Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / La protéine de l'adénovirus humain E4orf4 (Early region 4 open reading frame 4) induit un programme de MC programmée indépendant des caspases chez les cellules transformées et cancéreuses. Des données indiquent qu'E4orf4 pourrait fournir un outil moléculaire pour obtenir des connaissances plus approfondies sur la façon de manipuler les fonctions oncogéniques afin d'induire sélectivement le suicide des cellules cancéreuses. Les travaux du laboratoire indiquent que la cytotoxicité d'E4orf4 repose sur sa capacité à perturber le trafic des endosomes de recyclage (ERs) via l'action concertée des kinases de la famille Src (KFS), de la RhoGTPase Cdc42 et de l'actine. Ces perturbations stimulent le transport des ERs dirigés par Rab11a vers le trans-Golgi et la fragmentation du Golgi, laquelle contribue à la progression de la MC. Les travaux présentés dans ce mémoire visent à déterminer la contribution de cette nouvelle voie de signalisation (contrôlant le trafic des ERs) dans le remodelage des organites en réponse au stress. Pour ce faire, la staurosporine (STS), un inhibiteur de kinases à large spectre induisant plusieurs mécanismes de MC, a été utilisé comme modèle principal. Les résultats indiquent que la STS perturbe le trafic des ERs et stimule leur translocation vers les membranes du trans-Golgi, lesquelles sont subséquemment fragmentées. Ces évènements sont indépendants des caspases et contribuent à la MC. En outre, la mobilisation des ERs induite par la STS est médiée par les KFS, Cdc42 et l'actine, tout comme la fragmentation du Golgi. De plus, j'ai démontré que la fragmentation du Golgi induite par la STS en absence de caspases contrôle partiellement la fission apoptotique des mitochondries, une organelle ayant un rôle central dans la signalisation de plusieurs modes de MC. Finalement, j'ai évalué la contribution de cette voie de transport rétrograde à l'activation des caspases. Les résultats préliminaires suggèrent que les GTPases Rab11a et Cdc42 jouent un rôle en amont de l'activation des caspases effectrices. Nous proposons que les signaux de stress stimulent la mobilisation des ERs, lesquels pourraient délivrer des lipides et des protéines de signalisation contribuant au remodelage des organelles et à la communication inter-organites orchestrant l'activation de multiples mécanismes de MC, tout au moins, dans le contexte de cellules cancéreuses.

Thèse (M.Sc. )--Université Laval, 2004. / Titre de l'écran-titre (visionné le 29 novembre 2004). Bibliogr.

En 2020, la malaria a provoqué 241 millions de cas d'infections et 627 000 morts. La faible efficacité du vaccin disponible et la résistance aux traitements rendent indispensable l'identification de cibles thérapeutiques. Plasmodium falciparum (Pf) envahit les érythrocytes pour s'y répliquer. Pour cela, de protéines contenues dans des organites d'invasion, tels que les micronèmes et les rhoptries rassemblés à un complexe apical, sont sécrétées. Le trafic des protéines entre l'appareil de Golgi et les organites d'invasion est médié par la PfSortiline. Dans les organismes modèles, la sortiline est recyclée entre les organites cibles et l'appareil de Golgi via le complexe protéique rétromère composé des protéines de tri vacuolaire (Vps) Vps26-29-35. Ce complexe est recruté via les complexes VpsC, composé de Vps11-16-18-33, CORVET composé de Vps3-8 et HOPS, composé de Vps39-41. Chez Pf, l'ensemble des composants des complexes VpsC et rétromère sont conservés. Seulement PfVps3 du complexe CORVET est retrouvée et le complexe HOPS est absent. L'hypothèse du projet est que ces protéines conservées sont impliquées dans la biogenèse des organites du complexe apical via le recyclage de la PfSortiline vers l'appareil de Golgi. Pour vérifier cela, des souches de parasites exprimant les protéines de fusion PfVps3-11-16-18-29 étiquetées à un domaine GFP ont été construites. Des techniques de Western Blot et de microscopie à fluorescence ont montré que ces protéines de fusion sont exprimées lors du cycle érythrocytaire. Il semble que PfVps29-GFP localise à des structures semblables aux endosomes et partiellement aux micronèmes. Les protéines PfVps16-18-GFP semblent localiser aux micronèmes et partiellement aux