L’objectif de cette thèse est de définir l’effet de l’environnement maternel sur la qualité des graines de A.thaliana, H.annuus, B.oleracea et H.vulgare, caractériser deux mutants d’A.thaliana affectés au niveau d’enzymes de la membrane plasmique et caractériser l’activité de ces deux protéines. Des dosages de O₂•⁻ et de radicaux ont été faits sur des graines issues de plantes ayant subi des stress thermique et/ou hydrique et n’ont pas montré d’effet des stress. Des traitements de vieillissement accéléré ont eu des effets négatifs sur la vigueur et la viabilité des graines. Des radicaux ont été identifiés par RPE haut champ au niveau de l’enveloppe et du péricarpe. Etant donné la localisation de ces radicaux, ils ne sont pas de bons marqueurs de la qualité des graines. Des mutants KO d’A.thaliana de quinones réductases (QR) et de AIR12 ont été caractérisés. Les QR sont des enzymes cytosoliques ayant une affinité pour la membrane. Elles catalysent la réduction de quinones en dihydroquinones et jouent un rôle protecteur contre le stress oxydatif. A pH alcalin par contre, les dihydroquinones se déprotonent et s’autooxydent entrainant la formation de semiquinones et de O₂•⁻. AIR12 est un cytochrome b 561 ancré à la membrane du côté de l’apoplaste réductible par l’ascorbate et le O₂•⁻. Ces protéines pourraient être impliquées dans un transfert d’électrons à travers la membrane via la vitamine K1. Les protéines recombinantes NQR et AIR12 ont été produites. A pH alcalin, AIR12 est réduit par les semiquinones et pourrait donc récupérer les électrons du produit de NQR. En présence de membrane plasmique, la production de O₂•⁻ est augmentée avec NQR et diminuée avec NQR et AIR12. Les QR semblent avoir un rôle anti- et pro-oxydant selon les cas et AIR12 un rôle anti-oxydant. Le transfert d’électrons entre les deux protéines pourrait se faire via les semiquinones à pH alcalin et via O₂•⁻. / The aim of this work is to define the effects of adverse environmental conditions on seed quality of A.thaliana, H.annuus, B.oleracea et H.vulgare), characterize two A.thaliana mutants affected in plasma membrane proteins and characterize the activity of the two proteins. Seeds were harvested from plants subjected to drought and/or thermal stress. Then O₂•⁻ and organic radicals in seeds were measured showing no impact of the stress. Accelerated ageing had a negative effect on seed vigor and viability. Radicals have been identified by high field EPR: epi-catechin and Mn(II) in the testa and melanin in the pericarp. There was no correlation between these radicals and the seed quality, therefore these radicals were not found to be good markers of seed quality. A.thaliana KO mutants of quinone reductase (QR) and AIR12 have been characterized. QR are cytosolic enzymes that have an affinity for the membrane. QR catalyze the reduction of quinone to dihydroquinone. Thus they are known to be protective enzymes against oxidative stress. However, at alkaline pH, dihydroquinone deprotonize and form semiquinones and O₂•⁻. AIR12 is a b561 cytochrome anchored to the apoplastic side of the membrane. These proteins could be implied in a transmembrane electron transport via vitamin K1. Recombinant proteins and NQR and AIR12 were produced. At alkaline pH, AIR 12 was reduced by the semiquinone, AIR12 could form a redox couple with vitamin K1 as electron shuttle across the membrane. In the presence of plasma membrane, the production O₂•⁻ was increased with NQR and reduced with NQR and AIR12. QR appear to have an anti- and pro-oxidant according to the conditions and AIR12 an anti-oxidant role. Electron transfer between the two proteins could be done via the semiquinone at alkaline pH and via O₂•⁻.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Les REMORINES du groupe 1 sont des protéines spécifiques des plantes, localisées dans la membrane plasmique. Nous avons montré que StREM1.3 (REM) constitue un marqueur des radeaux lipidiques, des domaines membranaires du plasmalemme enrichis en stérols et sphingolipides. De plus, REM se trouve enrichie dans les plasmodesmes (PD), des canaux ancrés dans la paroi qui assurent les communications intercellulaires. Nous avons mis en évidence pour la première fois le rôle physiologique de REM dans la plante, cette protéine est capable de ralentir la propagation virale du Potato Virus X (PVX) et d’autres virus. Par ailleurs, l’activité antivirale de REM est régulée par phosphorylation et conduit à une modification de la taille du pore des PD par dépôt de callose. Des candidats protéiques ont été sélectionnées et leur