Lors des pathologies articulaires, les chondrocytes sont soumis à différents processus qui concourent à la dégradation du cartilage articulaire soit en entraînant la mort par apoptose (nonrenouvellement des constituants de la matrice) soit par l’activation de protéases détruisant les constituants matriciels. Le potentiel chondroprotecteur des protéines de stress (Hsp70 / Hsp27) lors des pathologies dégénératives ayant été démontré, nous avons souhaité évaluer l'intérêt thérapeutique de l’induction de ces protéines par un inhibiteur réversible du protéasome (MG132) dans un modèle expérimental : modèle par section du ligament croisé antérieur (SLCA). Au cours de cette étude, nous avons du évaluer un nouveau système de vectorisation afin de surexprimer les protéines de stress dans le cartilage articulaire. Cette technique (électroporation biphasique) repose sur la dissociation des impulsions perméabilisantes et électrophorétiques. Nous avons donc développé des plasmides nous permettant de surexprimer ces protéines, fusionnées à une protéine traceur, facilitant ainsi leur détection dans le tissu ciblé. Puis, nous avons évalué l’innocuité et l’efficacité des impulsions sur des tissus sains et pathologiques (dégénératifs et inflammatoires). Nous avons constaté que cette technique, en plus de limiter les altérations du tissu articulaire ou les phénomènes de dissémination, offrait des propriétés d’adressage tissulaire de part la multiplicité des combinaisons d’impulsions (nombre, fréquence et intensité). Enfin, les effets de l’induction (MG132) des Hsps sur un modèle physiopathologique (SLCA) ont été évalués et nous avons pu montrer une diminution de la sévérité des atteintes articulaires, tant au niveau du cartilage que de la membrane synoviale. Cette molécule non seulement permet à la fois de renforcer la résistance des chondrocytes aux atteintes mais également de limiter l’amplitude de la réponse inflammatoire qui participe à la dégradation. / During articular diseases, chondrocytes suffer different mechanisms which take part in the degradation of the cartilage, either by generating cell death by apoptosis (without renewal of extracellular matrix components), or by protease activation which destroy matrix components. Based on the cytoprotective potential of Heat Shock proteins (Hsp70 and Hsp27) during degenerative diseases, we evaluated the therapeutic interest of these proteins induced by a transient proteasome inhibitor (MG132), in an experimental model, by transection of the anterior cruciate ligament (ACLT). During this study, we have evaluated a new electroporation system to overexpress HSPs in articular cartilage. This technique is based on two sets of electric pulses, wich have two roles, to permeabilize the target and to transport DNA across the permeabilized membrane. We have developed expression vectors to generate a fusion protein (Hsps linked to GFP). Effectively, GFP permit to detect simply the fusion protein in the targeted tissue by fluorescence. Besides, we have evaluated safety and efficiency of electric pulses on healthy and alterated tissues (degenerative and inflammatory). We have reported that this technique could limit articular tissue damages and, moreover, could offer the ability to target more specifically this tissue. Indeed, this apparatus allows a great number of electrics pulses combinations (number, frequency, intensity). Finally, the effects of the induction via MG132 of Hsps in a physiopathological ACLT model, have been evaluated and we have shown a decrease of severity of joint lesions, in cartilage and synovial tissues. This molecule has the advantage to reinforce the resistance of chondrocytes at stressful stimuli and moreover, to limite the amplitude of inflammatory response which contribute to the magnification of extracellular matrix destruction.

