par le HCO3- prévient la sensibilisation des mitochondries au Ca2+. Nous avons également constaté que les familles de phosphodiestérases (PDE), PDE2, 3 et 4, sont exprimées dans les mitochondries cardiaques régulant le taux d’AMPc. Ainsi, ces protéines forment une voie de signalisation locale dans la matrice régulant la fonction mitochondriale cardiaque. Finalement, notre étude a permis d’identifier un lien entre l'AMPc mitochondrial, le métabolisme, certaines PDEs et la mort cellulaire dans le cœur, qui est indépendant de la signalisation AMPc cytosolique. Ceci pourrait constituer un nouveau mécanisme cardioprotecteur via la préservation de la fonction mitochondriale dans un contexte physiopathologique. / CAMP is an important messenger in neurohormonal regulation of the heart. By activating its effectors, cAMP regulates many cellular functions such as gene expression, excitation-contraction coupling and cellular metabolism. In mammals, cAMP is produced by a family of adenylyl cyclase with various subcellular locations and membrane anchorage. The existence and role of cyclic nucleotide signaling in mitochondria has been postulated, but has not yet been demonstrated. Moreover, its implication in the regulation of cell death is still unknown. In this thesis, we demonstrated the local expression of several actors of cAMP signaling within cardiac mitochondria, namely a truncated form of soluble AC (sACt) and the exchange protein directly activated by cAMP 1 (Epac1) and showed a protective role for sACt against cell death, apoptosis as well as necrosis, in primary cardiomyocytes. Upon stimulation with bicarbonate (HCO3-) and Ca2+, sACt produces cAMP, which in turn stimulates oxygen consumption, increased the mitochondrial membrane potential (∆Ψm) and ATP production. cAMP is rate-limiting for matrix Ca2+ entry via the mitochondrial calcium uniporter (MCU) and, as a consequence, prevented mitochondrial permeability transition (MPT). In addition, in mitochondria isolated from failing rat hearts, stimulation of the mitochondrial cAMP pathway by HCO3- rescued the sensitization of mitochondria to Ca2+-induced MPT. We also found that PDE2, 3 and 4 families are located in cardiac mitochondria. They form a local signaling pathway with soluble AC in the matrix, which regulates cardiac mitochondrial functions. Thus, our study identifies a link between mitochondrial cAMP, mitochondrial metabolism, some PDEs and cell death in the heart, which is independent of cytosolic cAMP signaling. This might constitute a novel cardioprotective mechanism through mitochondrial function preservation in pathophysiological conditions.

L'objectif principal de ces travaux de thèse est de développer des modèles membranaires biomimétiques pour la reconstitution et l'étude d'interactions protéine/membrane. Dans ce but, deux approches sont adoptées : l'une mettant en œuvre une plateforme basée sur des nanoparticules de silice/Au recouvertes de lipides et l'autre comprenant la formation de bicouches lipidiques découplées d'un support solide d'or. Dans la première approche, nous avons synthétisé des particules de silice de taille nanométrique contenant des grains d'or inclus dans la matrice silicique. Ces nanoparticules sont ensuite recouvertes par différents phospholipides. Les propriétés plasmoniques acquises grâce aux grains d'or sont caractérisées puis utilisées pour suivre l'interaction avec les lipides et/ou les protéines. Le suivi de ces interactions est également visualisé par analyse de la mobilité électrophorétique des particules. La deuxième stratégie développée, consiste à assembler un système membranaire sur une surface solide d'or. Dans un premier temps, une couche de calmoduline est liée à la surface de manière stable. Dans un deuxième temps, une bicouche est formée au-dessus de la couche de calmoduline par deux méthodes. La première méthode consiste à ancrer la bicouche directement sur la couche de protéine par un mécanisme faisant intervenir des lipides chélateurs. Alors que dans la deuxième méthode les lipides sont liés à la surface et découplés grâce à l'utilisation d'une surface d'or modifiée par de la cystéamine et à des lipides fonctionnalisés. L'ancrage est assuré par des groupements succinimidyl et le découplage par des polymères de polyéthylène glycol porté sur un même lipide. Dans les deux stratégies, un réservoir sub-membranaire est créé entre la bicouche étanche et le support. Le suivi des constructions moléculaires est réalisé par résonance plasmonique de surface et analyse du retour de fluorescence. De plus le système est implémenté par des électrodes afin d'étudier l'effet d'application de potentiel sur la bicouche. Après caractérisation, le modèle membranaire est validé par la reconstitution de la translocation de la toxine CyaA de Bordetella pertussis. Cette protéine dispose en effet d'un mécanisme d'internalisation singulier qui permet d'explorer tout le potentiel de notre modèle membranaire. / The main objective of this work is to develop biomimetic membrane models for the reconstitution and study of protein/membrane interaction. Two devices were designed: one operate a nanometric platform composed of phospholipids coated lipid silica/Au nanoparticles, while the other including tethered lipid bilayer reconstitution on a gold surface. The first approach needs the synthesis of nanometer sized gold/silica particles and that are subsequently coated with different phospholipids. The plasmonic properties provided by gold seeds are characterized and they are of utility to follow the interaction between lipids and/or proteins at the surface. Following of these interactions was also realized with electrophoretic mobility analysis. The second biomimetic device involves a membrane assembly on a gold surface. In a first time, a calmodulin layer is bound on the surface. In a second time, a lipid bilayer is assembled above the calmodulin layer by two approaches. In the first approach the lipid bilayer is anchored on the protein layer with chelators lipid and His-Tag bearing by the proteins. While, in the second approach, lipids are bound on the surface and tethered with the use of a cysteamin modified gold surface and functionalized lipids. The anchorage is realized by succinimidyl group and the tethering by polyethylene glycol group wearing by one kind of lipid. A sub-membrane reservoir is created under the lipid bilayer. The biomimetic model formation was followed by plasmonic resonance and fluorescence recovery after photobleaching. After their characterization the tethered model is validated by reconstitution of a particular mechanism: the CyaA toxin from Bordetella pertussis translocation.