La dégradation intracellulaire des protéines est un processus fondamental qui a lieu dans tous les organismes, depuis les bactéries jusqu’aux êtres humains. La dégradation continuelle des protéines est nécessaire pour réguler les concentrations intracellulaires d’enzymes qui contrôlent toutes les réactions métaboliques, ainsi que le contenu général de toutes les autres protéines, en réponse aux modifications physiologiques. Un état d’équilibre dynamique se crée ainsi où la concentration intracellulaire d’une protéine peut être modulée aussi par des modifications de la vitesse de dégradation et de la vitesse de synthèse. Le travail présenté dans cette thèse porte sur le complexe d’activation du protéasome des cellules d’archaea (PAN). PAN est un complexe hexamerique énergie-dépendant découvert chez les archaeas et impliqué dans le dépliement des protéines substrat pour faciliter leur dégradation par le protéasome 20S. Toutes les études structurales du complexe PAN assemblé n’ont pas réussi à révéler la structure de la protéine à cause des difficultés rencontrées au niveau de la préparation et la stabilité des échantillons. La première partie du travail présenté a permis de déterminer une structure par Cryo-microscopie électronique et un modèle pseudo-atomique du complexe PAN hexamerique de Pyrococcus horikoshii. De plus, l’étude des différents états conformationnels du complexe induits par liaison du nucléotide ont permis de gagner plusieurs informations sur le mécanisme des unfoldases AAA+ et de proposer un mode d’action du complexe PAN. La seconde partie de l’étude a conduit à élucider la question sur la dynamique et les changements conformationnels des systèmes AAA+ unfoldases en général et du complexe PAN en particulier pendant le dépliement des protéines substrats. La méthode de variation de contraste en diffusion de neutrons aux petits angles (SANS) couplée avec de la spectroscopie de fluorescence appliqué à l’étude en temps réel du processus de dépliement de substrat par le système PAN de Methanococcus jannaschii a permis de révéler, pour la première fois, des mouvements de contraction de PAN pendant le dépliement du substrat induits par l’hydrolyse de l’ATP et suivis par une relaxation de la molécule à la fin du processus. Le mécanisme de dépliement par PAN semble être un mouvement de pompage péristaltique qui entraine un dépliement directionnel du substrat. L’ensemble de ce travail contribue à mieux comprendre la structure et le mécanisme d’action de la machine PAN dans les cellules et d’avoir une idée plus claire sur la dynamique fonctionnelle des complexes AAA+ à l’origine de leurs fonctions biologiques. / Intracellular protein degradation is a fundamental process occurring in all organisms, from bacteria to human. The continual degradation of proteins is necessary for regulating the intracellular levels of enzymes that control all metabolic reactions, as well as the general content of all other proteins, in response to physiological changes. A state of a dynamic equilibrium is created where the intracellular concentration of a protein can be modulated by changes in the synthesis rate as well as the degradation rate. The work presented in this thesis deals with the proteasome activating complex from archaeal cells (PAN). PAN is an energy dependent hexameric complex discovered in archaea and involved in the unfolding of protein substrates to facilitate their degradation by the 20S proteasome. All the previous structural studies on the assembled PAN complex have failed in revealing the structure of the whole complex because of the difficulties encountered during sample preparation and stabilization. In the first part of this work we determined a Cryo-electron microscopy structure and a pseudo-atomic model of the hexameric PAN complex from Pyrococcus horikoshii. In addition, the study of the different conformational states of the PAN complex induced by nucleotide binding helped in gaining several information about the AAA+ unfoldases mechanism and to propose a mode of action of the PAN complex. The second part of the study led to elucidate the question about the dynamic and the conformational changes of the AAA+ unfoldases in general and the PAN complex in particular. The method of contrast variation in Small Angle Neutron Scattering (SANS) coupled with online fluorescence spectroscopy applied to study, in real-time, the substrate unfolding process by the PAN complex from Methanococcus jannaschii allowed to reveal, for the first time, a contraction movements of PAN during substrate unfolding induced by ATP hydrolysis and followed by a relaxation of the molecule at the end of the process. The unfolding mechanism processed by PAN appears to be a peristaltic pumping motion that leads to a directional unfolding of the substrate. The whole work presented in this thesis contributes in understanding the structure and the mechanism of action of the PAN molecular machine inside the cells and to have a clearer idea about the functional dynamics of the AAA+ complexes at the origin of their biological functions.