Le protéasome 20S est un complexe protéique multicatalytique impliqué, de par ses activités protéolytiques, dans le contrôle d’une multitude de processus cellulaires. Outre des activités protéolytiques bien caractérisées, le protéasome 20S présente une activité RNasique, de nature endonucléasique. Chez les végétaux, l’activité RNasique associée au protéasome 20S est capable de dégrader les ARN du Tobacco mosaic virus (TMV, Tobamovirus) et du Lettuce mosaic virus (LMV, Potyvirus). La protéine HcPro du LMV a été démontrée comme interagissant avec le protéasome 20S et inhibant son activité RNasique. Nous avons montré pour la première fois que la sous-unité alpha-5 du protéasome 20S chez Arabidopsis thaliana est porteuse d’une activité RNasique, comme cela a été montré précédemment pour les animaux. Nous avons également identifié un acide aminé important pour l’activité RNasique. Nous nous sommes de plus penchés sur la compréhension du rôle in vivo de l’activité RNasique associée à la sous-unité alpha-5 du protéasome. Pour ce faire, nous avons étudié l’impact de la mutation KO de la sous-unité alpha-5 sur l’infection par des potyvirus. Aucun effet drastique n’a été observé, bien que la mutation KO d’un des deux gènes codant pour alpha-5 entraîne une augmentation de la sensibilité au LMV. Nous avons également généré des plantes transgéniques permettant d’éteindre ou de surexprimer alpha-5. Les résultats préliminaires obtenus sont présentés. / The 20S proteasome is a barrel shaped protein complex that plays a central role in many cellular processes because of its three protease activities. It is also associated in vitro with an endonucleasic activity that is very well conserved. In plants, 20S proteasome was found to target in vitro two viral RNA for degradation. Furthermore, it was reported that the Lettuce mosaic virus (LMV, Potyvirus) HcPro protein interferes in vitro with this activity. Since the available data concerning the plant proteasome endonucleasic activity were obtained from organisms belonging to different taxonomic groups, we decided to characterize Arabidopsis thaliana 20S proteasome RNase activity. Here we show for the first time that the A. thaliana proteasome alpha-5 subunit exhibits in vitro a RNase activity as it was previously observed for calf. We also identify an amino acid that is important for RNA degradation. We try to understand the potential alpha-5 RNase activity-associated mechanisms in vivo and the role of HcPro. We thus analyze alpha-5 KO mutants behaviour when faced to potyviral infection. No dramatic effect of the mutation was observed. We also generate transgenic plants that are currently under characterization.

La mitophagie, la dégradation sélective des mitochondries par autophagie, est impliquée dans l’élimination des mitochondries endommagées ou superflues et requiert des régulateurs et protéines spécifiques. Chez la levure, Atg32, localisée dans la membrane externe mitochondriale, interagit avec Atg8, et permet le recrutement des mitochondries et leur séquestration à l’intérieur des autophagosomes. Atg8 est conjuguée à de la phosphatidyléthanolamine et est ainsi ancrée aux membranes du phagophore et des autophagosomes. Chez la levure, plusieurs voies de synthèse de PE existent mais leur contribution dans l’autophagie et la mitophagie est inconnue. Dans le premier chapitre, nous avons étudié la contribution des différentes enzymes de synthèse de PE, dans l’induction de l’autophagie et la mitophagie et nous avons démontré que Psd1, la phosphatidylsérine décarboxylase mitochondriale, est impliquée dans la mitophagie seulement en condition de carence azotée alors que Psd2, localisée dans les membranes vacuolaires, endosomales et de l’appareil de Golgi, est nécessaire en phase stationnaire de croissance. Dans le second chapitre, la relation entre Atg32, la mitophagie et le protéasome a été étudiée. Nous avons démontré que l’activité du promoteur d’ATG32 et la quantité de protéine Atg32 exprimée sont inversement régulées. En phase stationnaire de croissance, l’inhibition du protéasome empêche la diminution de l’expression d’Atg32 et la mitophagie est stimulée. Nos données montrent ainsi que la quantité d’Atg32 est reliée à l’activité du protéasome et que cette protéine pourrait être ubiquitinylée. Dans le troisième chapitre, nous nous sommes intéressés au rôle potentiel de Dep1, un composant du complexe nucléaire Rpd3 d’histones déacétylases, dans la mitophagie. Dans nos conditions, Dep1 semble être mitochondriale et elle est impliquée dans la régulation de la mitophagie. BRMS1L (Breast Cancer Metastasis suppressor 1-like) est l’homologue de Dep1 chez les mammifères. Cette protéine possède un rôle anti-métastatique dans des lignées de cancer du sein. Nous avons trouvé que l’expression de BRMS1L augmente en présence de stimuli pro-mitophagie. / Mitophagy, the selective degradation of mitochondria by autophagy, is implicated in the clearance of superfluous or damaged mitochondria and requires specific proteins and regulators. In yeast, Atg32, an outer mitochondrial membrane protein, interacts with Atg8, promoting mitochondria recruitment to the