rhoptries et à l'appareil de Golgi. Finalement, des souches dans lesquelles les protéines PfVps3-16-29-GFP peuvent être délocalisées de façon conditionnelle ont été construites. Il a été montré que PfVps16-GFP semble essentielle à la survie de Pf. Ce projet participe à la caractérisation de nouvelles pistes thérapeutiques antipaludiques. / Malaria was responsible for 627,000 deaths and 241 million infections in 2020 alone. Drug resistance, and the poor efficacy of the only available vaccine, are strong arguments supporting the need to identify therapeutic targets. The malaria parasite Plasmodium falciparum (Pf) invades erythrocytes and multiplies inside them. To do so, it secretes invasion proteins located inside organelles, like micronemes and rhoptries, which are localised at an apical complex. Protein trafficking from the Golgi apparatus to these organelles is dependent on PfSortilin. In model organisms, this protein is recycled between the target organelles and the Golgi Apparatus by a protein complex called retromer. This complex is composed of Vacuolar Sorting Proteins (Vps)-26-29-35. The retromer complex is recruited by complexes, composed of Vps11-16-18-33, CORVET, composed of Vps3-8, and HOPS, composed of Vps39-41. In Pf, all components of the retromer and the VpsC complexes are conserved. However, only PfVps3 of the CORVET complex is conserved and the HOPS complex is absent. We hypothesized that conserved proteins play a key role in apical complex biogenesis by recycling PfSortilin to the Golgi apparatus. To verify the hypothesis, parasite strains coding the fusion proteins PfVps3-11-16-18-29 tagged with a GFP were generated. Western Blot and fluorescence microscopy showed that those proteins are expressed during the erythrocyte life cycle. PfVps29-GFP seemed to localize at endosome-like structures and partially at micronemes. PfVps16-18 seemed to localise at micronemes too and partially at rhoptries and at the Golgi apparatus. Finally, strains where PfVps3-16-29 could be functionally mislocalized have been generated. This technique showed that PfVps16-GFP were essential for Pf survival. Our work could lead to the characterization of new antimalarial drug targets.

En 2020, la malaria a provoqué 241 millions de cas d'infections et 627 000 morts. La faible efficacité du vaccin disponible et la résistance aux traitements rendent indispensable l'identification de cibles thérapeutiques. Plasmodium falciparum (Pf) envahit les érythrocytes pour s'y répliquer. Pour cela, de protéines contenues dans des organites d'invasion, tels que les micronèmes et les rhoptries rassemblés à un complexe apical, sont sécrétées. Le trafic des protéines entre l'appareil de Golgi et les organites d'invasion est médié par la PfSortiline. Dans les organismes modèles, la sortiline est recyclée entre les organites cibles et l'appareil de Golgi via le complexe protéique rétromère composé des protéines de tri vacuolaire (Vps) Vps26-29-35. Ce complexe est recruté via les complexes VpsC, composé de Vps11-16-18-33, CORVET composé de Vps3-8 et HOPS, composé de Vps39-41. Chez Pf, l'ensemble des composants des complexes VpsC et rétromère sont conservés. Seulement PfVps3 du complexe CORVET est retrouvée et le complexe HOPS est absent. L'hypothèse du projet est que ces protéines conservées sont impliquées dans la biogenèse des organites du complexe apical via le recyclage de la PfSortiline vers l'appareil de Golgi. Pour vérifier cela, des souches de parasites exprimant les protéines de fusion PfVps3-11-16-18-29 étiquetées à un domaine GFP ont été construites. Des techniques de Western Blot et de microscopie à fluorescence ont montré que ces protéines de fusion sont exprimées lors du cycle érythrocytaire. Il semble que PfVps29-GFP localise à des structures semblables aux endosomes et partiellement aux micronèmes. Les protéines PfVps16-18-GFP semblent localiser aux micronèmes et partiellement aux rhoptries et à l'appareil de Golgi. Finalement, des souches dans lesquelles les protéines PfVps3-16-29-GFP peuvent être délocalisées de façon conditionnelle ont été construites. Il a été montré que PfVps16-GFP semble essentielle à la survie de Pf. Ce projet participe à la caractérisation de nouvelles pistes thérapeutiques antipaludiques. / Malaria was