Des mutations dans le gène de la calréticuline (CALR), codant pour une protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE), ont été découvertes récemment dans les syndromes myéloprolifératifs (SMP). Elles sont associées à augmentation de prolifération cellulaire portant spécifiquement sur la lignée mégacaryocytaire. Ceci est le résultat d’une activation constitutive de la signalisation des voies JAK-STAT et MAP Kinases, consécutive à l’interaction des protéines mutantes CALR avec le récepteur à la thrombopoïétine. Plusieurs études ont montré la faible expression de ces protéines mutées dans les cellules, mais aucune n’a déterminé l’impact de leur expression sur l’homéostasie du RE ni les acteurs mis en jeu dans leur élimination. Dans ce travail, nous avons montré que l’expression des protéines CALR mutées ne perturbe pas sensiblement l’équilibre du RE et ne modifie pas la sensibilité des cellules à l’apoptose induite par un stress du RE. Nous avons ensuite démontré dans différents modèles, y compris des cellules engagées dans la différenciation mégacaryocytaire, que les faibles niveaux intracellulaires de variants protéiques CALR n’étaient pas liés à une sécrétion accrue dans le milieu extracellulaire ni à un défaut transcriptionnel. Cette faible expression est en fait la conséquence d’une dégradation mettant en jeu principalement la voie ERAD-protéasome. Dans ce processus, la reconnaissance de motifs glycans n’est pas impliquée, mais EDEM3 semble avoir un rôle majeur puisque son extinction augmente l’expression des formes mutées de CALR. La modulation de cette dégradation pourrait constituer une approche thérapeutique innovante dans les SMP. / Mutations in the calreticulin gene (CALR), encoding for an endoplasmic reticulum (ER) resident protein, have recently been discovered in myeloproliferative neoplasms (MPN). They are associated with an increased cell proliferation, specifically in the megakaryocytic lineage. This is the result of a constitutive activation of the JAK-STAT and MAP kinase pathways, following the interaction of mutant calreticulin proteins with the thrombopoietin receptor. Several studies have demonstrated that these mutated proteins are faintly expressed in cells, but none have determined the impact of their expression on ER homeostasis, nor addressed the actors at play in their degradation. In this work, we showed that the expression of mutated CALR proteins does not significantly disturb ER equilibrium, nor does it change the cellular sensitivity to ER stress-induced apoptosis. We next demonstrated in different models including cells committed towards megakaryocytic differentiation that the poor intracellular levels of variant CALR proteins are neither due to enhanced secretion into the extracellular medium, nor to transcriptional defects. This low-level expression is mainly the result of increased degradation, involving the ERAD-proteasome pathway. In this process, the recognition of glycan motifs is not engaged, but EDEM3 seems to be a key component as its extinction increases the expression levels of variant forms of CALR. Modulating this degradation process could represent a therapeutic option for MPN patients.

Les leucémies aiguës myéloblastiques (LAM) sont des maladies hématopoïétiques caractérisées par une prolifération incontrôlée de précurseurs myéloïdes bloqués à divers stades de différenciation. Le pronostic des LAM reste sombre à cause de la résistance aux traitements et des rechutes après rémission. En conséquence, des thérapies moins intensives et mieux tolérées doivent être développées ; ceci nécessite le développement de stratégies combinatoires associant des molécules avec des modes d’action différents pour augmenter l’efficacité des traitements. Plusieurs approches sont en cours d’étude préclinique et clinique [inhibiteurs des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR, anticorps monoclonaux couplés à une drogue (Mylotarg®), inhibiteurs du protéasome (bortezomib)…] Des travaux récents ont relancé l’intérêt de l’étude des molécules d’origine naturelle pour le traitement des cancers. Ainsi, l’acide flavone-8-acétique (FAA) a suscité de nombreux espoirs au vu de son action sur les tumeurs greffées chez la souris ; il s’est néanmoins révélé inactif chez l’homme du fait d’une métabolisation différente de celle de la souris. L’objectif de ma thèse a été d’étudier les effets d’anticorps monoclonaux dirigés contre l’antigène tumoral CD13 (aminopeptidase-N) et de deux dérivés de FAA, la 2’,3-Dinitroflavone-8-acétique (DNFAA ; inhibiteur de l’activité enzymatique de CD13) et la 3,3’-Diamino-4’-méthoxyflavone (DD1) dans les LAM. Mon étude a montré que DNFAA n’affecte ni la prolifération ni la survie des cellules de LAM (lignées et cellules primaires). Cependant, le traitement de ces cellules par les anticorps anti-CD13, (MY7, SJ1D1, WM15 ; reconnaissant ou non le site enzymatique) induit l’apoptose en activant les voies extrinsèque et intrinsèque. Dans la voie intrinsèque, les anti-CD13 régulent négativement l’expression des protéines anti-apoptotiques Bcl-2 et Mcl-1 et positivement l’expression de la protéine pro-apoptotique Bax. De