Les Formes Actives de l’Oxygène (FAO), molécules dérivées de l’oxygène, sont capables d’oxyder et d’endommager les macromolécules biologiques. Au cours de son cycle de vie, Salmonella typhimurium est exposée à des FAO provenant de deux sources : soit de son métabolisme aérobie, soit du macrophage, sa cellule hôte au cours de l’infection. Parmi les FAO existantes, l’H2O2 est l’une des plus néfastes. Au cours de ma thèse, j’ai étudié la contribution des catalases et des peroxyrédoxines dans le métabolisme et la virulence de S.typhimurium. Cinq enzymes ont ainsi été identifiées pour leur capacité à éliminer l’H2O2 : les catalases KatG, KatE, KatN et les peroxyrédoxines AhpCF et TsaA. Des tests de virulence ont également permis de montrer que ces enzymes participaient à l’établissement de la virulence.A l’aide d’une sonde moléculaire capable de détecter et de signaler l’H2O2, nous avons montré que S. typhimurium percevait cette FAO au cours de l’infection dans des macrophages murins. Ces résultats ont souligné l’importance des catalases et des peroxyrédoxines au cours de la vie intracellulaire de S. typhimurium. L’analyse du mutant DahpCF DtsaA Dtpx a également révélé que les peroxyrédoxines AhpCF, TsaA et Tpx contribuaient à la capacité de prolifération de la bactérie dans le macrophage. Enfin, l’étude des méthionine sulfoxyderéductases a montré que les caractéristiques d’un mutant DmsrA DmsrB étaient proches de celles de la souche sauvage. Les gènes msrA et msrB ont également été inactivés dans une souche dépourvue de katG, katE et ahpCF. Dans cette souche accumulant de l’H2O2endogène, la contribution de MsrA et MsrB devient évidente pour lutter contre les effets liés au stress oxydant. L’ensemble de ces travaux a permis d’identifier et de caractériser l’implication de systèmes antioxydants dans la virulence et le métabolisme de S. typhimurium. / Reactive Oxygen Species (ROS), produced from molecular oxygen, can oxidize and damagebiological macromolecules. During its lifestyle, Salmonella typhimurium is submitted to ROScoming from two sources: its aerobic metabolism and its host cell upon infection, themacrophage. Among the ROS, H2O2 is one of the most toxic. In this work, the contribution ofcatalases and peroxiredoxins in the metabolism and the virulence of S. typhimurium wasstudied. Five enzymes are implied in H2O2 degradation, the catalases KatG, KatE, KatN andthe peroxiredoxins, AhpCF and TsaA. Virulence tests showed that these enzymes wereinvolved in virulence. Using a molecular probe able to detect and quantify H2O2, we showedthat S. typhimurium sensed H2O2 during infection in murine macrophages. These resultsunderlined the importance of catalases and peroxoxyredoxines for the intracellular life of S.typhimurium. Analysis of the mutant DahpCF DtsaA Dtpx revealed that the peroxiredoxinsAhpCF, TsaA and Tpx contributed to the bacterial proliferation inside macrophage. Finally,the study of the methionine sulfoxyde reductases showed that the phenotype of the mutantDmsrA DmsrB was related to the wild type strain. Then, msrA and msrB were inactivated in astrain deleted of katG, katE and ahpCF. In this strain impaired in H2O2 degradation, thecontribution of MsrA and MsrB to fight against oxidative stress effect is stronger. Altogether,these results allowed the identification and the contribution of antioxidant systems in S.typhimurium virulence and metabolism.

