Au cours de la croissance des levures, la cellule doit dupliquer sont génome nucléaire et mitochondrial, le processus de réplication est bien moins étudié dans les mitochondries. Néanmoins, si de multiples ADN polymérases sont impliquées dans les processus de réplication et de réparation dans le noyau, il est considéré jusqu’à aujourd’hui qu’une seule ADN polymérase est impliquée dans ces processus dans la mitochondrie. Des résultats récents mettent en exergue le fait que la situation est bien plus compliquée qu’il n’y apparait au départ. Pour élucider le processus de réplication dans la mitochondrie de levure, j’ai focalisé mon intérêt à tenter de purifier et de caractériser le complexe de réplication. Ce travail était important à développer étant donné la découverte au laboratoire d’une seconde ADN polymérase supplémentaire à la polymérase gamma, dans les mitochondries de levure. Une première partie de ma thèse a été de m’investir afin d’obtenir suffisamment de protéines dans le but d’une identification par spectrométrie de masse, compte tenu de la faible proportion des ADN polymérases dans la cellule et en particulier dans la mitochondrie. Nous avons démontré que cette polymérase est codée par le gène unique POL1. Par des techniques d’ultracentrifugation et d’analyse biochimiques, j’ai réussi à isoler et caractériser un complexe de réplication mitochondrial. Des techniques d’exclusion chromatographiques ont permis d’attribuer une masse native à ce complexe. Sa composition a été étudiée grâce à des colonnes ioniques et hydrophobes, une autre méthode d’analyse repose sur l’utilisation de colonnes d’affinité afin de reconstituer in-vitro les interactions existant entre plusieurs protéines présumées impliquées. Ainsi, un réseau d’interactions impliquant les deux ADN polymérases mitochondriales avec cinq autres protéines a été reconstitué. La masse native de différentes formes stables de ce complexe se situent à 500 kDa ou au-delà de 1 MDa. / During yeast growth, cells must duplicate their nuclear and mitochondrial DNA. The replication process involved is less studied in mitochondria. Nevertheless, if multiple DNA polymerases are implicated in the nuclear replication and repair mechanisms, until now it is believed that only one DNA polymerase is involved in these processes in mitochondria. Recent results pointed out that the situation is more complicated than preliminary believed. To elucidate the replication process in yeast mitochondria I focused my interest in attempts to purify and characterize the replication complexes. This work was important to develop in accord with the discovery in the laboratory of a second DNA polymerase in addition to the polymerase gamma in yeast mitochondria. One first part of my thesis was to hardly purify enough of this enzyme to be allowed to identify it by mass spectrometry as the DNA polymerase alpha, encoded by the unique POL1 gene. By ultracentrifugation and biochemical techniques, I succeeded to purify the complex. Exclusion chromatographies were managed to elucidate the native mass of this complex. In addition ionic and hydrophobic chromatographic columns were carried out to determine its composition. Another way to study the complex was the reconstitution in vitro of the interactions happening with some usual suspect proteins with the help of chromatographic affinity columns. I reconstituted partly an interactions model network, including the two mitochondrial DNA polymerases and 5 others proteins implicated in replication. I determined the mass of different stable forms of the isolated complexes, around 500 kDa and over 1 MDa