plus, l’activation de la voie PI3K/Akt apparaît associée au processus apoptotique. Mon étude sur les effets du 3,3’-Diamino-4’-méthoxyflavone dans les cellules de LAM montre une induction d’apoptose résultant de la convergence de l’inhibition du protéasome et de l’activation des voies extrinsèque et intrinsèque. Les cibles de DD1 sont le protéasome, la kinase p70S6K (kinase en aval de mTOR), et les protéines pro-apoptotiques Bad et Bax. De plus, j’ai mis en évidence la dégradation de p70S6K sous l’action de la caspase 3, par le traitement avec DD1, nouvelle propriété partagée par DD1 et le bortezomib. En conclusion, mon travail a permis de mettre en évidence les capacités à induire in vitro des voies d’apoptose déficientes dans les cellules de LAM, d’anticorps monoclonaux anti-CD13 et de la flavone originale, 3,3’-Diamino-4’-methoxyflavone, en tant que nouvel inhibiteur du protéasome. Les propriétés de ces agents pro-apoptotiques méritent d’être analysées de façon plus approfondie. / Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a deadly disease characterized by the clonal expansion and accumulation of hematopoietic stem cells arrested at various stages of development. Clinical research efforts are currently focusing on targeted therapies that induce apoptosis in AML cells such as PI3K/Akt/mTOR pathway inhibitors, monoclonal antibodies (Mylotarg®), proteasome inhibitor (bortezomib)… Natural products such as flavonoids have been reported as anticancer agents due to their antioxidant properties as well as to their possible interactions with signalling cascades. Therefore, flavone-8-acetic acid (FAA) has raised considerable attention since the discovery of its exceptional activity on several murine solid tumours. Unfortunately, these promising properties were not confirmed on human due to differential metabolization between human and mouse. The aim of my PhD was to study effects of monoclonal antibody against aminopeptide-N/CD13 and FAA derivatives, 2’,3-Dinitroflavone-8-acetic (DNFAA ; APN/CD13 inhibitor) and 3,3’-Diamino-4’-methoxyflavone (DD1) on acute myeloid leukaemia cells. My studies have shown that DNFAA does not modify proliferation or survival of LAM primary and cell lines. However, treatment of these cells by CD13 antibodies (MY7, SJ1D1 and WM15) induces apoptosis by triggering extrinsic and intrinsic apoptotic pathways. Regarding the intrinsic pathway, anti-CD13 down-regulate anti-apoptotic proteins Bcl-2 and Mcl-1 and up-regulate the pro-apoptotic protein Bax. Morever, PI3K/Akt signalling pathway seems to be associated with this apoptosis. My study about 3,3’-Diamino-4’-methoxyflavone effects on LAM cells has shown that DD1 induces apoptosis by proteasome inhibition and intrinsic and extrinsic pathways induction. DD1 targets p70S6 kinase (a downstream kinase of mTOR) and pro-apoptotic proteins Bad and Bax. Moreover, I have shown p70S6K degradation by caspase 3 during DD1 treatment, a new characteristic shared by DD1 and Bortezomib. As a conclusion, my works demonstrated that CD13 antibodies and a new synthetic flavone are able to induce apoptosis signalling pathway normally impaired on AML cells. Characteristics of these agents deserve to be more deeply analyzed.

La régulation de la protéolyse est un outil efficace pour le contrôle de la fonction d'une protéine dans des cellules. Nous présentons dans ce travail une stratégie générique permettant d'activer la protéolyse de façon conditionnelle par la lumière, améliorant ainsi la résolution spatio-temporelle. Notre approche repose sur un système de dégradation inductible par l'auxine (AID), mis au point en transposant des composants de la voie de dégradation contrôlée par l'auxine existant chez les plantes dans des cellules de mammifères. Nous présentons une version optimisée du système AID qui a permis de diminuer de façon significative la stabilité de protéines cibles en présence d'auxine. Nous avons en parallèle développé un déclencheur de dégradation photo-activable sous la forme d'une auxine cagée. Une illumination courte et locale permet la libération efficace de l'auxine dans les cellules et induit la dégradation de protéine d'intérêt avec un bon contrôle spatiotemporel. Cette méthode générique a été utilisée dans des contextes nucléaires et cytoplasmiques. / The regulation of proteolysis is an efficient way to control protein function in cells. Here, we present a general strategy enabling to increase the spatiotemporal resolution of conditional proteolysis by using light activation as trigger. Our approach relies on the auxin-inducible degradation (AID) system obtained by transposing components of the plant auxin-dependent degradation pathway in mammalian cells. We developed an optimized version of the AID which enables to significantly destabilize target proteins in presence of auxin. Parallely, we developed a photoactivatable auxin that acts as a photoactivatable inducer of degradation. Upon local and short light illumination, auxin is released in cells and triggers the degradation of a protein of interest with spatiotemporal control. This generic method was implemented in nuclear and cytoplasmic contexts.