responsible for 627,000 deaths and 241 million infections in 2020 alone. Drug resistance, and the poor efficacy of the only available vaccine, are strong arguments supporting the need to identify therapeutic targets. The malaria parasite Plasmodium falciparum (Pf) invades erythrocytes and multiplies inside them. To do so, it secretes invasion proteins located inside organelles, like micronemes and rhoptries, which are localised at an apical complex. Protein trafficking from the Golgi apparatus to these organelles is dependent on PfSortilin. In model organisms, this protein is recycled between the target organelles and the Golgi Apparatus by a protein complex called retromer. This complex is composed of Vacuolar Sorting Proteins (Vps)-26-29-35. The retromer complex is recruited by complexes, composed of Vps11-16-18-33, CORVET, composed of Vps3-8, and HOPS, composed of Vps39-41. In Pf, all components of the retromer and the VpsC complexes are conserved. However, only PfVps3 of the CORVET complex is conserved and the HOPS complex is absent. We hypothesized that conserved proteins play a key role in apical complex biogenesis by recycling PfSortilin to the Golgi apparatus. To verify the hypothesis, parasite strains coding the fusion proteins PfVps3-11-16-18-29 tagged with a GFP were generated. Western Blot and fluorescence microscopy showed that those proteins are expressed during the erythrocyte life cycle. PfVps29-GFP seemed to localize at endosome-like structures and partially at micronemes. PfVps16-18 seemed to localise at micronemes too and partially at rhoptries and at the Golgi apparatus. Finally, strains where PfVps3-16-29 could be functionally mislocalized have been generated. This technique showed that PfVps16-GFP were essential for Pf survival. Our work could lead to the characterization of new antimalarial drug targets.

Les mitochondries sont des organites semi autonomes, capables d’autoréplication, qui varient en nombre, en taille et en forme dans le cytoplasme de presque toutes les cellules eucaryotes. Elles sont notamment connues pour être les fournisseurs d’énergie de la cellule. Afin de mener à bien ce rôle, les mitochondries sont capables de fusionner et de se diviser, ce qui permet un contrôle de la forme du réseau mitochondrial. Le contrôle de ces évènements et la forme du réseau qui en résulte sont connus sous le nom de dynamique mitochondriale. Cette dynamique répond à de nombreux stimuli cellulaires et est très régulée. Récemment, il a été montré que le système ubiquitine-protéasome régule la fusion des mitochondries et qu’une des sous unités du protéasome contrôlait la fission des mitochondries. Le système ubiquitine-protéasome est un mécanisme qui repose sur plusieurs acteurs : les enzymes qui vont reconnaître les protéines cibles de ce système, une protéine appelée ubiquitine qui sert pour le marquage des protéines cibles et un complexe multi-protéique appelé protéasome effecteur de la dégradation des protéines cibles. Connu uniquement à l’origine pour son rôle dans la dégradation des protéines cibles, il est apparu dans les dernières années que le rôle de ce système ou de ses composants en dehors de ce système était bien plus vaste. Les études effectuées au laboratoire avaient déjà montré que Rpn11, une sous-unité du protéasome, régulait la fission des mitochondries indépendamment de l’activité protéolytique du protéasome. Le travail présenté ici porte sur le mécanisme d’action du domaine C-terminal de Rpn11 sur divers processus cellulaires tels que l’assemblage du protéasome, la régulation de la fission des mitochondries et des peroxysomes, la longévité cellulaire ou la formation de « Proteasome Storage Granule ». Ce manuscrit présente aussi le travail effectué pour trouver les partenaires qui permettent la régulation de la fission des mitochondries avec le domaine C-terminal de Rpn11 ainsi que l’étude de la localisation in vivo de Rpn11. / Mitochondria are semi-autonomous organelles, which size, shape and number vary in a wide range in almost every eukaryotic cell. They are famous to be the energy producer of the cells. For this purpose, mitochondria are able to fuse and divide. These events of fusion and fission are also known as the mitochondrial dynamic. This phenomenon is highly