Un des principaux acteurs impliqués dans la régulation du statut redox intracellulaire, permettant aux plantes de s’adapter aux contraintes environnementales, est une famille multigénique de petites (12-14 kDa) oxydoréductases ubiquistes appelées thiorédoxines (TRX). Le génome d’Arabidopsis code une vingtaine de TRX canoniques dont neuf sont plastidiales (TRX f, m, x et y). Très étudiées dans notre laboratoire par des approches biochimiques, les TRX de types f et m apparaissent réguler majoritairement l’activité d’enzymes impliquées dans le métabolisme primaire tandis que les types x et y servir principalement de substrats réducteurs d’enzymes antioxydantes. Plus récemment, une dixième TRX, proposée plastidiale et nommée TRX z, a été identifiée. Au cours de ma thèse, j’ai caractérisé cette nouvelle TRX chloroplastique montrant des propriétés physico-chimiques inhabituelles, la rendant unique. En effet, la TRX z semble interagir, via des interactions électrostatiques, avec des protéines pour former des complexes de masses moléculaires élevées, potentiellement liés aux acides nucléiques. De plus, la TRX z, dont l’expression est induite à la lumière, principalement dans les tissus photosynthétiques, est la première TRX chloroplastique qui n’est pas réduite par le système FTR à la lumière mais qui peut être réduite par les autres TRX plastidiales, suggérant une interconnexion entre ces différentes TRX. D’autre part, une recherche exhaustive de cibles de la TRX z, par deux approches spécifiques et complémentaires (protéomique et double hybride), ont révélé 90 cibles putatives de la TRX z. La plupart de ces cibles, jamais identifiées comme cibles des TRX, sont impliquées dans la réponse de défense des plantes mise en place lors de stress biotiques. Ces résultats suggèrent que la TRX z pourrait être un élément clé dans la mise en place de ces réponses. L’analyse fonctionnelle préliminaire de la TRX z au cours de la réponse immune innée conforte cette hypothèse. L’ensemble de ces résultats indique que la TRX z pourrait jouer le rôle d’une protéine senseur de l’état d’oxydoréduction de la cellule. / One of the main actors involved in regulation of the cellular redox state, which allow plant adaptation to stress environmental conditions, is a multigenic family of small (12-14 kDa) ubiquitous oxidoreductases named thioredoxins (TRX). Arabidopsis encodes around twenty canonical TRX, including nine plastidial isoforms (TRX f, m, x and y). Extensively studied in our laboratory by biochemical approaches, TRX f and m was found to mainly redox regulate the activity of enzymes involved in the primary metabolism whereas TRX x and y serve as reducing substrates for antioxidant enzymes. More recently, a tenth TRX, predicted plastidial and named TRX z, was identified. During my PhD, I have characterized this new plastidial TRX showing unusual physicochemical properties, making it unique. Indeed, TRX z seems to interact, via electrostatic bonds, with proteins to form high molecular weight complexes, potentially linked to nucleic acids. Moreover, TRX z, which is expressed in green tissues in the light, is the first plastidial TRX which is not reduced by the FTR system but which can be reduced by other plastidial TRX, suggesting an interconnection between these TRX. Furthermore, a large scale inventory of TRX z targets, by two specific and complementary approaches (proteomic and yeast two hybrid), revealed 90 putative TRX z targets. Most of these, which have never been identified as TRX targets before, are implicated in plant defense response to biotic stresses. These results suggest that TRX z might be a key player in these responses. Preliminary functional analysis of TRX z during immune innate response reinforces this hypothesis. Altogether, these results indicate that TRX z appears as an important sensor of the redox status of the cell.