Les variations de l'environnement peuvent influer sur le métabolisme de la plante, notamment à travers la formation des espèces oxygénées réactives (EOR) nocives à forte concentration. Des systèmes enzymatiques vont dégrader ces EOR mais aussi réparer les molécules oxydées par ces réactifs. Ils sont composés notamment de peroxydases (glutathion peroxydases utilisant les thiorédoxines comme réducteur, et les peroxyrédoxines utilisant les glutarédoxines et les thiorédoxines pour leur régénération) dont l'activité s'appuie sur des échanges dithiol-disulfure. Ces systèmes présentent une complexité liée à l'existence de familles multigéniques. Des hybrides Prx-Grx actifs ont été produits de façon recombinante, donnant des indications sur les interactions entre Prx et Grx. Les études enzymatiques réalisées sur les Prx IIF et IIE ont montré qu'elles sont capables de réduire de nombreux substrats autres que le peroxyde d'hydrogène avec des efficacités variables. De plus, leurs localisations tissulaires sont différentes ainsi que leurs réactions en réponse à divers stress oxydant. Outre leur fonction de réducteurs, les glutarédoxines pourraient participer aussi à la signalisation par le mécanisme de glutathionylation, impliqué dans la protection de cystéines critiques par fixation d'une molécule de glutathion. Un rôle nouveau est apparu, elles aident à la formation et l'intégration des centres fer-soufre et participent donc à la maturation des protéines fer-soufre. Les Grxs chloroplastiques S14 et S16 intègrent de façon naturelle un centre fer-soufre et complémentent des mutants de levure déficients en Grx5, une glutarédoxine CGFS nécessaire pour l'assemblage des centres fer-soufre. Enfin, la GrxS14 est capable de transférer efficacement son centre à une molécule acceptrice. Ces résultats nous permettent de mieux comprendre la redondance des ces familles : ces systèmes modulent différents processus physiologiques, dont certains encore inconnus, en réponse au stress oxydant / Environment variations can modify plant metabolism in particular by production of reactive oxygen species (ROS) which are harmfull at high level. Enzymatic systems are to degrade these ROS but also repair oxidized molecules. They are composed by peroxidases (thioredoxins-reduced glutathione peroxidases and thioredoxin or glutaredoxin-reduced peroxiredoxins) using dithiol exchange for their activity. These systems present a complexity according to their multigenic family origin. Recombinant Prx-Grx hybrids have been produced giving clue to interactions between Prx and Grx. Enzymatic studies showed Prx IIF and IIE can reduced a wide range of substrates other than hydrogen peroxide, with variable activity. Furthermore they are not found identically in plant tissue and react to oxidative stress in different ways. Besides reducing properties Grx could participate in cell signalling by glutathionylation, mechanism which protects cystein by fixating a molecule of GSH. A new role appeared recently, they help production of iron-sulfur cluster and play a role in iron-sulfur proteins maturation. Plastidials S14 and S16 Grxs can naturally bind an iron-sulfur cluster and complement Grx5 (CGFS Grx known entering in iron-sulfur proteins maturation) deficient mutants yeast. Finally GrxS14 is able to transfer efficiently his cluster to accepting molecule. These results allow us understanding better these multigenic families regulating several physiological processes, some still unknown, in oxidative stress

Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) sont la seconde cause d'invalidité à long terme et de mortalité dans le monde entier qui résulte d'une perte de sang au cerveau. Il y a actuellement peu de médicaments pour traiter les accidents vasculaires cérébraux. Pourtant, il y a un intérêt pour trouver un traitement, ciblant spécifiquement la cascade post-inflammatoire. Il y a une attention particulière pour inhiber les protéines peroxyrédoxines humaines (hPrx) qui sont des initiateurs clés de l'inflammation. Les protéines hPrx sont des enzymes qui dégradent les peroxydes et aussi protègent les cellules du stress oxydatif. Cette thèse est centrée sur l'étude de ligands potentiels des hPrx, dérivés du catéchol, susceptibles de devenir des agents thérapeutiques potentiels pour traiter les AVC. Premièrement, différents ligands potentiels ont été criblés par RMN et modélisation moléculaire pour savoir s'ils pouvaient se lier à différents isoformes des peroxirédoxines. Ces études ont révélé que ces dérivés du catéchol pouvaient se lier à plusieurs hPrx. Deuxièmement, la capacité des dérivés du catéchol à inhiber l'activité des hPrx a été examinée au travers de tests enzymatiques in vitro. Il a été montré que tous les dérivés du catéchol étudiés étaient capables de les inhiber. En utilisant des simulations de dynamique moléculaire, nous avons pu expliquer le mécanisme d'action moléculaire d'inhibition. En général, cette recherche fournit un aperçu des ligands qui pourrait être développés pour devenir un médicament pour aider dans le processus de rétablissement de patients atteints d'attaque cérébrale / Strokes are the second leading cause of long-term disability and death worldwide that result from a sudden loss of blood to the brain. Currently, there are limited drugs to treat patients when having a stroke. However, there is now interest focused on treatment after a stroke, specifically the post-inflammation cascade. In particular, there is attention to inhibit human peroxiredoxin proteins, which are key initiators of inflammation. Human peroxiredoxins are enzymes that degrade peroxides and also, protect the cells against oxidative stress. This thesis focuses on studying ligands, catechol derivatives, to bind and inhibit human peroxiredoxin proteins to become potential therapeutic agents for strokes. First, the ligands were screened to identify if they could bind to various human peroxiredoxin isoforms with NMR and computational modeling techniques. This study revealed the catechol derivatives could indeed bind to several human peroxiredoxins. Second, the ability for the catechol derivatives to inhibit human peroxiredoxin peroxidase activity was examined through an in vitro enzymatic assay. All the catechol derivatives were determined to inhibit several human peroxiredoxins. In utilizing molecular dynamic simulations, it assisted in explaining the in vitro inhibition molecular mechanism of action. Overall, this research provides insight of molecules that could be further developed to become possibly a drug to aid in stroke patients recovery process