controlled and answers to many stimuli. Lately, it has been shown that the ubiquitin proteasome system controls the fusion of mitochondria and that a proteasome subunit controls the mitochondrial fission. The ubiquitin proteasome system is a mechanism that relies on many actors: enzymes recognizing the targets of this system, a protein called ubiquitin and a complex called proteasome in charge of the degradation of the targets. Primarily known for the protein degradation, many investigations suggest that this system has other roles. Our previous studies had already shown that the proteasome subunit named Rpn11 controls the fission of mitochondria independently of the proteolytic activities of the proteasome system. The work shown in this manuscript is focused on the mechanism of action of the C-terminus domain of Rpn11 on various cellular processes, including proteasome assembly, control of mitochondrial and peroxisomal fission, yeast lifespan and also the “Proteasome Storage Granule” formation. The in vivo localisation of Rpn11 and the elucidation of its partners on the mitochondrial fission regulation were also investigated.

Thèse doctorat : Aspects Moléculaires et Cellulaires de la Biologie : Strasbourg 1 : 2006. / Titre provenant de l'écran-titre. Bibliogr. 12 p.

L'intégrité des membranes cellulaires est essentielle à la survie et au bon fonctionnement de la cellule. Or, ces membranes sont constamment endommagées. La première partie de cette étude porte sur la réparation de la membrane plasmique perforée suite à l'exposition à des contraintes physiques, chimiques ou biochimiques. Nous décrivons un nouveau mécanisme de réparation de la membrane plasmique qui met en jeu le complexe III de la machinerie des ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Nos observations suggèrent que les ESCRTs seraient impliquées dans l'élimination de portions endommagées de membrane plasmique par bourgeonnement. Nos résultats portent une information novatrice dans le domaine des ESCRTs et pourrait aider à comprendre plus en détail le mode de fonctionnement des ESCRTs. La deuxième partie de cette étude porte sur la réponse cellulaire à l'endommagement physique (laser) ou chimique (par pontage chimique) d'organites de trafic. Nous montrons l'implication des mécanismes d'autophagie dans la réponse à l'endommagement des endosomes et de l'appareil de Golgi. Cette réponse comprend un recrutement rapide de la protéine LC3 (une des seules protéines détectables sur les membranes des autophagosomes matures). Nous avons montré également l'implication d'une ubiquitination rapide ainsi que du recrutement des protéines p62 et NBR1 (capables de lier à la fois l'ubiquitine et la protéine LC3). Le mécanisme observé présente de nombreux points communs avec d'autres mécanismes d'autophagie sélective mais révèle néanmoins des particularités comme le recrutement direct de LC3 sur les membranes de l'appareil de Golgi endommagé. Notre étude comprend donc l'étude de deux mécanismes cellulaires de réponse aux endommagements de membrane qui mettent en évidence l'existence de mécanismes de surveillance systématique de l'homéostasie des organelles et de la membrane plasmique. Ces mécanismes sont adaptés à la nature des membranes endommagées

Le traitement des données de séquençage pour les rendre utilisables dans une analyse phylogénétique est long et répétitif. De plus, certaines analyses plus complexes peuvent difficilement être entreprises sans l'automatisation de certaines tâches. La création d'outils bioinformatiques permettrait de diminuer le temps consacré à la préparation des données. Le but de cette recherche est de développer des outils informatiques permettant d'automatiser le traitement de données provenant du séquençage d'organites. Pour ce faire, il a été nécessaire de créer: item des bases de données de gènes d'organites; item des outils pour l'extraction des séquences génétiques dans différents formats; item des outils pour l'identification des gènes d'organismes nouvellement séquencés; item des outils de préparation des données pour l'utilisation lors d'analyses phylogénétiques. Finalement, le bon fonctionnement des outils a été vérifié par l'exécution d'une analyse phylogénétique dont les résultats ont déjà été publiés.