A la différence des mammifères, les plantes ne possèdent pas de cellules spécialisées dans la défense face aux pathogènes. Chaque cellule végétale peut déclencher une réponse immunitaire. Pour interagir avec succès avec la plante, les pathogènes doivent alors supprimer ou contourner les défenses de l’hôte. Afin d’y parvenir, les bactéries pathogènes disposent des effecteurs, des protéines qui peuvent être injectées dans la cellule végétale. De nombreux effecteurs sont connus pour cibler les organites lors de l’infection, confirmant l’importance du chloroplaste et de la mitochondrie dans les mécanismes de défense des cellules végétales. Dans ces conditions, il demeure vital pour la plante de garder la main sur l’expression des gènes des organites afin d’assurer une réponse proportionnée au risque encouru sans pénaliser la croissance de façon disproportionnée. A la différence de l’expression des gènes nucléaires, la régulation de l’expression des gènes des organites se fait principalement lors d’étapes très complexes de maturation post-transcriptionnelle. Parmi les protéines impliquées dans ces étapes de maturation, on trouve les protéines pentatricopeptide repeat (PPR). Les protéines PPR sont impliquées dans de nombreuses étapes de maturation des ARN des organites, comme l’édition C vers U ou l’épissage. Elles sont également présentes chez d’autres eucaryotes, mais n’ont jamais été étudiées chez les bactéries. L’hypothèse testée dans le cadre de la thèse est que ces protéines PPR, qu’elles soient d’origine exogène ou endogène, sont impliquées dans des modifications de l’expression des gènes des organites en condition de stress biotique. Afin de tester notre hypothèse, nous nous sommes intéressés à PGN (Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl) chez la plante modèle A. thaliana. Caractérisée par Laluk et al. (2011), le mutant KO montre une sensibilité accrue au nécrotrophe Botrytis cinerea, et l’expression du gène codant pour cette protéine est induite après infection. Nous avons mis en évidence des défauts d’édition dans la séquence non codante en amont de nad6 et dans cox2, deux gènes mitochondriaux. Leur édition ne varie cependant pas en condition d’infection par Botrytis cinerea. Dans la même optique, à la suite d’un crible bio-informatique, nous nous sommes intéressés à deux protéines PPR bactériennes que nous avons trouvées chez les phytopathogènes Erwinia amylovora et Ralstonia solanacearum. Probablement obtenues par les bactéries par transfert horizontal de gènes, il s’agit de la première caractérisation de PPR bactériennes à notre connaissance. Ces protéines possèdent des caractéristiques d’effecteurs, c’est—dire des protéines injectées par la bactérie dans la plante durant l’infection. Si nous n’avons pas vu de modification du transcriptome des organites de la plante provoqué par la surexpression de ces protéines PPR exogènes, nous avons cependant mis en évidence une baisse significative du taux d’incidence de la maladie provoquée par E. amylovora en l’absence d’un gène fonctionnel codant pour sa PPR chez la plante hôte Malus domestica « Golden delicious ». Pour la PPR d’E. amylovora comme celle de R. solanacearum, nous avons également trouvés plusieurs interactants en double hybride levure chez A. thaliana, représentant de nombreuses cibles putatives à étudier. Afin de réaliser ces expérimentations et d’obtenir ces résultats, nous avons eu besoins d’outils particuliers. Nous avons donc développé un pipeline spécifique d’analyse de données de séquençage d’ARN ainsi qu’une méthode améliorée de prédiction des zones de fixation des protéines PPR, ouvrant la voie à une caractérisation simplifiée de nombreuses protéines. / Compared to mammals, plants do not have highly specialized cells involved in defense against pathogens. Each plant cell is able to start an immune response. To interact successfully with plants, pathogens have to block or bypass host defenses. To do so, phytopathogenic bacteria can use effectors, which are basically bacterial proteins injected in the plant cell during infection. Several effectors are known to target organelles during infection, supporting the idea that chloroplasts and mitochondria are key players in plant cell defense. As a reason, it remains necessary for the plant to keep organellar gene expression under control in order to ensure a response in proportion to the risk, without penalizing growth. Unlike nuclear gene expression, organellar gene expression regulation goes through highly complex post-transcriptional maturation steps. Among proteins involved in these events, PPR proteins (for pentatricopeptide repeat) are known to be very important. PPR proteins are involved in several RNA maturation