Les protéines de la famille des AAA+ ATPases sont présentes dans de nombreux complexes moléculaires. Ces protéines sont capables de s’assembler en anneaux héxamériques (homomères ou hétéromères) pour former des moteurs moléculaires. Au cours de ma thèse, je me suis particulièrement intéressé à deux complexes macromoléculaires à AAA+ ATPases présentant un grand intérêt thérapeutique contre différents cancers : la particule régulatrice du protéasome 26S et l’hélicase du réplisome, Mcm2-7. Le protéasome 26S est la principale machinerie moléculaire impliquée dans la dégradation régulée des protéines poly-ubiquitinées tandis que l’hélicase mcm 2-7 est responsable du désappariement des brins de l’ADN chromosomique lors de la réplication de l’ADN. Ces deux complexes comprennent un anneau hétérohéxamérique de sous-unités AAA+ ATPases appelé Rpt1 à Rpt6 dans le cas du protéasome 26S et Mcm2 à Mcm7 dans le cas de l’hélicase mcm2-7. J’ai focalisé mes travaux sur l’étude du rôle du chaperon Hsm3/S5b dans l’assemblage du protéasome 26S d’une part, et le rôle spécifique de la sous-unité Mcm2 dans le transfert intergénérationnel des histones d’autre part. Le chaperon Hsm3/S5b se lie avec la sous-unité Rpt1. L’étude des complexes de levure Hsm3-Rpt1 et humain S5b-Rpt1 par cristallographie aux rayons X m’a permis de proposer que le chaperon d’Hsm3/S5b pourrait jouer un rôle de médiateur entre les sous-unités Rpt1, Rpt2 et Rpn1 lors de l’assemblage de la particule régulatrice. De plus, ce chaperon pourrait jouer également un rôle d’inhibiteur pour l’assemblage entre la particule régulatrice 19S et la particule cœur 20S du protéasome 26S. Certaines sous-unités AAA+ ATPase, telles que celles du réplisome, possèdent des domaines additionnels, leur conférant un rôle secondaire spécifique et indépendant de leur rôle principal de moteur moléculaire. C’est le cas de Mcm2, qui lie les histones H3-H4 par son domaine N-terminal. J’ai mis en évidence et caractériser cette interaction par différentes techniques biophysiques, en particulier la cristallographie aux rayons X, la RMN et le SEC-MALS. Ces résultats m’ont permis de proposer un modèle pour le transfert intergénérationnel des histones dans lequel Mcm2 joue un rôle crucial de chaperon moléculaire des histones directement intégré dans la machinerie de réplication. / AAA+ ATPases are involved in numerous molecular complexes. These proteins form homomeric or heteromeric hexamers and constitute molecular motors. During my Ph. D., I focused my work on two macromolecular complexes composed of AAA+ ATPases: the 26S proteasome regulatory particle and the Mcm2-7 helicase of the replisome. These complexes are implicated in the development of cancers and constitute interesting therapeutic targets. The 26S proteasome is the main machinery responsible for the regulated degradation of poly-ubiquitinated proteins and the helicase Mcm2-7 is responsible for the unwinding of the DNA during replication. These two complexes are composed of a heterohexameric ring of six AAA+ ATPases called Rpt1 to 6 for the 26S proteasome regulatory particle and Mcm2 to 7 for the replisome. I have studied the role of Hsm3/S5b in the assembly mechanism of the proteasome and the specific role of the subunit Mcm2 in the intergenerational transfer of the epigenetic information. X-ray structures of the complexes Hsm3-Rpt1 and S5b-Rpt1 allowed us to elucidate the dual functions of the assembly chaperone Hsm3/S5b which mediates the assembly of the subcomplex Rpt1-Rpt2-Rpn1 during the assembly of the regulatory particle. In addition, hsm3/S5b inhibits the association of a premature regulatory particle onto the core particle and protects the HbYX motif of Rpt1. Other AAA+ ATPases, like the replisome subunits, possess additional domains which confer specific roles. I also studied the interaction between the N-terminal domain of Mcm2 and the tetrameric form of histones H3-H4 by several methods like X-ray crystallography, NMR and SEC-MALS. I propose a model of the intergenerational transfer of histones H3-H4 in which Mcm2 plays a crucial role of molecular histones chaperone directly integrated in the replication machinery.