A la différence des mammifères, les plantes ne possèdent pas de cellules spécialisées dans la défense face aux pathogènes. Chaque cellule végétale peut déclencher une réponse immunitaire. Pour interagir avec succès avec la plante, les pathogènes doivent alors supprimer ou contourner les défenses de l’hôte. Afin d’y parvenir, les bactéries pathogènes disposent des effecteurs, des protéines qui peuvent être injectées dans la cellule végétale. De nombreux effecteurs sont connus pour cibler les organites lors de l’infection, confirmant l’importance du chloroplaste et de la mitochondrie dans les mécanismes de défense des cellules végétales. Dans ces conditions, il demeure vital pour la plante de garder la main sur l’expression des gènes des organites afin d’assurer une réponse proportionnée au risque encouru sans pénaliser la croissance de façon disproportionnée. A la différence de l’expression des gènes nucléaires, la régulation de l’expression des gènes des organites se fait principalement lors d’étapes très complexes de maturation post-transcriptionnelle. Parmi les protéines impliquées dans ces étapes de maturation, on trouve les protéines pentatricopeptide repeat (PPR). Les protéines PPR sont impliquées dans de nombreuses étapes de maturation des ARN des organites, comme l’édition C vers U ou l’épissage. Elles sont également présentes chez d’autres eucaryotes, mais n’ont jamais été étudiées chez les bactéries. L’hypothèse testée dans le cadre de la thèse est que ces protéines PPR, qu’elles soient d’origine exogène ou endogène, sont impliquées dans des modifications de l’expression des gènes des organites en condition de stress biotique. Afin de tester notre hypothèse, nous nous sommes intéressés à PGN (Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl) chez la plante modèle A. thaliana. Caractérisée par Laluk et al. (2011), le mutant KO montre une sensibilité accrue au nécrotrophe Botrytis cinerea, et l’expression du gène codant pour cette protéine est induite après infection. Nous avons mis en évidence des défauts d’édition dans la séquence non codante en amont de nad6 et dans cox2, deux gènes mitochondriaux. Leur édition ne varie cependant pas en condition d’infection par Botrytis cinerea. Dans la même optique, à la suite d’un crible bio-informatique, nous nous sommes intéressés à deux protéines PPR bactériennes que nous avons trouvées chez les phytopathogènes Erwinia amylovora et Ralstonia solanacearum. Probablement obtenues par les bactéries par transfert horizontal de gènes, il s’agit de la première caractérisation de PPR bactériennes à notre connaissance. Ces protéines possèdent des caractéristiques d’effecteurs, c’est—dire des protéines injectées par la bactérie dans la plante durant l’infection. Si nous n’avons pas vu de modification du transcriptome des organites de la plante provoqué par la surexpression de ces protéines PPR exogènes, nous avons cependant mis en évidence une baisse significative du taux d’incidence de la maladie provoquée par E. amylovora en l’absence d’un gène fonctionnel codant pour sa PPR chez la plante hôte Malus domestica « Golden delicious ». Pour la PPR d’E. amylovora comme celle de R. solanacearum, nous avons également trouvés plusieurs interactants en double hybride levure chez A. thaliana, représentant de nombreuses cibles putatives à étudier. Afin de réaliser ces expérimentations et d’obtenir ces résultats, nous avons eu besoins d’outils particuliers. Nous avons donc développé un pipeline spécifique d’analyse de données de séquençage d’ARN ainsi qu’une méthode améliorée de prédiction des zones de fixation des protéines PPR, ouvrant la voie à une caractérisation simplifiée de nombreuses protéines. / Compared to mammals, plants do not have highly specialized cells involved in defense against pathogens. Each plant cell is able to start an immune response. To