steps in organelles, like C to U editing or splicing. They are studied in several eukaryotes, but not in bacteria. During my PhD studies, the hypothesis is exogenous or endogenous PPR proteins are involved in organellar gene expression modifications during biotic stress. To test our hypothesis, we work on PGN (Pentatricopeptide repeat protein for Germination on NaCl) in plant model A. thaliana. Characterized by Laluk et al. (2011), the KO mutant displays an enhanced sensitivity to the necrotrophic pathogen Botrytis cinerea, and PGN gene expression is induced after infection. We find two editing defects for the KO mutant, in nad6 5’ non coding sequence and in cox2 coding sequence. However, editing at these two sites does not vary in wild type plants during Botrytis cinerea infection.Using a bioinformatic screen, we find several bacterial PPR proteins. Two of them are encoded by bacterial plant pathogens: Erwinia amylovora and Ralstonia solanacearum. To our knowledge, these proteins, putatively obtained through horizontal gene transfer, are the first bacterial PPR proteins to be characterized. They also share similarities with bacterial effectors. If overexpression of these bacterial PPR proteins in A. thaliana does not unveil organellar transcriptome modifications, we show a decrease of the incidence rate of the disease caused by E. amylovora in the host plant Malus domestica “Golden delicious” without a functional gene coding for the PPR protein. For both Erwinia and Ralstonia PPR, we find several interactants in A. thaliana using Yeast Two Hybrid, each of them representing a potential target that could be studied. In order to perform these experiments and obtain these results, we needed very specific tools. During the PhD studies, we develop an RNAseq analysis pipeline and an enhanced method to predict PPR binding sites, opening the way to an easier characterization of several PPR proteins.

Une meilleure compréhension de la physiologie de la semence des céréales constitue certainement un moyen pour améliorer et développer de nouvelles variétés capables de correspondre aux besoins économiques et écologiques du moment. Les rédoxines constituent des marqueurs intéressants pour appréhender la qualité technologique et germinative du grain de blé en particulier. Le criblage des banques de données a permis d’isoler des isoformes de ces rédoxines. Cette étude a confirmé l’implication des thiorédoxines dans la réduction des protéines de réserve du blé et de maïs. Elle a permis de mettre en évidence un autre rôle de certains isoformes de thiorédoxines h dans la formation de polymères de hauts poids moléculaires. L'inhibition de l’expression de gènes par interférence ADN montre que les thiorédoxines et les glutarédoxines sont impliquées dans la protection contre le stress oxydatif chez le blé. De même, l'application d’un stress biotique simulé par la laminarine a permis de discriminer l'implication de différents marqueurs du stress, et de montrer en particulier que la 1-Cys-Prx peut être considérée comme un indicateur de l'état redox du grain pendant la germination. La mise en place d’une méthode simple et efficace de transformation des céréales via Agrobacterium, constitue un moyen pour comprendre davantage le rôle de ces rédoxines dans la gestion des stress, et les éventuelles conséquences sur la qualité technologique du grain. / A better understanding of the physiology of seed cereal constitutes certainly a means to improve and develop new varieties capable of corresponding to the actual economic and ecological needs. Redoxins are interesting markers to apprehend the technological and germinative quality of wheat seed in particular. The screening of data banks allowed isolating isoforms of these redoxins. This study confirmed the implication of thioredoxins in the reduction of storage proteins in wheat and corn seeds. It allowed to bring to light another role of some thioredoxins h isoforms in the formation of high molecular weights polymers. The inhibition of the expression of genes by DNA interference shows that thioredoxins and glutaredoxins are involved in the protection against oxidative stress in wheat. Also, the application of a biotic stress simulated by laminarin allowed to discriminate the implication of various stress markers, and to highlight in particular that the 1-Cys-Prx can be considered as an indicator of the redox state of the grain during germination and seedling. The implementation of a simple and effective method of transformation of cereal via Agrobacterium constitutes a means to understand more on the role of these redoxins in the management of the stress, and the possible consequences on the technological quality of the seed.