phagophore and their sequestration within autophagosomes. Atg8 is anchored to the phagophore and autophagosome membranes thanks to phosphatidylethanolamine (PE). In yeast, several PE synthesis pathways have been characterized, but their contribution to autophagy and mitophagy is unknown. In the first chapter, we investigated the contribution of the different enzymes responsible for PE synthesis in autophagy and mitophagy and we demonstrated that Psd1, the mitochondrial phosphatidylserine decarboxylase, is involved in mitophagy induction only in nitrogen starvation, whereas Psd2, located in vacuole/Golgi apparatus/endosome membranes, is required preferentially for mitophagy induction in stationary phase of growth. In the second chapter, we were interested in the relationship between Atg32, mitophagy and the proteasome. We demonstrated that ATG32 promoter activity and protein expression are inversely regulated. During stationary phase of growth, proteasome inhibition abolishes the decrease in Atg32 expression and mitophagy is enhanced. Our data indicate that Atg32 protein is regulated by the proteasome activity and could be ubiquitinated. In the third chapter, we investigated the involvement of Dep1, a member of the nuclear Rpd3L histone deacetylase complex, in mitophagy. In our conditions, Dep1 seems to be located in mitochondria and is a novel effector of mitophagy both in nitrogen starvation and stationary phase of growth. BRMS1L (Breast Cancer Metastasis suppressor 1-like) is the mammalian homolog of Dep1 and has been described in breast cancer metastasis suppression. We found that BRMS1L protein expression increases upon pro-mitophagy stimuli.

L’isoforme p200CUX1 est un répresseur transcriptionnel qui est clivé dans les NIH3T3 par la cathepsin L en isoforme pllOCUXl laquelle acquiert alors la capacité d’activer la transcription des gènes cibles. Dans le système digestif, CUX1 est exprimé dans l’iléon et le côlon proximal chez la souris adulte. Aucun rôle dans le contexte de l’épithélium colique n’a été attribué à ce jour aux isoformes p200CUX1 et p110CUX1. Le but de cette Thèse a donc été d’investiguer l’implication de p200CUX1 et p110CUX1 dans l’épithélium colique ainsi que dans la carcinogenèse colorectale. Une étude différentielle par criblage de micropuces à ADN a permis d’identifier le gène PLZF comme cible transcriptionnelle de CUX1 dans le côlon. Une analyse informatique a prédit 15 sites de liaison potentiels pour CUX1 dans la portion 5’-UTR et dans une région de 776 p.b. du promoteur du gène PLZF. Des essais de gel de rétention et d’immunoprécipitation de la chromatine ont démontré une interaction de CUX1 avec certains sites prédits du gène PLZF in vitro et in vivo. Des essais transcriptionnels ont rapporté une diminution de deux fois de l’activité transcriptionnelle du promoteur du gène PLZF par CUX1. Les sites # 13, 14 et 15 du promoteur du gène PLZF ont été identifiés comme étant les sites préférentiellement liés par CUX1. Une analyse Western a permis d’établir un patron d’expression réciproque entre les cellules qui expriment CUX1 et celles qui expriment PLZF. Ces travaux ont également permis d’identifier un nouveau mécanisme intracellulaire impliqué dans la production de l’isoforme p11OCUX1. Un traitement des cellules 293T, T84 et Caco2/15 avec deux inhibiteurs du protéasome, soit le MG132 et le bortezomib, résulte en une diminution de l’expression de l’isoforme p11OCUX1. Une rapide accumulation de l’isoforme p200CUX1 est observée après 4 heures de traitement des cellules T84 au MG132. L’utilisation d’extraits de protéines cytoplasmiques et nucléaires suggère que la protéolyse limitée de l’isoforme p200CUX1 en p11OCUX1 prend place dans le noyau. Une expérience de dégradation in vitro confirme que le protéasome est la seule protéase responsable du clivage protéolytique. Une analyse informatique de la séquence en acides aminés de CUX1 a prédit quatre régions susceptibles d’être clivées par le protéasome. Enfin, le présent travail a tenté de démystifier le rôle de p11OCUX1 dans la prolifération des cellules épithéliales intestinales et coliques. Les résultats montrent que l’isoforme p110CUX1 n’est pas un agent transformant. Sa surexpression dans les cellules IEC-6 et DLD-1 ne mène pas à une modulation de la vitesse de prolifération cellulaire. Aucune polype n’est visible au niveau de l’intestin grêle et/ou du côlon suite à la surexpression de p11OCux1 et ce, même après une période latente de 12 mois. L’abolition de l’expression des isoformes de CUX1 par interférence à l’ARN dans les cellules IEC-6 conduit à une diminution significative de la prolifération cellulaire, alors que dans les cellules T84 et DLD-1, il y a un ralentissement modeste de la croissance cellulaire. Les cellules DLD-1 shCUX1 ne forment pas moins de colonies en indépendance d'ancrage. Les résultats de cette étude démontrent que le gène PLZF est une cible de CUX1, que le protéasome est impliqué dans la protéolyse limitée de p200CUX1 en p110CUX1 et que p110CUX1 n’est pas impliquée dans la prolifération des cellules épithéliales intestinales et coliques et de cancer du côlon chez l’humain.