Le protéasome et l’immunoprotéasome possèdent trois activités catalytiques différentes et dégradent une grande variété de protéines. Leur rôle central dans de nombreux processus tels que le contrôle du cycle cellulaire et circadien, la régulation des voies de défense contre le stress font d’eux des cibles majeures dans le processus de vieillissement et dans le traitement des cancers. Aussi, le lien établi entre l'horloge circadienne et les défenses anti-oxydantes suggère que l'homéostasie redox des protéines et leur élimination par le protéasome soient modulées par l'horloge circadienne. L’étude d’inhibiteurs bivalents et non covalents du protéasome a montré que de cibler deux sites actifs à la fois permet d’augmenter l’efficacité et la sélectivité. Nous avons également effectué l'évaluation de la pénétration cellulaire de ces molécules à l’aide de sondes fluorescentes non covalentes conçues par le laboratoire. Nous avons montré que les activités peptidases du protéasome présentent une rythmicité circadienne en antiphase avec le taux de protéines carbonylées. L'expression circadienne de NRF2 et de l'activateur PA28 expliquerait cette stimulation de l'activité du protéasome. De plus, contrairement aux fibroblastes jeunes, aucune modulation circadienne du protéasome et du niveau de ROS n’a été mise en évidence dans les fibroblastes sénescents. Des résultats préliminaires de nos inhibiteurs sur le modèle cellulaire HEK293 synchronisé montrent que leur efficacité varie en fonction du rythme circadien et qu’elle est meilleure lorsque les activités du protéasome sont minimales. Ces résultats suggèrent que le protéasome puisse être une nouvelle cible pour la chronothérapie. / Proteasome and immunoproteasome have three different catalytic activities, and degrade a wide variety of proteins. Their central role in many pathways such as control of cellular and circadian cycles, regulation of the defense pathways against stress make them major targets in the aging process and in the treatment of cancer. Also, the link between the circadian clock and antioxidant defenses suggests that the redox homeostasis of proteins and their removal by the proteasome could be modulated by the circadian clock.Studying non-covalent and bivalent proteasome inhibitors showed that targeting two active sites at the same time results in increasing their efficiency and selectivity. We also carried out the evaluation of the cell penetration of these molecules using non-covalent fluorescent probes designed in the laboratory.We have shown that the peptidase activities of proteasome exhibit circadian rhythmicity in antiphase with protein carbonyl intracellular content. The circadian expression of NRF2 and PA28 activator can explain this stimulation of proteasome activity. Moreover, in contrast to young fibroblasts, no circadian modulation of the proteasome and the level of ROS have been observed in senescent fibroblasts.Preliminary results obtained with our inhibitors on the synchronized HEK293 cell model suggest that their effectiveness varies depending on the circadian rhythm and they are more efficient when proteasome activities are minimal. These results suggest that the proteasome could be a new target for chronotherapy.

Les protéines de la famille des AAA+ ATPases sont présentes dans de nombreux complexes moléculaires. Ces protéines sont capables de s’assembler en anneaux héxamériques (homomères ou hétéromères) pour former des moteurs moléculaires. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à deux complexes macromoléculaires à AAA+ ATPases présentant un grand intérêt thérapeutique contre différents cancers : la particule régulatrice du protéasome 26S et l’hélicase du réplisome, Mcm2-7. Le protéasome 26S est la principale machinerie moléculaire impliquée dans la dégradation régulée des protéines poly-ubiquitinées tandis que l’hélicase mcm 2-7 est responsable du désappariement des brins de l’ADN chromosomique lors de la réplication de l’ADN. Ces deux complexes comprennent un anneau hétérohéxamérique de sous-unités AAA+ ATPases appelé Rpt1 à Rpt6 dans le cas du protéasome 26S et Mcm2 à Mcm7 dans le cas de l’hélicase mcm2-7. J’ai focalisé mes travaux sur l’étude du rôle du chaperon Hsm3/S5b dans l’assemblage du protéasome 26S d’une part, et le rôle spécifique de la sous-unité Mcm2 dans le transfert intergénérationnel des histones d’autre part. Le chaperon Hsm3/S5b se lie avec la sous-unité Rpt1. L’étude des complexes de levure Hsm3-Rpt1 et humain S5b-Rpt1 par cristallographie aux rayons X m’a permis de proposer que le chaperon d’Hsm3/S5b pourrait jouer un rôle de médiateur entre les sous-unités Rpt1, Rpt2 et Rpn1 lors de l’assemblage de la particule régulatrice. De plus, ce chaperon pourrait jouer également un rôle d’inhibiteur pour l’assemblage entre la particule régulatrice 19S et la particule cœur 20S du protéasome 26S. Certaines sous-unités AAA+ ATPase, telles que celles du réplisome, possèdent des domaines additionnels, leur conférant un rôle secondaire spécifique et indépendant de leur rôle principal de moteur moléculaire. C’est le cas de Mcm2, qui lie les histones H3-H4 par son domaine N-terminal. J’ai mis en évidence et