interact successfully with plants, pathogens have to block or bypass host defenses. To do so, phytopathogenic bacteria can use effectors, which are basically bacterial proteins injected in the plant cell during infection. Several effectors are known to target organelles during infection, supporting the idea that chloroplasts and mitochondria are key players in plant cell defense. As a reason, it remains necessary for the plant to keep organellar gene expression under control in order to ensure a response in proportion to the risk, without penalizing growth. Unlike nuclear gene expression, organellar gene expression regulation goes through highly complex post-transcriptional maturation steps. Among proteins involved in these events, PPR proteins (for pentatricopeptide repeat) are known to be very important. PPR proteins are involved in several RNA maturation steps in organelles, like C to U editing or splicing. They are studied in several eukaryotes, but not in bacteria. During my PhD studies, the hypothesis is exogenous or endogenous PPR proteins are involved in organellar gene expression modifications during biotic stress. To test our hypothesis, we work on PGN (Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl) in plant model A. thaliana. Characterized by Laluk et al. (2011), the KO mutant displays an enhanced sensitivity to the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea, and PGN gene expression is induced after infection. We find two editing defects for the KO mutant, in nad6 5’ non coding sequence and in cox2 coding sequence. However, editing at these two sites does not vary in wild type plants during Botrytis cinerea infection.Using a bioinformatic screen, we find several bacterial PPR proteins. Two of them are encoded by bacterial plant pathogens: Erwinia amylovora and Ralstonia solanacearum. To our knowledge, these proteins, putatively obtained through horizontal gene transfer, are the first bacterial PPR proteins to be characterized. They also share similarities with bacterial effectors. If overexpression of these bacterial PPR proteins in A. thaliana does not unveil organellar transcriptome modifications, we show a decrease of the incidence rate of the disease caused by E. amylovora in the host plant Malus domestica “Golden delicious” without a functional gene coding for the PPR protein. For both Erwinia and Ralstonia PPR, we find several interactants in A. thaliana using Yeast Two Hybrid, each of them representing a potential target that could be studied. In order to perform these experiments and obtain these results, we needed very specific tools. During the PhD studies, we develop an RNAseq analysis pipeline and an enhanced method to predict PPR binding sites, opening the way to an easier characterization of several PPR proteins.

"Une très grande quantité de données est présentement générée par le séquençage de génomes et doit être analysée à l'aide d'outils informatiques. Il est donc nécessaire de développer certains programmes permettant de faire les analyses désirées et d'automatiser les tâches informatiques redondantes pour accélérer le processus d'analyse des génomes. Les données de séquençage obtenues se doivent également d'être classées efficacement et d'être facilement accessibles, de même que les outils informatiques nécessaires à leur analyse. Une base de données a donc été développée, ainsi qu'un site Web permettant de la consulter et d'utiliser les divers programmes requis. Finalement, des analyses phylogénétiques sont couramment effectuées sur les génomes séquences. Toutefois, peu d'outils permettent d'utiliser l'ordre de gènes de ces génomes à cette fin. Un programme permettant de déterminer les blocs de gènes conservés entre différents génomes et d'utiliser les paires de gènes communes pour construire des arbres phylogénétiques a donc été développé."