La réplication de l’ADN est une fonction cellulaire responsable de la duplication du matériel génétique. Elle est assurée par un complexe protéique appelé réplisome. Ce processus est hautement régulé en fonction des conditions de croissance cellulaire. Durant cette thèse je me suis intéressé principalement au contrôle de la réplication par le Métabolisme Central Carboné (MCC) et, dans une moindre mesure, au fonctionnement du réplisome chez la bactérie modèle Bacillus subtilis. J’ai analysé la réplication de l’ADN dans des mutants métaboliques, par deux techniques ; la QPCR et la cytométrie en flux. Mes analyses révèlent que la réplication de l’ADN est dérégulée dans des cellules mutées dans les cinq dernières réactions de la glycolyse et dans celles affectées dans des réactions connectant cette petite région du métabolisme aux autres réactions du MCC (haut de la glycolyse, voie des pentoses phosphate et cycle de Krebs) et au milieu extérieur (voies overflow qui éliminent les métabolites du MCC produits en excès). J’ai constaté que dans ces mutants la réplication commence plutôt et dure plus longtemps que dans une souche sauvage. L’ensemble de ces résultats montre que les réactions situées au cœur du MCC sont importantes pour assurer un bon contrôle temporel de la réplication. J’ai aussi établi que le ppGpp, une petite molécule fonctionnant comme une alarmone de l’état nutritionnelle des cellules, ne joue pas un rôle déterminant dans le contrôle de la réplication par le métabolisme dans des cellules à l’état d’équilibre. L’ensemble de nos connaissances actuelles sur les réplisomes repose essentiellement sur les données accumulées à partir de la dissection du réplisome de la bactérie modèle Escherichia coli et des phages T4 et T7. Chez Bacillus subtilis, deuxième modèle bactérien le mieux connu et représentant des Gram+ à faible GC%, il existe deux ADN polymérases essentielles à la réplication : PolC et DnaE. Nous avons montré que DnaE, comme PolC, fait partie du réplisome. Nos études fournissent une explication moléculaire à la spécialisation de DnaE dans la synthèse du brin d’ADN discontinu. En conclusion, nos résultats montrent que les réplisomes bactériens ont beaucoup plus évolué qu’attendu tant dans leur composition protéique que dans leur organisation et leur fonctionnement. Ils montrent également, et pour la première fois, que le contrôle temporel de la réplication dépend de réactions situées au cœur du MCC chez B. subtilis. Ces données et d’autres de la littérature suggèrent que cette propriété pourrait être universelle et pourrait jouer un rôle important dans la carcinogenèse. / DNA replication is a central cellular function for the duplication of the genetic material. A protein complex that is called replisome carries out this function. The process of replication is highly regulated with respect to cell growth conditions. During my thesis I was primarily interested in the control of replication by the central carbon metabolism (CCM) and to a lesser extent, to the functioning of the replisome in the bacterium Bacillus subtilis. The thesis studied the DNA replication in metabolic mutants by employing two techniques; QPCR and flow cytometry. The analyses showed that DNA replication is deregulated in cells that carry the following mutations: First, cells with mutations in the last 5 reactions of glycolysis. Second, cells with mutations in the reactions that connect the last part of glycolysis to the other parts of CCM (upper part of glycolysis pathway, pentose phosphate and Krebs cycle). Third, cells mutated in the overflow genes (channels that eliminate overflow metabolites produced in excess in CCM). The results demonstrate that in these mutants the replication begins and lasts longer than in the wild strain. All of these results show that the reactions that are centrally located to the CCM are important to ensure a correct control of replication timing. I also found that the ppGpp, a small molecule that functions as an alarmone of nutritional state in the cells, does not play a decisive role in the control of replication by metabolism in cells in steady state. The current knowledge of replisomes is mainly based on accumulated data from the dissection of the replisome of the model bacterium Escherichia coli and the phages T4 and T7. Bacillus subtilis is the second well studied bacterial model, a representative of Gram+ low GC%, it carries –unlike E. coli- two essential DNA polymerases for replication: PolC and DnaE. The thesis showed that DnaE as PolC form a part of the replisome in B. subtilis and provide a molecular explanation to the specialization of DnaE in the synthesis of the DNA lagging strand. In conclusion, the results show that there is much more diversity in the protein composition, organization and functioning of replisomes in bacteria than it is expected. In addition, the thesis concluded for the first time that the temporal control of replication depends on reactions located in the heart of CCM in B. subtilis. This property, in combination with other data from the literature, suggests that it could be universal and play an important role in carcinogenesis.