caractériser cette interaction par différentes techniques biophysiques, en particulier la cristallographie aux rayons X, la RMN et le SEC-MALS. Ces résultats m’ont permis de proposer un modèle pour le transfert intergénérationnel des histones dans lequel Mcm2 joue un rôle crucial de chaperon moléculaire des histones directement intégré dans la machinerie de réplication. / AAA+ ATPases are involved in numerous molecular complexes. These proteins form homomeric or heteromeric hexamers and constitute molecular motors. During my Ph. D., I focused my work on two macromolecular complexes composed of AAA+ ATPases: the 26S proteasome regulatory particle and the Mcm2-7 helicase of the replisome. These complexes are implicated in the development of cancers and constitute interesting therapeutic targets. The 26S proteasome is the main machinery responsible for the regulated degradation of poly-ubiquitinated proteins and the helicase Mcm2-7 is responsible for the unwinding of the DNA during replication. These two complexes are composed of a heterohexameric ring of six AAA+ ATPases called Rpt1 to 6 for the 26S proteasome regulatory particle and Mcm2 to 7 for the replisome. I have studied the role of Hsm3/S5b in the assembly mechanism of the proteasome and the specific role of the subunit Mcm2 in the intergenerational transfer of the epigenetic information. X-ray structures of the complexes Hsm3-Rpt1 and S5b-Rpt1 allowed us to elucidate the dual functions of the assembly chaperone Hsm3/S5b which mediates the assembly of the subcomplex Rpt1-Rpt2-Rpn1 during the assembly of the regulatory particle. In addition, hsm3/S5b inhibits the association of a premature regulatory particle onto the core particle and protects the HbYX motif of Rpt1. Other AAA+ ATPases, like the replisome subunits, possess additional domains which confer specific roles. I also studied the interaction between the N-terminal domain of Mcm2 and the tetrameric form of histones H3-H4 by several methods like X-ray crystallography, NMR and SEC-MALS. I propose a model of the intergenerational transfer of histones H3-H4 in which Mcm2 plays a crucial role of molecular histones chaperone directly integrated in the replication machinery.

Nous nous sommes intéressés au TMC-95A, un tripeptide cyclique naturel inhibant le protéasome humain d’une façon non-covalente à des concentrations de l’ordre du nanomolaire. Nous avons montré que des mimes linéaires du TMC-95A contenant un motif 3-hydroxyoxindolyl alanine conservent l’activité inhibitrice de ce dernier. Mon travail a porté sur la synthèse d’une bibliothèque de mimes linéaires du TMC-95A en partant des amino-acides protéogéniques et des dérivés de la 3-hydroxyoxindolyl alanine. Nous avons préparé des bras espaceurs hydrosolubles contenant des motifs éthylène glycol que nous avons couplés avec les têtes inhibitrices pour l’élaboration de nouveaux inhibiteurs bivalents capables de cibler simultanément deux des six sites catalytiques du protéasome constitutif et de l’immunoprotéasome.Au cours de la synthèse de la 3-hydroxyoxindolyl alanine, il a été observé qu’en milieu basique, ce résidu C-protégé se transpose lentement et d'une façon peu décrite dans la littérature en γ-lactame. Nous avons généralisé cette réaction à la synthèse de lactames de 5 à 12 chaînons par isomérisation d’oxindoles substitués en N-1 par un groupement électroattracteur et en C-3 par une chaine ω-aminée de longueur variable. Ces oxindoles ayant une chaîne aminée ont été obtenus à partir de deux familles différentes : des composés nitrés et des dérivés N-Boc protégés. L’aptitude des différentes molécules synthétisées à inhiber le protéasome et l’immunoprotéasome a été étudiée. / Nous nous sommes intéressés au TMC-95A, un tripeptide cyclique naturel inhibant le protéasome humain d'une façon non-covalente à des concentrations de l'ordre du nanomolaire. Nous avons montré que des mimes linéaires du TMC-95A contenant un motif 3-hydroxyoxindolyl alanine conservent l'activité inhibitrice de ce dernier. Mon travail a porté sur la synthèse d'une bibliothèque de mimes linéaires du TMC-95A en partant des amino-acides protéogéniques et des dérivés de la 3-hydroxyoxindolyl alanine. Nous avons préparé des bras espaceurs hydrosolubles contenant des motifs éthylène glycol que nous avons couplés avec les têtes inhibitrices pour l'élaboration de nouveaux inhibiteurs bivalents capables de cibler simultanément deux des six sites catalytiques du protéasome constitutif et de l'immunoprotéasome. Au cours de la synthèse de la 3-hydroxyoxindolyl alanine, il a été observé qu'en milieu basique, ce résidu C-protégé se transpose lentement et d'une façon peu décrite dans la littérature en γ-lactame. Nous avons généralisé cette réaction à la synthèse de lactames de 5 à 12 chaînons par isomérisation d'oxindoles substitués en N-1 par un groupement électroattracteur et en C-3 par une chaine ω-aminée de longueur variable. Ces oxindoles ayant une chaîne aminée ont été obtenus à partir de deux familles différentes : des composés nitrés et des dérivés N-Boc protégés. L'aptitude des différentes molécules synthétisées à inhiber le protéasome et l'immunoprotéasome a été étudiée.

