La Sclérose Latérale Amyotrophique se caractérise par la perte sélective de motoneurones (MNs) du cortex, du tronc cérébral et de la moelle épinière. Les souris surexprimant le gène humain muté codant pour la superoxide dismutase 1 (mSOD1) constitue un bon modèle d'étude. Les MNs mSOD1 présentent une hypersensibilité à la mort après activation du récepteur Fas et la production d'oxyde nitrique (NO). Notre étude protéomique a identifié deux effecteurs du NO, la calréticuline (CRT) et CRMP4. CRT est une protéine chaperonne de stockage du calcium dans le réticulum endoplasmique. Nous montrons que, in vivo, CRT diminue de moitié dans une sous population de MNs mSOD1 dits vulnérables, car dégénérant les premiers. Sa diminution est nécessaire et suffisante pour induire la mort des MNs mSOD1 en activant le stress du RE. CRMP4 est une protéine de régulation de la croissance axonale, qui augmente in vivo dans les MNs mSOD1 à un stade pré-symptomatique. Sa surexpression est suffisante pour induire une dénervation périphérique et la dégénérescence de MNs mSOD1. Nos résultats mettent en évidence CRT et CRMP4 comme étant deux cibles thérapeutiques potentielles dans la SLA. / Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) is characterized by the selective degeneration of upper and lower motoneurons (MNs). The most common familial form and best characterized mouse model of ALS is linked to mutations in the gene coding for the superoxide dismutase 1 (mSOD1). MNs expressing mSOD1 show an increased sensitivity to the death induced by Fas/NO activation. Our proteomic study identified two downstream effectors of NO, Calreticulin (CRT) and CRMP4. CRT is a chaperone-calcium-binding protein of the endoplasmic reticulum, which is decreased two-fold in vivo, in an early degenerating MNs sub-population, named vulnerable. The decrease in CRT expression is both necessary and sufficient to kill mSOD1 MNs through ER stress activation. CRMP4 is a neurite outgrowth regulator which expression is increased in vivo in mSOD1 MNs at a presymptomatic stage. CRMP4 overexpression is sufficient to induce peripheral denervation and, through a dying-back effect, to kill mSOD1 MNs. Our results point out CRT and CRMP-4 as two potential therapeutic targets for ALS.

En réponse aux inducteurs de la mort cellulaire immunogénique, la calréticuline (CRT) est transportée depuis sa localisation orthotopique dans la lumière du réticulum endoplasmique (RE) vers la surface cellulaire où elle va jouer un rôle de signal puissant d’endocytose à l’endroit des cellules présentatrices d’antigène. Ici nous rapportons qu’une autre protéine, la lysyl-ARNt-synthétase (KRS), est exposée à la surface des cellules stressées où elle colocalise avec la CRT au niveau des radeaux lipidiques. La déplétionde KRS à l’aide d’ARNs interférents annihile l’exposition de la CRT induit par les anthracyclines ou les rayonnements UVC. A l’inverse de la CRT, KRS est aussi retrouvée dans le surnageant des cellules stressées. De plus, la protéine KRS recombinante (KRSr) est ici incapable d’influencer la liaison de laCRT recombinante à la surface cellulaire. Et KRSr ne possède pas la capacité de stimuler des macrophages in vitro. Enfin nous révélons que le statut de phosphorylation d’eIF2α constitue un critère différentiel entre l’oxaliplatine et la cisplatine, capable de rendre compte de l’incapacité de cette dernière à entrainer l’exposition de la CRT, et ce malgré une très grande ressemblance chimique entre ces deux composés. Ces résultats mettent donc en exergue la contribution respective de KRS et du stress du RE dans l’émission du signal prototypique de la mort immunogénique. / In response to immunogenic cell death inducers, calreticulin (CRT) translocates from its orthotopiclocalization in the lumen of the endoplasmic reticulum (ER) to the surface of the plasma membrane where it serves as a potent engulfment signal for antigen-presenting cells. Here, we report that another protein, the lysyl-tRNA-synthetase (KRS), was exposed on the surface of stressed cells, on which KRS co-localized with CRT in lipid rafts. Depletion of KRS with small interfering RNAs suppressed CRT exposure induced by anthracyclines or UVC light. In contrast to CRT, KRS was also found in the supernatant of stressed cells. Recombinant KRS (rKRS) protein was unable to influence the binding of recombinant CRT to the cell surface. Moreover, rKRS protein was unable to stimulate macrophages invitro. Finally, we reveal that the phosphorylation status of eIF2α constitute a differential criteria between oxaliplatin and cisplatin (CDDP), accounting for the incapacity of CDDP to trigger the exposure ofCRT, despite their structural and chemical similarities. These results underscore the respective contribution of KRS and ER stress to the emission of the prototypic signal of immunogenic cell death.