Le protéasome est responsable de la dégradation régulée d'une majeure partie des protéines intracellulaires. Cette machinerie multimoléculaire est composée d'un cœur catalytique, le protéasome 20S, qui peut être activé par plusieurs types de protéines régulatrices, en particulier la particule régulatrice 19S ou PA700, les complexes heptamériques formés par les membres de la famille 11S (ou PA28) et PA200. Au cours de ce travail, nous nous sommes focalisés sur PA28gamma, un régulateur nucléaire du protéasome, qui active la dégradation de plusieurs substrats par le protéasome 20S de façon indépendante de l'ubiquitine et de l'ATP. Malgré de multiples études montrant l'implication de PA28gamma dans de nombreux processus cellulaires essentiels tels que le cycle cellulaire, la prolifération, l'apoptose, l'architecture nucléaire, la dynamique de la chromatine, les infections virales et la réponse au stress, ses fonctions exactes ne sont pas encore comprises. De plus, les mécanismes impliqués dans la régulation de l'activité de PA28gamma et de son association avec le protéasome 20S restent mystérieux. Une analyse SILAC des partenaires d'interaction de PA28gamma endogène a révélé l'existence d'un nouveau facteur, non caractérisé, que nous avons appelé PIP30 (PA28gamma Interacting Protein 30 kDa). Le gène PIP30 contient un domaine très conservé chez les Eucaryotes. Nous avons produit et purifié la protéine PIP30 recombinante et montré qu'elle est faiblement structurée, malgré le fait qu'elle puisse se dimériser. Nous avons confirmé, aussi bien in vitro qu'in cellulo, que PIP30 interagit directement et spécifiquement avec PA28gamma. En analysant la co-immunoprécipitation de PA28gamma avec différents mutants tronqués de GFP-PIP30, nous avons pu identifier la séquence de PIP30 responsable de l'interaction avec PA28gamma dans sa partie C-terminale. Nous essayons maintenant d'identifier la séquence de PA28gamma impliquée dans la liaison de PIP30 et de cristalliser le complexe PA28gamma/PIP30. L'élaboration d'un anticorps anti-PIP30 « maison » nous a permis de montrer que PIP30 est une protéine nucléaire stable. Son niveau d'expression diminue en réponse à la déplétion de PA28gamma, ce qui suggère que PIP30 est stabilisée par son interaction avec PA28gamma in cellulo. Nous avons démontré in vitro que PIP30 inhibe partiellement l'activation médiée par PA28gamma des activités de type chymotrypsine et caspase, mais pas trypsine, du protéasome. Cependant, nous avons montré, par une approche ELISA, que PIP30 n'affecte pas la liaison de PA28gamma au protéasome 20S. Par ailleurs, nous avons testé l'effet de PIP30 sur la dégradation de p21 par le complexe PA28gamma/protéasome 20S et observé que PIP30 augmente la vitesse de dégradation de p21 dans ce test. Nos tentatives pour élucider la fonction exacte de PIP30 in cellulo n'ont jusqu'ici pas abouti à une conclusion convaincante. L'ensemble de ces résultats suggère que PIP30 pourrait être impliqué dans le recrutement sélectif des substrats de PA28gamma et/ou dans la modulation de l'activation du protéasome par PA28gamma. / The proteasome is responsible for the regulated degradation of most intracellular proteins. This multi-subunit machinery is composed of a common catalytic core, the 20S proteasome, which can be activated by various types of regulators, notably the 19S regulatory particle or PA700, the heptameric complexes formed by the members of the 11S (or PA28) family and PA200. This work has been focused on PA28gamma, a nuclear regulator of the proteasome, which has been shown to activate degradation of several proteasomal substrates in an ATP- and ubiquitin- independent manner. Despite many evidences revealing the involvement of PA28gamma in many essential cellular processes, such as cell cycle progression, proliferation, apoptosis, nuclear architecture, chromatin dynamics, viral infection and stress response, its exact function(s) remain to be understood. In addition, how PA28gamma activity and association to the 20S proteasome are regulated is completely unclear. A SILAC-based analysis of endogenous PA28gamma interaction partners revealed the existence of a novel, completely uncharacterized protein, which we called PIP30 (PA28gamma Interacting Protein 30 kDa). Evolutionary analysis indicates that PIP30 gene contains a domain highly conserved in Eukaryotes, without any alternative splicing or gene duplication evidences. We produced and purified the recombinant PIP30 protein and showed that it is poorly structured, although it is able to make dimers. We confirmed both in vitro and in cellulo that PIP30 directly and specifically interacts with PA28gamma. By analyzing