La compréhension des mécanismes de défense mis en place lors de la résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes a pour objectif de proposer des alternatives à l'utilisation de produits phytosanitaires utilisés en agriculture. Dans une première partie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance induite aux pathogènes par l'acide β-aminobutyrique (BABA) chez la vigne. En effet, cet acide aminé non protéique favorise un état physiologique particulier, appelé potentialisation, dans lequel la plante est capable de mobiliser plus rapidement et/ou plus intensément ses réactions de défense en réponse à un stress. Contrairement aux éliciteurs comme les oligogalacturonates (OG), nous avons montré que le BABA seul n'induisait pas les événements précoces de signalisation sur suspensions cellulaires de vigne, tels que les variations de la concentration en calcium cytosolique libre ([Ca2+]cyt), la production de monoxyde d'azote (NO), la production d'H2O2, la phosphorylation de MAPkinases, ni l'expression de gènes de défense. Seules la production d'H2O2 et l'expression plus intense du gène RbohD codant une NADPH oxydase sont potentialisées par le BABA dans les suspensions cellulaires élicitées par les OG. In planta, le BABA potentialise également une production d'H2O2 en réponse à l'infection par l'oomycète Plasmopara viticola. L'utilisation d'un inhibiteur de NADPH oxydase abolit complètement cette production d'H2O2 et bloque partiellement la résistance induite par le BABA. Nous montrons donc que la potentialisation de la production d'H2O2 dépendante d'une NADPH oxydase contribue à l'établissement de la résistance induite par le BABA chez la vigne. Une deuxième partie a permis d'appréhender les événements cellulaires impliqués dans la résistance des plantes en se focalisant sur le mutant pad2 (phytoalexin deficient) d'Arabidopsis thaliana. Ce mutant présente une sensibilité accrue à différents pathogènes et contient un taux de glutathion de l'ordre de 20 % par rapport à l'écotype sauvage. Nous avons tout d'abord montré que le faible taux de glutathion dépendait d'une quantité réduite de la première enzyme de sa biosynthèse, la glutamate-cystéine ligase. Le glutathion étant impliqué dans la mise en place des réactions de défense, nous avons tenté de définir le lien entre la déficience en glutathion et la sensibilité de pad2 aux pathogènes. Nous avons tout d'abord montré que pad2 possédait un état redox du glutathion plus oxydé que le sauvage. Une analyse transcriptomique à l'état basal a révélé que la plupart des gènes différentiellement exprimés étaient réprimés chez pad2. Parmi ces gènes, certains codent des protéines impliquées dans les flux d'ions qui pourraient déréguler la dépolarisation membranaire. Nous avons ainsi confirmé que la dépolarisation de la membrane plasmique est amoindrie chez pad2 en réponse aux OG. De plus, des événements en aval tels que la production d'H2O2 et la production de NO sont également plus faibles chez le mutant par rapport au sauvage. Cette absence de la production d'H2O2 a également été spécifiquement observée sur plantes pad2 infectées par l'oomycète Phytophthora brassicae. Il en résulte un développement accru du pathogène corrélé à une absence de réponse hypersensible, une mort cellulaire localisée normalement observée dans le cas du sauvage résistant. En réponse aux OG ou à l'infection par P. brassicae, les analyses transcriptomiques font ressortir un fort enrichissement de gènes relatifs à la dégradation des protéines chez pad2. De manière globale, nos résultats suggèrent que la déficience en glutathion chez pad2 pourrait profondément modifier le turn-over des protéines, perturbant ainsi la signalisation cellulaire et les réponses biologiques associées.