La mort cellulaire par apoptose est un processus biologique fondamental, nécessitant des interactions fines avec le système immunitaire pour une reconnaissance et une élimination efficace des cellules mortes. C'est ainsi que C1q, une molécule du complément, essentielle dans le système immunitaire inné, a été mise en évidence comme fortement impliquée dans le mécanisme de reconnaissance et d'élimination des cellules apoptotiques, notamment via sa région globulaire (C1qGR). Récemment, la translocation de la calréticuline (CRT) au niveau externe de la membrane plasmique des cellules cancéreuses a été identifiée comme un signal " eat-me " pouvant être immunogène. Initialement, l'interaction entre la CRT et C1q a été caractérisée à la surface des phagocytes et la CRT a été considérée comme un récepteur pour les queues collagènes de C1q (C1qCLF). L'ensemble de ces observations est en faveur d'un double rôle de la CRT, à la surface des phagocytes et des cellules apoptotiques. Dans un premier temps, l'élaboration d'une stratégie de FRET a permis de détecter une interaction directe entre la CRT et C1qGR à la surface de la cellule HeLa en apoptose précoce. Dans un second temps, la mise en place de tests de phagocytose a permis de montrer que la calréticuline exposée à la surface des cellules apoptotiques peut moduler la phagocytose : des effets opposés ont été observés selon le modèle cellulaire utilisé (HeLa traitées par des ARNi ou MEF CRT-/-) et dans certaines conditions, une modulation combinée de la calréticuline et de C1q a été observée sur la réponse inflammatoire (production de cytokines).

L'efferocytose est un phénomène physiologique par lequel des millions de cellules apoptotiques sont efficacement éliminées par phagocytose sans provoquer une réaction inflammatoire. L'efficacité de ce processus nécessite une interaction rapide entre la cellule apoptotique et son phagocyte afin d'éviter l'entrée de la première dans une phase de nécrose secondaire. Cette interaction implique des motifs de la surface des 2 cellules qui peuvent interagir directement ou aussi indirectement via des molécules de pontage. Ce dernier rôle est associé à C1q, premier composant du système du complément. En effet, C1q favorise l'élimination des cellules apoptotiques et aussi la réponse tolérogène en interagissant avec des ligands présents de part et d'autre de la synapse efferocytaire. La calréticuline (CRT) de surface fait partie de ces ligands. Initialement connue comme co-récepteur, avec CD91, de la queue collagène de C1q à la surface du phagocyte, la CRT est aujourd'hui décrite comme un signal « eat-me » de la surface des cellules apoptotiques où elle peut aussi interagir avec les têtes globulaires de C1q. Des études récentes ont soulevé le potentiel immunogénique de la CRT, notamment au cours de la mort des cellules cancéreuses. Ainsi, la CRT de surface joue un rôle important dans l'efferocytose même si l'on ne sait pas exactement comment cette protéine chaperonne résidente du réticulum endoplasmique est exposée à la membrane plasmique. Dans un premier temps, j'ai démontré que la CRT augmente à la surface des cellules Jurkat rapidement après l'induction de l'apoptose, à un stade où la phosphatidylsérine, marqueur emblématique