validation fonctionnelle a été initiée in planta par des approches de transgénèse, en expression transitoire et sur des plantes transgéniques soumises à des infections virales pour étudier la propagation des virus. Des approches de biochimie d’interaction des protéines, et d’imagerie ont également été envisagés. Le sujet de cette thèse vise à appréhender les mécanismes de l’interaction de REM avec ses partenaires dans la membrane lors de l’infection virale, en se focalisant sur les interactions protéines-protéines lors de la réponse au PVX. Nous nous intéresserons plus particulièrement aux protéines des PD et des radeaux membranaires qui sont très probablement ciblées lors de cette interaction avec les virus. / Group 1 REMORINs are plant-specific proteins located at the plasma membrane. We have shown that StREM1.3 (REM) is a marker of lipid rafts, plasma membrane domains enriched in sterols and sphingolipids. In addition, REM is enriched in plasmodesmata channels (PD) which are anchored within the cell wall and enable intercellular communication between virtually all plant cells. We have demonstrated for the first time the physiological role of REM in plants, this protein is able to reduce the viral cell-to-cell movement of Potato Virus X (PVX) and other viruses. Moreover, the antiviral activity of REM is regulated by phosphorylation and leads to a modification of the pore size of PD via the accumulation of callose, a sugar polymer, around the neck regions of PD. In order to understand how REM is able to induce the accumulation of callose in these specific regions, a large set of proteins have been selected and the deciphering of their functions have been initiated in planta by transgenic approaches, in transient expression and on transgenic plants, which will be subjected to viral infections to study the spread of viruses. Protein interaction, biochemistry and imaging approaches were also used to study this question. This thesis aims at understanding the mechanisms of the REM interaction with its membrane partners during viral infection, focusing on the protein-protein interactions during the response to PVX. We will focus more particularly on PD proteins and membrane rafts that are most likely targeted during this interaction with viruses

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'intégrité des membranes cellulaires est essentielle à la survie et au bon fonctionnement de la cellule. Or, ces membranes sont constamment endommagées. La première partie de cette étude porte sur la réparation de la membrane plasmique perforée suite à l'exposition à des contraintes physiques, chimiques ou biochimiques. Nous décrivons un nouveau mécanisme de réparation de la membrane plasmique qui met en jeu le complexe III de la machinerie des ESCRT (endosomal sorting complex required for transport). Nos observations suggèrent que les ESCRTs seraient impliquées dans l'élimination de portions endommagées de membrane plasmique par bourgeonnement. Nos résultats portent une information novatrice dans le domaine des ESCRTs et pourrait aider à comprendre plus en détail le mode de fonctionnement des ESCRTs. La deuxième partie de cette étude porte sur la réponse cellulaire à l'endommagement physique (laser) ou chimique (par pontage chimique) d'organites de trafic. Nous montrons l'implication des mécanismes d'autophagie dans la réponse à l'endommagement des endosomes et de l'appareil de Golgi. Cette réponse comprend un recrutement rapide de la protéine LC3 (une des seules protéines détectables sur les membranes des autophagosomes matures). Nous avons montré également l'implication d'une ubiquitination rapide ainsi que du recrutement des protéines p62 et NBR1 (capables de lier à la fois l'ubiquitine et la protéine LC3). Le mécanisme observé présente de nombreux points communs avec d'autres mécanismes d'autophagie sélective mais révèle néanmoins des particularités comme le recrutement direct de LC3 sur les membranes de l'appareil de Golgi endommagé. Notre étude comprend donc l'étude de deux mécanismes cellulaires de réponse aux endommagements de membrane qui mettent en évidence l'existence de mécanismes de surveillance systématique de l'homéostasie des organelles et de la membrane plasmique. Ces mécanismes sont adaptés à la nature des membranes endommagées

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal

Conçues à partir d’une approche rationnelle, nous avons créé de nouvelles sondes membranaires permettant l’imagerie de l’organisation de la membrane plasmique cellulaire. Dans ce travail, nous avons d’abord développé un groupe d’outils, à partir du fluorophore solvatochrome Nile Red et de Black Hole Quencher-2, capable de marquer spécifiquement les domaines ordonnés et désordonnés (radeaux) en les identifiant par leur couleur d’émission. Les études cellulaires, à l’aide de ces sondes, suggèrent que la membrane plasmique est composée de deux phases distinctes. Puis dans le but de créer de nouvelles sondes basées sur Nile Red compatibles avec le sérum et fixables par formaldéhyde/glutaraldéhyde, nous avons modifié la sonde, préalablement développée, NR12S avec un groupement PEG ou amino, respectivement. Etonnamment, la sonde PEGylée est rapidement internalisée dans la cellule et le dérivé animo agrège avec l’agent fixant. D’un autre côté,basée sur Nile Red, nous avons conçu une sonde capable de détecter un récepteur donné et de visualiser son environnement lipidique. Initialement, nous avons obtenu des sondes capables d’allumer leur fluorescence en se liant sur le RCPG à l’ocytocine. Puis, nous avons conjugué NR12Spar l’intermédiaire d’un espaceur PEG(12) au ligand de l’intégrine, RGD. Les résultats préliminaires montrent que la molécule peut se lier à la membrane et détecter l’ordre lipidique, cependant les études cellulaires nécessitent un achèvement. Nous avons aussi travaillé sur des sondes membranaires fluorogéniques (turn-on) pour de l’imagerie multi-couleurs. Basées sur le fluorophore3-méthoxychromone, nous avons obtenu des sondes plus brillantes et plus photostables que la sonde développée originellement à partir de 3-hydroxychromone (F2N12S). Grâce à l’important déplacement de Stokes, elles permettent une imagerie de la membrane cellulaire avec une autofluorescence minimale dans la région spectrale bleue, compatible avec les marqueurs communs verts et rouges. Pour finir, basées sur le fluorophore squaraine, nous avons développé trois nouvelles sondes opérant dans la région rouge lointain, qui est particulièrement intéressante pour l’imagerie in vitro et in vivo. Ces sondes montrent une orientation parallèle avec la membrane lipidique, alors que les expériences cellulaires indiquent que seule la sonde avec deux ancres lipidiques est capable de marquer de façon stable la membrane plasmique. Ces sondes développées ici sont prévues pour être utilisées dans la recherche des radeaux lipidiques aussi bien que pour l’imagerie super-résolution et multi-couleurs de cellules vivantes. / Based on rational molecular design, we design new membrane probes that enable fluorescence imaging of cell plasma membrane organization. In this work, we first synthesized a toolkit, based on solvatochromic Nile Red dye and Black Hole Quencher-2, that can stain specifically ordered and disordered lipid domains (rafts) and identify them by the emission color. Cellular studies with these probes suggested that the plasma membrane is composed of two distinct phases. Then,with the idea to make Nile Red-based probes compatible with serum medium and fixable by formaldehyde/glutaraldehyde, we modified previously developed probe NR12S with PEG and aminogroups, respectively. Surprisingly, the PEGylated probe is quickly internalized inside the cell and the amino-derivative aggregates with the fixing agent. On the other hand, based on Nile Red we designed probes capable to detect a given receptor and visualize its lipid environment. Initially, we obtained probes that can turn-on fluorescence on binding to the oxytocin GPCR receptor. Then, we conjugated NR12S through a PEG(12) spacer to the ligand of intergrin, RGD. The first data show that the molecule can bind to the membrane and detect the lipid order, though cellular studies have to be completed. We also worked on fluorogenic (turn-on) membrane probes for multi-color imaging. Based on blue 3-methoxychromone dyes, we obtained probes that are brighter and more photostable than the originally developed probe based on 3-hydroxychromone (F2N12S). Due to large Stocks shift, they enabled cell membrane imaging with minimal auto-fluorescence in the blue spectral region, compatible with common green and red probes. At the end, based on squaraine fluorophore, we developed three new probes operating in the far red region, which is also very interesting for in vitro and in vivo imaging. These dyes show a parallel orientation with the lipid membrane, while the cellular experiments point out that only the probe with two anchor groups is able to stain stably the plasma membrane. The probes developed here are expected to be used for lipid rafts research as well as for super-resolution and multi-color imaging of living cells.