the co-immunoprecipitation of PA28gamma with various GFP-PIP30 truncation mutants, we identified the sequence of PIP30 responsible for PA28gamma binding in its C-terminal part. Ongoing analyses now focus on the identification of PIP30 binding motif on PA28gamma sequence and the crystallization of the PA28gamma-PIP30 complex. Using homemade anti-PIP30 antibodies, we showed that PIP30 is a stable nuclear protein. Its expression level is decreased in response to PA28gamma depletion, suggesting that it is stabilized by its interaction with PA28gamma in cellulo. We demonstrated in vitro that PIP30 partially inhibits PA28gamma-mediated activation of the chymotrypsin- and caspase-, but not the trypsin-like, activities of the proteasome. However, we showed by an ELISA-based approach that PIP30 does not affect PA28gamma binding to 20S. Considering the limitations of probing proteasome activity with small fluorogenic substrates, we tested the effect of PIP30 on the PA28gamma-dependent proteasomal degradation of in vitro translated p21, a known protein substrate of PA28gamma. We unexpectedly found that PIP30 enhanced the rate of p21 degradation. Our attempts to elucidate the exact functions of PIP30 in cellulo were unsuccessful so far. Altogether, our results suggest that PIP30 could be involved in the selective recruitment of PA28gamma protein substrates and/or modulate PA28gamma-mediated proteasome activation.

Caspase-7 is a member of a family of cysteine proteases that includes apoptotic initiators (caspases-8, -9 and -10) and executors (caspases-3, -6 and -7). During apoptosis, executioner caspases are cleaved by initiator caspases either by the extrinsic (death receptors) or by the intrinsic (mitochondrial) pathway of caspase activation. Caspase-7 is an obligate dimer in the cell and cleavage of the interdomain connector (IDC), which split the catalytic domain in two subunits, at either site 1 or site 2 allows the conversion of the enzyme from the zymogen (inactive) state to the active state through a conformation switch that leads to the creation of a substrate binding pocket and the catalytic site. During caspase-7 activation, a 23-residue N-terminal peptide is also cleaved. Consequently, caspase-7 displays different N-terminal residues from those of its zymogen. This can change the stability of caspase-7 according to the N-end rule, which relates the half-life of a protein with the residue presented at its N-terminus. This degradation pathway controls the ubiquitination of the protein based on the N-terminus. To replicate the different forms of caspase-7 produced during its activation process in a controlled manner, a TEV protease cleavage site [ENLYFQ[arrow down](S/A)] was strategically inserted to mimic the different possibilities of IDC cleavage: 1) cleavage at site 1 only, 2) cleavage at site 2 only, or 3) a double cleavage. This was done in order to obtain the N-terminal residues normally presented during the cleavage of caspase-7. These constructions have been also optimized to preserve the proteolytic activity of the enzyme with as little change as possible to the length of the IDC. These constructs were cleaved by TEV protease in vitro and in cellulo and allowed the activation of apoptosis. Furthermore, the cellular half-life of caspase-7 seems to be changed by its cleavage. In conclusion, we have developed an interesting tool for the study of caspase-7.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

HslVU est une protéase dépendante de l'ATP découverte initialement chez certaines bactéries, et considérée comme une forme ancestrale du protéasome. Elle est constituée par l'association de deux sous-complexes : la protéase HslV, formée elle-même de deux anneaux hexamériques de la sous-unité HslV, et l'ATPase HslU, un hexamère de la sous-unité HslU, qui active l'activité peptidasique de HslV en s'associant à l'une ou à ses deux extrémités. HslVU a été identifiée dans la mitochondrie de protozoaires parasites, dont ceux de la famille des trypanosomatidae comme Leishmania major (agent de la leishmaniose) et Trypanosoma brucei (agent de la maladie du sommeil). Différents travaux ont montré que, chez T. brucei, l'inactivation d'HslVU par interférence ARN conduit à l'arrêt de la division cellulaire et à la mort du parasite. Puisqu'elle est absente chez l'homme, HslVU constitue donc une cible thérapeutique potentielle intéressante pour lutter contre ces parasites. Dans le cadre d'un projet collaboratif, le but de ma thèse était de caractériser la protéase HslVU de Leishmania major (LmHslVU), et de tester l'intérêt d'exploiter la symétrie de HslV pour développer des inhibiteurs empêchant la formation