de l'apoptose, n'est pas encore détectée. D'une manière intéressante, C1q est capable d'interagir directement avec la CRT exposée à la surface des cellules à ce stade « pré-apoptotique », et de favoriser significativement leur phagocytose par les macrophages THP1. Dans un deuxième temps, j'ai mis en évidence la présence de la CRT dans le milieu extracellulaire et montré qu'elle varie avec l'évolution de l'apoptose. De plus, la CRT soluble est capable d'induire la migration des macrophages THP1, d'augmenter l'expression à leur surface de CD14, récepteur impliqué dans l'efferocytose, et de stimuler la macropinocytose, un processus utilisé par les phagocytes lors de la phagocytose des cellules apoptotiques. Cela suggère que la CRT extracellulaire peut moduler la biologie du phagocyte. Enfin, la CRT exogène peut se lier à la surface des macrophages et peut être ainsi une source externe de la CRT retrouvée à la surface des phagocytes. / Efferocytosis is a physiological phenomenon whereby millions of apoptotic cells are efficiently removed by phagocytosis without inducing an inflammatory response. The efficiency of this process requires rapid interaction between the apoptotic cell and the phagocyte in order to prevent the entry of the dying cell in a secondary necrosis phase. This interaction involves patterns of the surface of the 2 cells that can interact directly or indirectly via bridging molecules. The latter role is associated to C1q, the first component of the complement system. Indeed, C1q promotes the removal of apoptotic cells and the tolerogenic response by interacting with ligands present on either side of the efferocytic synapse. Surface exposed calreticulin (CRT) is one of these ligands. Initially known as the co-receptor, with CD91, to the collagenous tail of C1q on the phagocyte surface, CRT is now described as an “eat-me" signal of the apoptotic cell surface where it can also interact with the globular heads of C1q. Recent data have revealed the immunogenic potential of CRT, especially in the case of cancer cell death. Thus, surface exposed CRT plays an important role in efferocytosis even if it is not fully understood how this reticulum endoplasmic resident protein gets to the plasma membrane. I firstly demonstrated that CRT increases rapidly on the surface of Jurkat cells after the induction of apoptosis, at a stage where phosphatidylserine, emblematic marker of apoptosis, is not yet detected. Interestingly, C1q is capable of interacting directly with this “pre-apoptotic” cell surface exposed CRT, and promotes significantly the uptake of Jurkat cells by THP1 macrophages at this stage. Secondly, I demonstrated the presence of CRT in the extracellular medium whose content depends on the evolution of apoptosis. Furthermore, soluble CRT induces the migration of THP1 macrophages, increases their surface expression of CD14, a receptor involved in efferocytosis, and stimulates macropinocytosis, a process used by phagocytes during phagocytosis of apoptotic cells. These results suggest that the extracellular CRT can modulate the biology of the phagocyte. Finally, exogenous CRT binds to the surface of macrophages and can therefore be an external source of the CRT found on the phagocyte surface.