L'objet de ce travail est de déterminer si des variations de la composition lipidique de la membrane plasmique des hépatocytes participent à expliquer la relation causale entre les facteurs zootechniques et le rendement technologique des foies gras de palmipèdes. Nous étudions successivement l'incidence du gavage du canard mulard (Cairina moschata x Anas platyrhynchos) sur l'évolution de la composition lipidique des membranes hépatocytaires, la variabilité de cette dernière et sa relation avec la variabilité du rendement technologique des foies gras et l'incidence du délai post-prandial avant abattage sur la composition membranaire et le rendement technologique de foies gras d'oie (Anser anser). Nous montrons que le gavage induit chez le canard mulard une modification de la composition lipidique des membranes hépatocytaires avec une augmentation de la teneur en phospholipides et en cholestérol, sans modifier le rapport du cholestérol aux phospholipides. Les profils des phospholipides et de leurs acides gras constitutifs sont modifiés. Par ailleurs, si l'état d'engraissement des foies est fortement corrélé à leur rendement technologique, seul le profil des acides gras des lipides membranaires fait apparaître des liaisons faibles mais significatives avec ce dernier. Enfin, au cours de la période post-prandiale l'accrétion lipidique hépatique est en relation avec une modification du rapport du cholestérol aux phospholipides membranaires et une diminution du rendement technologique. Ces évolutions sont discutées en prenant en compte les données du métabolisme lipidique chez les oiseaux et l'incidence possible des modifications de composition des membranes plasmiques des hépatocytes sur la fluidité membranaire et audelà le rendement technologique.

Les aquaporines sont des canaux hydriques qui contrôlent la perméabilité à l'eau des membranes cellulaires, au cours du développement ou en réponse à des stress. La dynamique de l'expression des aquaporines de plantes et leur rôle physiologique ont été examinés dans deux organes modèles, le pollen et la racine d'Arabidopsis. Le pollen mature contient une cellule végétative et deux cellules de sperme. Des analyses transcriptomiques ont récemment identifié AtTIP1;3 et AtTIP5;1 comme deux aquaporines spécifiques du pollen. Dans ce travail, des protéines reportrices fluorescentes ont permis d'établir que AtTIP1;3 et AtTIP5;1 s'expriment spécifiquement dans la membrane vacuolaire de, respectivement, la cellule végétative et les cellules de sperme. Ces études révèlent aussi la grande plasticité dynamique des vacuoles, de la maturation du pollen jusqu'à la fécondation. Des approches de génétique inverse suggèrent un rôle des deux aquaporines dans la reproduction de la plante. La seconde partie de ce travail concerne les effets concomitants des stress oxydants, inhibant la conductivité hydraulique des racines et provoquant une accumulation intracellulaire des aquaporines initialement sur les membranes plasmiques. Le dernier processus a été disséqué par des approches de biochimie, pharmacologie et microscopie. La co-expression avec des marqueurs des endomembranes a révélé que l'isoforme AtPIP2;1 subit une accumulation dans les endosomes tardifs en réponse à l'H2O2. Ce processus peut être bloqué par l'auxine synthétique 1-NAA, mais non par l'inhibiteur d'endocytose tyrphostine A23. La grande stabilité des aquaporines internalisées suggère que l'H2O2 déclenche un mécanisme de séquestration réversible de celles-ci. Au-delà de données originales sur la régulation cellulaire des aquaporines, ce travail apporte un éclairage nouveau sur la dynamique des membranes intracellulaires des plantes, au cours du développement ou en réponse à des stress / Aquaporins are membrane water channel proteins that mediate the fine-tuning of cell membrane water permeability during development or in response to environmental stresses. The dynamic expression of aquaporins in planta, as well as their role in plant water relations, were investigated in two representative model organs, the pollen and roots of Arabidopsis. Mature pollen consists of a vegetative cell and two sperm cells. Transcriptomics recently identified AtTIP1;3 and AtTIP5;1 as two pollen exclusive aquaporins. Here, we investigated their in vivo temporal and spatial expression pattern. Fluorescently-tagged chimeras revealed that AtTIP1;3 and AtTIP5;1 have a distinct and specific localisation in the vacuolar membrane of the vegetative and sperm cells, respectively. The two aquaporins also revealed the dynamic plasticity of vacuoles from pollen maturation to embryo fecundation. Loss of function approaches suggest an implication of both proteins in plant reproduction. The second part of this work focused on the oxidative stress-induced internalisation of root plasma membrane aquaporins and its concomitant drop in root hydraulic conductivity. The former process was described in great detail by combined biochemical, pharmacological and microscopic approaches. Co-expression analyses of the AtPIP2;1 isoform with endomembrane markers revealed that H2O2 triggers AtPIP2;1 accumulation in late endosomal compartments. This process could be antagonized by the auxin analog 1-NAA, but not by the endocytosis blocker tyrphostin A23. Life-time analyses established the high stability of the internalised protein suggesting that H2O2 triggers a mechanism for intracellular and reversible sequestration of plasma membrane aquaporins. Besides information on cell regulation of aquaporins, the overall work gives novel and complementary insights into the dynamic remodelling of plant internal membranes during development and stress responses.