La dysautonomie familiale (FD) est une neuropathie causée par une mutation du gène IKBKAP induisant un épissage alternatif du pré-ARNm et une déficience de la protéine IKAP/hELP1. La compréhension des mécanismes moléculaires à l'origine de la spécificité tissulaire et le développement de thérapies curatives nous ont amené à identifier une signature des microARN caractéristique de la FD reliée au facteur d'épissage neurone-spécifique NOVA1, à partir de cellules souches olfactives humaines ecto-mésenchymateuses d'individus sains ou de patients FD. De plus, nous avons identifié le protéasome 26S comme étant suractivé chez les patients et dont le blocage corrige l'épissage aberrant du pré-ARNm d'IKBKAP tout en augmentant l’expression d’IKAP/hELP1. Ainsi, l'ensemble de ce travail apporte des perspectives de recherche novatrices pour de nombreuses pathologies neurodégénératives.Nous avons mené un projet de recherche secondaire concernant l’identification de biomarqueurs sanguins pour une maladie très fréquente, la dépression. Nous avons conduit une étude translationnelle à l'aide d'un modèle animal de stress chronique (UCMS) et identifié des signatures transcriptionnelles communes entre le sang et deux régions cérébrales, le gyrus cingulaire et le gyrus dentelé. Plusieurs biomarqueurs candidats ont été validés sur des échantillons sanguins chez la Souris et l'Homme, avec une corrélation entre la variation d'expression d'ACSL1, RALGPS1 et MPP1 et l'évolution du score clinique des patients. En conclusion, ce travail identifie de nouveaux biomarqueurs potentiels de la dépression et renforce la légitimité d'analyser des tissus périphériques dans le cadre d'une pathologie mentale. / Familial dysautonomia (FD) is a neuropathy caused by a mutation in the IKBKAP gene inducing an alternative pre-mRNA splicing and a deficiency of the protein IKAP/hELP1. The understanding of molecular mechanisms underlying tissue specificity and the development of curative therapies led us to identify a particular microRNA signature in FD associated to the neuron-spécific splicing factor NOVA1, from human olfactory ecto-mesenchymal stem cells of control individuals and FD patients. Moreover, we identified the 26S proteasome as being overactived in patients and whose inhibition corrects aberrant IKBKAP pre-mRNA splicing concomitantly to an increase of IKAP/hELP1 expression level. Taken together, these results bring innovative research perspectives for many neurodegenerative diseases.We conducted a secondary project concerning the identification of blood biomarker for a very prevalent disease, major depression. We conducted a translational study using animal model of chronic stress (UCMS) and identified common transcriptional signatures between blood and two brain regions, cingulate gyrus and dentate gyrus. Several candidate biomarkers were validated as similarly dysregulated in blood of mice and men, with correlation of expression variation of ACSL1, RALGPS1 and MPP1 in relation to clinical score evolution. In conclusion, this work identifies new potential biomarkers for depression and reinforces the legitimacy to analyze peripheral tissues in the context of mental disorders.