Des mutations dans le gène de la calréticuline (CALR), codant pour une protéine résidente du réticulum endoplasmique (RE), ont été découvertes récemment dans les syndromes myéloprolifératifs (SMP). Elles sont associées à augmentation de prolifération cellulaire portant spécifiquement sur la lignée mégacaryocytaire. Ceci est le résultat d’une activation constitutive de la signalisation des voies JAK-STAT et MAP Kinases, consécutive à l’interaction des protéines mutantes CALR avec le récepteur à la thrombopoïétine. Plusieurs études ont montré la faible expression de ces protéines mutées dans les cellules, mais aucune n’a déterminé l’impact de leur expression sur l’homéostasie du RE ni les acteurs mis en jeu dans leur élimination. Dans ce travail, nous avons montré que l’expression des protéines CALR mutées ne perturbe pas sensiblement l’équilibre du RE et ne modifie pas la sensibilité des cellules à l’apoptose induite par un stress du RE. Nous avons ensuite démontré dans différents modèles, y compris des cellules engagées dans la différenciation mégacaryocytaire, que les faibles niveaux intracellulaires de variants protéiques CALR n’étaient pas liés à une sécrétion accrue dans le milieu extracellulaire ni à un défaut transcriptionnel. Cette faible expression est en fait la conséquence d’une dégradation mettant en jeu principalement la voie ERAD-protéasome. Dans ce processus, la reconnaissance de motifs glycans n’est pas impliquée, mais EDEM3 semble avoir un rôle majeur puisque son extinction augmente l’expression des formes mutées de CALR. La modulation de cette dégradation pourrait constituer une approche thérapeutique innovante dans les SMP. / Mutations in the calreticulin gene (CALR), encoding for an endoplasmic reticulum (ER) resident protein, have recently been discovered in myeloproliferative neoplasms (MPN). They are associated with an increased cell proliferation, specifically in the megakaryocytic lineage. This is the result of a constitutive activation of the JAK-STAT and MAP kinase pathways, following the interaction of mutant calreticulin proteins with the thrombopoietin receptor. Several studies have demonstrated that these mutated proteins are faintly expressed in cells, but none have determined the impact of their expression on ER homeostasis, nor addressed the actors at play in their degradation. In this work, we showed that the expression of mutated CALR proteins does not significantly disturb ER equilibrium, nor does it change the cellular sensitivity to ER stress-induced apoptosis. We next demonstrated in different models including cells committed towards megakaryocytic differentiation that the poor intracellular levels of variant CALR proteins are neither due to enhanced secretion into the extracellular medium, nor to transcriptional defects. This low-level expression is mainly the result of increased degradation, involving the ERAD-proteasome pathway. In this process, the recognition of glycan motifs is not engaged, but EDEM3 seems to be a key component as its extinction increases the expression levels of variant forms of CALR. Modulating this degradation process could represent a therapeutic option for MPN patients.

La mort cellulaire par apoptose est un processus biologique fondamental, nécessitant des interactions fines avec le système immunitaire pour une reconnaissance et une élimination efficace des cellules mortes. C'est ainsi que C1q, une molécule du complément, essentielle dans le système immunitaire inné, a été mise en évidence comme fortement impliquée dans le mécanisme de reconnaissance et d'élimination des cellules apoptotiques, notamment via sa région globulaire (C1qGR). Récemment, la translocation de la calréticuline (CRT) au niveau externe de la membrane plasmique des cellules cancéreuses a été identifiée comme un signal « eat-me » pouvant être immunogène. Initialement, l'interaction entre la CRT et C1q a été caractérisée à la surface des phagocytes et la CRT a été considérée comme un récepteur pour les queues collagènes de C1q (C1qCLF). L'ensemble de ces observations est en faveur d'un double rôle de la CRT, à la surface des phagocytes et des cellules apoptotiques. Dans un premier temps, l'élaboration d'une stratégie de FRET a permis de détecter une interaction directe entre la CRT et C1qGR à la surface de la cellule HeLa en apoptose précoce. Dans un second temps, la mise en place de tests de phagocytose a permis de montrer que la calréticuline exposée à la surface des cellules apoptotiques peut moduler la phagocytose : des effets opposés ont été observés selon le modèle cellulaire utilisé (HeLa traitées par des ARNi ou MEF CRT-/-) et dans certaines conditions, une modulation combinée de la calréticuline et de C1q a été observée sur la réponse inflammatoire (production de cytokines). / Cell death by apoptosis is a fundamental biological process, requiring fine interactions with the immune system for the effective recognition and removal of the apoptotic cells. C1q, a complement molecule, essential in the innate immune system, has been shown to be strongly involved in the mechanism of recognition and elimination of apoptotic cells, mainly through its globular region (C1qGR). Recently, the translocation of calreticulin (CRT) at the surface of cancer cells has been identified as an eat-me signal, which can be immunogenic. Initially, the interaction between CRT and C1q was characterized on phagocytes surface and CRT was described as a receptor for the collagenous tails of C1q (C1qCLF). All these observations support a dual role of CRT at the surface of phagocytes and their targets. At first, using a FRET strategy we achieve to detect a direct interaction between CRT and C1qGR at the surface of early apoptotic HeLa cells. Second, the establishment of phagocytosis assays showed that calreticulin exposed at the surface of apoptotic cells could modulate phagocytosis: opposite effects were observed depending on the cellular model used (RNAi treated HeLa or MEF CRT-/-) and under certain conditions, a combined modulation of calreticulin and C1q was observed on the inflammatory response (cytokine production).