Notre équipe de recherche étudie l'action des hormones gibbérellines (GA) et cytokinines (CK) dans les processus de développement chez la plante modèle Arabidopsis thaliana. En recherchant des régulateurs de l'expression d'un gène impliqué dans la différenciation des cellules épidermiques et dont l'expression est contrôlée par ces deux hormones, une nouvelle famille de quatre protéines nommées GeBP (GL1 enhancer Binding Protein), GPL1 (GeBP Protein Like 1), GPL2 et GPL3 a été identifiée au laboratoire. Le but de ce travail de thèse était de caractériser moléculairement et fonctionnellement les membres de cette nouvelle famille multigénique.<br /> Nous avons tout d'abord vérifié l'adressage nucléaire des protéines GeBP/GPL et démontré leur capacité à former des dimères in planta via un motif Leucine-Zipper non canonique. L'analyse fonctionnelle a été abordée par l'étude de lignées simples et multiples mutantes gebp/gpl. Différentes données physiologiques et moléculaires convergentes ont démontré un rôle redondant des gènes GeBP/GPL dans le contrôle de la réponse aux CK. Enfin, une analyse globale des transcriptomes d'une lignée surexpresseur de GPL2 et du quadruple mutant gebp/gpl, nous a permis d'établir un lien entre les GeBP/GPL et CPR5, un gène impliqué dans la réponse aux pathogènes, et le contrôle du cycle cellulaire. Ce lien a été conforté expérimentalement par des mesures de ploïdies des noyaux des cellules foliaires montrant une dérégulation du cycle cellulaire chez la lignée quadruple mutant et la lignée surexpresseur de GPL2.<br />Les futurs travaux auront pour but de poursuivre l'étude de la fonction des GeBP/GPL et de confirmer le lien avec CPR5.

La compréhension des mécanismes de défense mis en place lors de la résistance des plantes vis-à-vis d'agents pathogènes a pour objectif de proposer des alternatives à l'utilisation de produits phytosanitaires utilisés en agriculture. Dans une première partie, nous avons étudié les mécanismes moléculaires impliqués dans la résistance induite aux pathogènes par l'acide β-aminobutyrique (BABA) chez la vigne. En effet, cet acide aminé non protéique favorise un état physiologique particulier, appelé potentialisation, dans lequel la plante est capable de mobiliser plus rapidement et/ou plus intensément ses réactions de défense en réponse à un stress. Contrairement aux éliciteurs comme les oligogalacturonates (OG), nous avons montré que le BABA seul n’induisait pas les événements précoces de signalisation sur suspensions cellulaires de vigne, tels que les variations de la concentration en calcium cytosolique libre ([Ca2+]cyt), la production de monoxyde d’azote (NO), la production d’H2O2, la phosphorylation de MAPkinases, ni l’expression de gènes de défense. Seules la production d’H2O2 et l’expression plus intense du gène RbohD codant une NADPH oxydase sont potentialisées par le BABA dans les suspensions cellulaires élicitées par les OG. In planta, le BABA potentialise également une production d’H2O2 en réponse à l’infection par l’oomycète Plasmopara viticola. L’utilisation d’un inhibiteur de NADPH oxydase abolit complètement cette production d’H2O2 et bloque partiellement la résistance induite par le BABA. Nous montrons donc que la potentialisation de la production d’H2O2 dépendante d’une NADPH oxydase contribue à l’établissement de la résistance induite par le BABA chez la vigne. Une deuxième partie a permis d’appréhender les événements cellulaires impliqués dans la résistance des plantes en se focalisant sur le mutant pad2 (phytoalexin deficient) d’Arabidopsis thaliana. Ce mutant présente une sensibilité accrue à différents pathogènes et contient un taux de glutathion de l’ordre de 20 % par rapport à l’écotype sauvage. Nous avons tout d’abord montré que le faible taux de glutathion dépendait d’une quantité réduite de la première enzyme de sa biosynthèse, la glutamate-cystéine ligase. Le glutathion étant impliqué dans la mise en place des réactions de défense, nous avons tenté de définir le lien entre la déficience en glutathion et la sensibilité de pad2 aux pathogènes. Nous avons tout d’abord montré que pad2 possédait un état redox du glutathion plus oxydé que le sauvage. Une analyse