Une des caractéristiques des cellules tumorales est leur habileté à échapper à la mort cellulaire. Pour y parvenir, elles ont développé une stratégie consistant à éliminer sélectivement les mitochondries endommagées par un processus de mitophagie. L’acteur principal de la mitophagie est l’ubiquitine ligase Parkin ; mais elle est mutée ou absente dans la majorité des cancers. Nous avons découvert qu’une autre ligase, ARIH1, appartenant à la même famille des RBR ligases que Parkin, est capable d’induire la mitophagie en réponse à un stress. Contrairement à Parkin, ARIH1 est surexprimée dans de nombreux cancers, notamment dans les cancers du poumon permettant ainsi une augmentation de la mitophagie conférant ainsi à ces cellules une résistance au stress induit par des agents chimiothérapeutiques. La mort cellulaire la mieux caractérisée est l’apoptose qui est directement liée à l’activation de caspases. Il a pourtant été établi qu’une inhibition des caspases ne permet pas d’empêcher la mort cellulaire car il existe la « mort cellulaire indépendante des caspases » ou CICD. Cependant, sa définition moléculaire précise reste toujours inconnue. Ainsi dans ce but, un criblage siRNA pan génomique a révélé l’importance de la voie ubiquitine/protéasome. Nous avons pu identifier en particulier une enzyme E3 ligase comme étant protectrice de la CICD. Cette enzyme est surexprimée dans de nombreux cancers et pourrait permettre aux cellules cancéreuses de résister à la CICD et favoriser la progression tumorale. En résumé, ce travail a permis de souligner l’importance des ubiquitines ligases dans les mécanismes d’échappement à la mort cellulaire mis en place par les cellules cancéreuses. / One of the hallmarks of tumor cells is their ability to escape cell death.To achieve this, they have developed a strategy of selectively removing damaged mitochondria by a process of mitophagy. The main actor of mitophagy is the ubiquitin ligase Parkin; but it is mutated or absent in the majority of cancers. We have discovered that another ligase, ARIH1, belonging to the same family of RBR ligases as Parkin, is capable of inducing mitophagy in response to stress. In contrast to Parkin, ARIH1 is overexpressed in many cancers, especially in lung cancer, allowing an increase in mitophagy conferring resistance to stress induced by chemotherapeutic agents. The most characterized cell death pathway is apoptosis, which is directly related to caspases activation. However, it has been established, that caspase inhibition does not prevent cell death because there is another type of cell death called "caspase-independent cell death" or CICD. However, its precise molecular definition is still unknown. Thus for this purpose, pan-genomic siRNA screening was performed and revealed the importance of the ubiquitin / proteasome pathway. In particular, we have been able to identify an enzyme E3 ligase as being protective towards CICD. This enzyme is overexpressed in many cancers and could allow cancer cells to resist CICD and promote tumor progression. In summary, this work has highlighted the importance of ubiquitin ligases in the escape mechanisms to cell death implemented by cancer cells.

Les prions sont des protéines qui suite à des changements de conformation acquièrent un caractère infectieux. Ils sont à l’origine de traits dominants, héritables de façon non-Mendélienne, chez les mammifères, les champignons filamenteux et les levures. Le mauvais repliement et l’agrégation des protéines sont à l’origine de plus de 40 maladies, parmi lesquelles on retrouve des maladies neurodégénératives telles que les maladies d’Alzheimer, de Parkinson et de Huntington. Il a été montré que les formes agrégées des protéines supposées responsables de ces maladies (i.e. peptide amyloïde-β, tau, α-synucléine, huntingtine) se propagent de cellule en cellule à la manière des prions. La levure Saccharomyces cerevisiae possède plusieurs prions qui sont autant d’excellents modèles biologiques pour la compréhension des mécanismes de formation et de propagation des prions.[PSI+] et [URE3], issus respectivement de la conversion sous forme prion du terminateur de la traduction Sup35p et d’un régulateur du métabolisme azoté Ure2p, sont à ce jour les deux prions les mieux documentés chez la levure. Les chaperons moléculaires et leurs co-chaperons modulent la formation, la réplication et la propagation des prions chez la levure. Cependant, l’élimination ou la dégradation de ces prions sont encore mal connus. Notre laboratoire a montré que le protéasome 26S est capable de dégrader les formes soluble et fibrillaire de Sup35p. Dans la première partie de ma thèse, nous avons étudié le rôle du protéasome 26S dans la dégradation des formes soluble et fibrillaire d’Ure2p. Nous avons montré que, comme pour Sup35p, le protéasome 26S dégrade Ure2p soluble en générant des peptides amyloïdes issus du domaine prion N-terminal ainsi qu’un fragment C-terminal résistant à la protéolyse. Nous avons montré que le domaine prion déstructuré est nécessaire pour la reconnaissance et la dégradation par le protéasome. Contrairement à ce qui avait été observé pour Sup35p, Ure2p sous sa forme fibrillaire est totalement résistante à la dégradation protéasomale. Nous suggérons que la variabilité structurale aux seins des particules de prions dans un contexte cellulaire dicte leurs interactions avec