L’amélioration constante du pronostic des pathologies cancéreuses est le fruit des progrès réalisés dans leur prévention, leur dépistage, leur diagnostic et leur traitement. Malgré l’avènement récent des thérapies ciblées, la chimiothérapie conventionnelle reste souvent le seul recours pour des patients atteints de cancer non opérable ou non éligibles pour ces thérapeutiques novatrices. Certaines chimiothérapies conventionnelles (anthracyclines et oxaliplatine notamment) ont la capacité d’entrainer une mort des cellules tumorales dont les caractéristiques permettent d’induire une réponse immunitaire antitumorale efficace. Cette réponse immunitaire antitumorale spécifique agirait en synergie avec l’effet cytotoxique direct de ces drogues, participant ainsi à leur efficacité. La réponse immunitaire antitumorale induite par la chimiothérapie dépend de plusieurs mécanismes moléculaires et cellulaires clefs identifiés récemment. L’induction d’un stress du réticulum endoplasmique (RE) est à l’origine de l’exposition d’une protéine chaperonne résidente du RE, la calréticuline (CRT), à la surface des cellules mourantes, servant alors de signal de phagocytose pour les cellules dendritiques. La libération dans le milieu extracellulaire de signaux de danger est également essentielle : la protéine nucléaire High Mobility Group Box 1 (HMGB1) sert ainsi de ligand pour le Toll-like récepteur 4 (TLR4), présent à la surface des cellules dendritiques et son activation favorise l’apprêtement et la présentation des antigènes tumoraux aux lymphocytes T cytotoxiques. L’adénosine-5'-triphosphate (ATP) est également libéré par les cellules tumorales, entrainant l’activation des récepteurs purinergiques P2RX7 présents à la surface des cellules dendritiques, activant l’inflammasome NLRP3 et entrainant la libération d’IL-1 par les cellules dendritiques, favorisant alors l’orientation de la réponse immunitaire vers une réponse de type TH1 et la production d’interféron  par les lymphocytes T cytotoxiques. Dans ce travail, nous avons cherché à comparer la capacité de deux drogues issues d’une même classe de chimiothérapie, les sels de platine, à induire une mort cellulaire immunogène des cellules tumorales. Grace à des expériences in vitro et in vivo (modèles murins de vaccination antitumorale et de chimiothérapie sur tumeurs établies), nous avons pu montrer que l’oxaliplatine (OXP), contrairement au cisplatine (CDDP), avait la capacité d’induire une mort immunogène des cellules de cancer colique et que cette différence intra-classe dépendait de la capacité respective de ces deux drogues à entrainer un des phénomènes clés de l’induction d’une mort cellulaire immunogène, l’exposition de la CRT à la surface des cellules tumorales mourantes. Nous avons également pu montrer que l’induction d’une mort cellulaire immunogène des cellules de cancer colique par l’oxaliplatine avait une relevance clinique chez l’homme, l’existence d’un polymorphisme perte-de-fonction du gène tlr4 affectant le pronostic (survie sans progression) de patients traités par chimiothérapie pour un cancer colique métastatique. Par la suite, nous avons mis au point des biosondes permettant d’étudier à grande échelle, à l’aide d’une plateforme de vidéo-microscopie automatisée, la capacité de différentes drogues à induire les différents phénomènes clefs de la mort cellulaire immunogène des cellules tumorales (exposition de la CRT, libération d’HMGB1 et d’ATP). Nous avons ainsi pu montrer que la correction pharmaceutique du défaut d’activation d’un stress du réticulum endoplasmique par le cisplatine permettait de restaurer l’immunogénicité de la mort cellulaire induite par cette chimiothérapie. Ces résultats ouvrent la voie à la découverte de nouvelles molécules susceptibles, à elles seules ou en association à d’autres thérapies connues, d’améliorer le pronostic des néoplasies. / The steady improvement of cancer