du complexe HslVU en se fixant à l'interface HslV/HslU. Dans ce contexte, ma thèse s'est développée autour de 3 axes principaux : (i) Production et caractérisation biochimique de LmHslV recombinant. J'ai montré que le complexe LmHslV seul est inactif, contrairement à son homologue bactérien qui a une activité basale même sans HslU, et qu'il peut être activé par des peptides synthétiques correspondant à l'extrémité C-terminale de son régulateur HslU, comme HslV d'E.coli et d'H.influenzae. Cela m'a permis de développer un test de l'activité peptidasique de LmHslV in vitro, miniaturisable pour un futur criblage de banques de molécules chimiques. La protéase LmHslV a également été caractérisée en testant l'effet de différents inhibiteurs de protéases sur son activité. Ce travail m'a également permis de montrer que l'activité peptidasique de HslV est très sensible à la présence d'ions Mg2+ dans les tampons d'activité, ce qui suggère qu'il existe des régulations allostériques des sites actifs de la protéase. (ii) Exploiter la symétrie de HslV pour développer des interacteurs multivalents de HslV. Nous avons cherché à vérifier expérimentalement si le fait d'utiliser des molécules multivalentes, c'est à dire possédant plusieurs sites d'interaction à HslV, permettait d'augmenter sensiblement l'affinité de ces molécules. Une molécule pentamérique, le « peptabody », capable de se fixer sur LmHslV via cinq sites d'interaction potentiels et agissant comme un inhibiteur de l'activité peptidasique de HslV, a été développée.(iii) Caractérisation du mode d'activation de LmHslV. Nous avons réalisé en collaboration des expériences de microscopie électronique sur LmHslV, qui ont révélé une possible rotation des deux anneaux de LmHslV liée à l'activation de la protéase. Cette rotation est spécifique de LmHslV puisqu'on ne l'observe pas chez HslV d'E. coli. La confirmation de ces résultats encore préliminaires est en cours. / HslVU is an ATP-dependent protease initially discovered in certain bacteria, and considered as a proteasome ancestor. It is formed by assembly of two subcomplexes: the HslV protease, itself resulting from the assembly of two hexameric rings of the HslV subunit, and the HslU ATPase, an hexamer of the HslU subunit that activates HslV upon binding.HslVU has been identified within the mitochondrion of protozoan parasites, including the Trypanosomatids Leishmania major (leishmaniasis) and Trypanosoma brucei (sleeping sickness). Different results have shown that inactivation by siRNA of HslVU leads in T. brucei to growth arrest and cell death. Since HslVU is absent in human, it thus represents an attractive drug target for the fight against these parasites. In the frame of a collaborative project, the objective of my thesis was to characterize the HslVU protease of Leishmania major (LmHslVU) and to assess the interest of exploiting HslV symmetry to develop inhibitory molecules that would block the formation of the HslVU complex by binding at the HslV/HslU interface.In this context, I studied three main issues during my PhD thesis:(i) Production and biochemical characterization of recombinant LmHslV: I could show that the HslV complex alone is inactive, contrary to its bacterial homolog which has a basal activity even in the absence of HslU, and that, as E. coli HslV, it can be activated by synthetic peptides corresponding to the C-terminal end of HslU. This work allowed me to develop an in vitro assay of HslV peptidase activity, that can be miniaturized for future screenings of chemical libraries. The active site of the LmHslV protease has also been characterized by testing the effect of different protease inhibitors on the peptidase activity. During this work, I could show that LmHslV activity is sensitive to Mg2+ ions in the activity buffers, suggesting the existence of allosteric regulations of the active sites.(ii) To exploit HslV symmetry to develop multivalent interactors of HslV. Our goal was to experimentally verify whether the use of multivalent molecules, i.e. molecules with several interaction sites to HslV, could help to develop high affinity inhibitors. A pentameric molecule, called the “peptabody”, able to bind to HslV via five interaction sites and acting as a strong inhibitor of HslV, has been developed.(iii) Characterization of the mode of activation of HslV. We performed through a collaboration electronic miscroscopy analyses of LmHslV, which revealed that the activation of the protease could be linked to a possible rotation of its two rings. Such rotation was not seen with E. coli HslV, suggesting that it is a mechanism specific of LmHslV. Study are ongoing to confirm these results.