La description des interactions protéine-ligand est d'une importance capitale pour la compréhension de phénomènes biologiques de toutes sortes, et dans le procédé de conception de nouvelles molécules bioactives. Avec l'avènement de nouveaux moyens de calculs numériques, la modélisation des équilibres d'interaction utilisant la dynamique moléculaire est de plus en plus utilisée pour l'étude au niveau microscopique permettant ainsi de guider la conception et l'optimisation de nouveaux inhibiteurs biologiques. Cette thèse est centrée sur l'utilisation de la funnel-métadynamique pour la prédiction d'affinités protéine-ligand et la description des interactions, en corrélation avec des données expérimentales de RMN et de cinétique enzymatique. Sur le modèle biologique des peroxyrédoxines humaines impliquées dans la cascade inflammatoire survenant après un choc ischémique, l'interaction et l'inhibition de composés catéchols ont été étudiées. Les données obtenues par dynamique sur l'interaction de dérivés catéchols ont été utilisées pour guider l'optimisation de cette molécule fragment pour une meilleure affinité et inhibition des peroxyrédoxines humaines. Nos résultats ont montré que la funnel-métadynamique, en plus de permettre la prédiction des affinités protéine-ligand, donnait une description réaliste de l'interaction pouvant mener à l'identification et l'optimisation de nouvelles molécules bioactives dont le potentiel inhibiteur a pu être examiné par cinétique enzymatique. Cette recherche fournit un aperçu des possibilités offertes par les nouvelles méthodes numériques, et leur application en chimie médicinale par exemple / Description of protein-ligand interactions is crucial for the understanding of all biological phenomena, and the drug design process. Thanks to new developments in computational devices, simulation of interaction equilibria using molecular dynamics are becoming state-of-the-art approach for the microscopic study of these molecular interactions. These new methods guide the conception and the optimization of new biological inhibitors. This project is focused on the use of funnel metadynamics for the prediction of protein-ligand affinities, and the description of interactions. Data obtained by metadynamics are correlated with experimental data from NMR and enzymatic assays.On the biological model of human peroxiredoxins, involved in the post ischemic inflammation cascade, interaction an inhibition of catechols derivatives have been studied. Data obtained from simulations have been used in the optimization process of the catechol fragment, to reach a better affinity and inhibition of human peroxiredoxins. Our results have shown that funnel-metadynamics allows the prediction of protein-ligand affinities, and the realistic description of the interaction, that lead to identify and optimize new bioactive molecules. Their inhibitory strengths and mechanisms have been examinated using enzymatic assays.Our research gives an overview of the possibilities brought by new numerical approaches, and their application in medicinal chemistry for example

Une meilleure compréhension de la physiologie de la semence des céréales constitue certainement un moyen pour améliorer et développer de nouvelles variétés capables de correspondre aux besoins économiques et écologiques du moment. Les rédoxines constituent des marqueurs intéressants pour appréhender la qualité technologique et germinative du grain de blé en particulier. Le criblage des banques de données a permis d’isoler des isoformes de ces rédoxines. Cette étude a confirmé l’implication des thiorédoxines dans la réduction des protéines de réserve du blé et de maïs. Elle a permis de mettre en évidence un autre rôle de certains isoformes de thiorédoxines h dans la formation de polymères de hauts poids moléculaires. L'inhibition de l’expression de gènes par interférence ADN montre que les thiorédoxines et les glutarédoxines sont impliquées dans la protection contre le stress oxydatif chez le blé. De même, l'application d’un stress biotique simulé par la laminarine a permis de discriminer l'implication de différents marqueurs du stress, et de montrer en particulier que la 1-Cys-Prx peut être considérée comme un indicateur de l'état redox du grain pendant la germination. La mise en place d’une méthode simple et efficace de transformation des céréales via Agrobacterium, constitue un moyen pour comprendre davantage le rôle de ces rédoxines dans la gestion des stress, et les éventuelles conséquences sur la qualité technologique du grain. / A better understanding of the physiology of seed cereal constitutes certainly a means to improve and develop new varieties capable of corresponding to the actual economic and ecological needs. Redoxins are interesting markers to apprehend the technological and germinative quality of wheat seed in particular. The screening of data banks allowed isolating isoforms of these redoxins. This study confirmed the implication of thioredoxins in the reduction of storage proteins in wheat and corn seeds. It allowed to bring to light another role of some thioredoxins h isoforms in the formation of high molecular weights polymers. The inhibition of the expression of genes by DNA interference shows that thioredoxins and glutaredoxins are involved in the protection against oxidative stress in wheat. Also, the application of a biotic stress simulated by laminarin allowed to discriminate the implication of various stress markers, and to highlight in particular that the 1-Cys-Prx can be considered as an indicator of the redox state of the grain during germination and seedling. The implementation of a simple and effective method of transformation of cereal via Agrobacterium constitutes a means to understand more on the role of these redoxins in the management of the stress, and the possible consequences on the technological quality of the seed.