les machineries protéolytiques, et plus particulièrement avec le protéasome.Les prions de levure ont principalement été étudiés dans un contexte de cellules en division active. Cependant, dans la nature, la plupart des cellules sont retrouvées dans un état quiescent post-mitotique. Nous n’avons que très peu d’informations sur le devenir des particules de prions lorsque les cellules entrent dans un état quiescent. De même les conséquences physiologiques des prions sur la survie à long terme des levures sont très peu documentées. Dans la seconde partie de ma thèse, nous avons utilisé le prion [PSI+] comme modèle pour répondre à ces questions. Différentes conformations des agrégats de Sup35p conduisent à des souches phénotypiquement distinctes du prion [PSI+]. Nous avons constaté que les agrégats de Sup35p subissent des changements ultra-structuraux et fonctionnels au cours des différentes phases de croissance cellulaire. Ainsi, nous avons observés des changements importants dans la distribution de taille et dans l’infectiosité des polymères de Sup35p résistants au SDS formant les briques élémentaires du prion [PSI+]. Ces changements interviennent sans affecter les informations structurales spécifiques à chaque souche de prion [PSI+]. De façon remarquable, bien que [PSI+] n’affecte pas le taux de croissance des levures, ce prion semble prolonger significativement la durée de vie des levures. Cet effet bénéfique semble pouvoir se fixer de façon efficace et permanente dans les cellules et persister même après élimination de [PSI+]. La fixation génétique de caractéristiques épigénétiques induites par [PSI+] ont été déjà observées et l’ensemble de ces résultats suggère que [PSI+] (et éventuellement d’autres prions) peut jouer le rôle de capaciteurs évolutifs transitoires. / “Proteinaceous infectious particles”, or prions, are self-perpetuating alternate conformations of proteins that are responsible for heritable non-Mendelian traits in mammals, filamentous fungi and yeast. On a more general note, protein misfolding and aggregation is at the origin of over forty protein folding disorders including devastating neurodegenerative diseases such as Alzheimer’s, Parkinson’s or Huntington’s diseases. The aggregated proteins responsible for these diseases (i.e. amyloid-β peptide/tau, α-synuclein and huntingtin) were shown to propagate from cell to cell in a prion-like manner. The yeast Saccharomyces cerevisiae hosts many prion or prion-like proteins, unrelated in sequence and function, which proved to be excellent models for understanding the dynamics of prion aggregation and distribution upon cell division.Sup35p and Ure2p which cause the [PSI+] and [URE3] heritable traits, respectively, stand out as the most studied and best characterized yeast prions to date. A plethora of cellular factors, mostly belonging to various molecular chaperone families, were shown to affect yeast prion formation and propagation. Clearance of protein aggregates and prion particles is however poorly understood and documented. Our laboratory showed that the 26S proteasome degrades both the soluble and prion-associated fibrillar forms of Sup35p. In the first part of my thesis, we investigated the role of the 26S proteasome in the degradation of the soluble and fibrillar forms of Ure2p. We found that, as with Sup35p, the 26S proteasome is able to degrade the soluble native Ure2p, generating an array of amyloidogenic N-terminal peptides and a C-terminal fragment which is resistant to proteolysis. The N-terminal prion domain was shown to act as a degron required for proteasomal engagement and degradation. In contrast to Sup35p, fibrillar Ure2p resisted proteasomal degradation. We expect the structural variability within prion assemblies in a cellular context to dictate their interaction with proteolytic machineries in general and the proteasome in particular.The biology of yeast prions has been mostly explored in the context of logarithmically dividing cells. In nature however, most cells are generally in a post-mitotic non-dividing quiescent state. Yet little is known about the fate and properties of prion particles upon yeast cells entry into the stationary or quiescent states and the physiological consequences of harboring these prions throughout the lifespan of yeast cells. In the second part of my thesis, we addressed this issue using the [PSI+] prion as a model. Structurally different conformers of Sup35p aggregates can lead to distinct [PSI+] strains with different prion phenotypes. We found that Sup35p prion particles undergo growth phase-dependent ultrastructural and functional changes. Indeed, the size distributions of SDS-resistant core-prion particles significantly change during growth without affecting the structural information specific to each prion strain. The infectious properties of Sup35p prion particles undergo dramatic growth phase-dependent changes. Importantly, we found that while [PSI+] has little to no effects on the growth rates of yeasts, it robustly prolongs their chronological lifespan. Furthermore, this beneficial effect can then be permanently and efficiently fixed in the cells even when [PSI+] is subsequently lost. Similar genetic fixation of [PSI+]-induced epigenetic characteristics were previously observed and suggested [PSI+] (and possibly other prions) can act as transient evolutionary capacitators.