Les mitochondries sont des organites semi autonomes, capables d’autoréplication, qui varient en nombre, en taille et en forme dans le cytoplasme de presque toutes les cellules eucaryotes. Elles sont notamment connues pour être les fournisseurs d’énergie de la cellule. Afin de mener à bien ce rôle, les mitochondries sont capables de fusionner et de se diviser, ce qui permet un contrôle de la forme du réseau mitochondrial. Le contrôle de ces évènements et la forme du réseau qui en résulte sont connus sous le nom de dynamique mitochondriale. Cette dynamique répond à de nombreux stimuli cellulaires et est très régulée. Récemment, il a été montré que le système ubiquitine-protéasome régule la fusion des mitochondries et qu’une des sous unités du protéasome contrôlait la fission des mitochondries. Le système ubiquitine-protéasome est un mécanisme qui repose sur plusieurs acteurs : les enzymes qui vont reconnaître les protéines cibles de ce système, une protéine appelée ubiquitine qui sert pour le marquage des protéines cibles et un complexe multi-protéique appelé protéasome effecteur de la dégradation des protéines cibles. Connu uniquement à l’origine pour son rôle dans la dégradation des protéines cibles, il est apparu dans les dernières années que le rôle de ce système ou de ses composants en dehors de ce système était bien plus vaste. Les études effectuées au laboratoire avaient déjà montré que Rpn11, une sous-unité du protéasome, régulait la fission des mitochondries indépendamment de l’activité protéolytique du protéasome. Le travail présenté ici porte sur le mécanisme d’action du domaine C-terminal de Rpn11 sur divers processus cellulaires tels que l’assemblage du protéasome, la régulation de la fission des mitochondries et des peroxysomes, la longévité cellulaire ou la formation de « Proteasome Storage Granule ». Ce manuscrit présente aussi le travail effectué pour trouver les partenaires qui permettent la régulation de la fission des mitochondries avec le domaine C-terminal de Rpn11 ainsi que l’étude de la localisation in vivo de Rpn11. / Mitochondria are semi-autonomous organelles, which size, shape and number vary in a wide range in almost every eukaryotic cell. They are famous to be the energy producer of the cells. For this purpose, mitochondria are able to fuse and divide. These events of fusion and fission are also known as the mitochondrial dynamic. This phenomenon is highly controlled and answers to many stimuli. Lately, it has been shown that the ubiquitin proteasome system controls the fusion of mitochondria and that a proteasome subunit controls the mitochondrial fission. The ubiquitin proteasome system is a mechanism that relies on many actors: enzymes recognizing the targets of this system, a protein called ubiquitin and a complex called proteasome in charge of the degradation of the targets. Primarily known for the protein degradation, many investigations suggest that this system has other roles. Our previous studies had already shown that the proteasome subunit named Rpn11 controls the fission of mitochondria independently of the proteolytic activities of the proteasome system. The work shown in this manuscript is focused on the mechanism of action of the C-terminus domain of Rpn11 on various cellular processes, including proteasome assembly, control of mitochondrial and peroxisomal fission, yeast lifespan and also the “Proteasome Storage Granule” formation. The in vivo localisation of Rpn11 and the elucidation of its partners on the mitochondrial fission regulation were also investigated.