transcriptomique à l’état basal a révélé que la plupart des gènes différentiellement exprimés étaient réprimés chez pad2. Parmi ces gènes, certains codent des protéines impliquées dans les flux d’ions qui pourraient déréguler la dépolarisation membranaire. Nous avons ainsi confirmé que la dépolarisation de la membrane plasmique est amoindrie chez pad2 en réponse aux OG. De plus, des événements en aval tels que la production d’H2O2 et la production de NO sont également plus faibles chez le mutant par rapport au sauvage. Cette absence de la production d’H2O2 a également été spécifiquement observée sur plantes pad2 infectées par l’oomycète Phytophthora brassicae. Il en résulte un développement accru du pathogène corrélé à une absence de réponse hypersensible, une mort cellulaire localisée normalement observée dans le cas du sauvage résistant. En réponse aux OG ou à l’infection par P. brassicae, les analyses transcriptomiques font ressortir un fort enrichissement de gènes relatifs à la dégradation des protéines chez pad2. De manière globale, nos résultats suggèrent que la déficience en glutathion chez pad2 pourrait profondément modifier le turn-over des protéines, perturbant ainsi la signalisation cellulaire et les réponses biologiques associées. / Alternative strategies are required to reduce pesticide input into the environment for effective and sustainable plant protection. One solution is the activation of plant basal resistance that relies on the application of resistance inducer molecules. In the first part of this study, we analyzed the mode of action of β-aminobutyric acid (BABA), a non-protein amino acid, in the grapevine induced resistance. BABA confers a physiological state, called priming, during which plants are able to mobilize better and/or more rapidly defense responses to biotic or abiotic stress. Unlike oligogalacturonides (OG), we showed that BABA did not induce early signaling events in grapevine cells such as variations of cytosolic free calcium concentration, H2O2 and nitric oxide production, MAPkinase phosphorylation, nor the expression of defense-related genes. Among them, only H2O2 production and the expression of RbohD gene, which encodes a NADPH oxidase, are primed by BABA in OG-treated cells. Moreover, BABA-treated plants display a stronger accumulation of H2O2 in response to the oomycete Plasmopara viticola. Application of an NADPH oxidase inhibitor completely abolishes this H2O2 production and leads to a reduction of BABA-induced resistance against P. viticola. These data suggest that the priming of an NADPH oxidase-dependent H2O2 production contributes to BABA-induced resistance in grapevine. The second part consisted to analyze molecular events involved in plant resistance by using the pad2 (phytoalexin deficient) mutant of Arabidopsis thaliana which is susceptible to a broad range of pathogens. We showed that the glutathione depletion depends on the low amount of glutamate-cysteine ligase protein, the first enzyme involved in its biosynthesis. We studied molecular events, which are involved in defense mechanisms, to understand the impact of the glutathione content on pad2 susceptibility. Our results show that the redox state of glutathione is more oxidized in pad2 than in wild type Col-0. Since cellular redox state change is known to regulate gene expression, a basal transcriptome analysis has been performed in pad2 and wild type plants. Interestingly, most of the identified genes in pad2 are down-regulated, some of them encoding proteins involved in ion fluxes. As expected, the plasma membrane depolarization and events downstream like H2O2 and NO production are impaired in pad2 in response to OG. During infection with Phytophthora brassicae, the lack of H2O2 production is concomitant with an absence of the hypersensitive response, a localize cell death observed in the resistant wild type. After OG treatment or P. brassicae infection, microarray analysis brings out genes related to protein machinery including degradation in pad2. Taken together, these data suggest that the depletion of glutathione has an impact on protein turn-over which disturbs cell signaling events and related biological responses.