prognosis is the result of progress in cancer prevention, screening, diagnosis and treatment. Despite the recent advent of targeted therapies, conventional chemotherapy often remains the only solution for patients with non-operable cancer or not eligible for these novel therapies.Some conventional chemotherapy (including anthracyclines and oxaliplatin) has the ability to cause tumor cells death with characteristics able to induce an effective antitumor immune response. This specific antitumor immune response would be synergistic with the direct cytotoxic effect of these drugs and contribute to their efficacy. The antitumor immune response induced by chemotherapy depends on several key cellular and molecular mechanisms recently identified. The induction of an endoplasmic reticulum (ER) stress is necessary for the exposure of calreticulin (CRT), an ER-resident chaperone protein, on the surface of dying cells, then acting as a phagocytosis signal for dendritic cells. Release of danger signals into the extracellular medium is also essential. The nuclear protein High Mobility Group Box 1 (HMGB1) is a ligand of the Toll-like receptor 4 (TLR4) on the surface of dendritic cells. TLR4 activation promotes the processing of tumor antigens and their presentation to cytotoxic T lymphocytes. Adenosine-5'-triphosphate (ATP) is also released by tumor cells, leading to the activation of the purinergic receptors P2RX7 expressed on the surface of dendritic cells, activating the NLRP3 inflammasome and causing the release of IL-1β by dendritic cells, while promoting the orientation of the immune response towards a TH1 response and the production of γ-interferon by cytotoxic T lymphocytes.In this work, we aimed to compare the ability of two drugs of a same class of chemotherapy, the platinum derivates oxaliplatin (OXP) and cisplatin (CDDP), to induce immunogenic death of tumor cells. Thanks to in vitro and in vivo experiments (models of tumor vaccination and chemotherapy on established tumors in mice), we showed that OXP, in contrast to CDDP, has the ability to induce immunogenic death of colon cancer cells. This intra-class difference depends on the ability of each drug to cause one of the key phenomena of immunogenic cell death: the induction of the exposure of the CRT to the surface of dying tumor cells. We could also show that the induction of immunogenic death of colon cancer cells by OXP had clinical relevance in humans. Indeed, the existence of a loss-of-function polymorphism of tlr4 affects the prognosis (PFS) of patients treated with OXP-based chemotherapy regimen for a metastatic colorectal cancer. Subsequently, we developed biosensors to study the ability of different drugs to induce key phenomena of cell death immunogen tumor cells (CRT exposure, HMGB1 and ATP release) using high-content screening by an automated video-microscopy platform. We showed that a pharmaceutical correction of the inability of cisplatin to induce an endoplasmic reticulum stress could restore the immunogenicity of cisplatin-induced tumor cell death. These results open the way to the discovery of new molecules that, alone or in combination with other known therapies, could improve the prognosis of cancer.

L'élimination des cellules apoptotiques est un évènement critique pour le maintien de l'homéostasie tissulaire et pour le contrôle des réponses immunes orchestrées par les phagocytes. A l'heure actuelle, les acteurs et en particulier les signaux « eat-me » impliqués ne sont pas encore entièrement caractérisés. C1q, élément de reconnaissance du complément, participe à la reconnaissance des structures altérées du soi et est un acteur majeur de la tolérance immune. Le travail a porté sur l'identification des signaux exposés au cours de l'apoptose et responsables de la fixation de C1q. Dans un premier temps, l'utilisation de la résonance plasmonique de surface a permis de montrer que C1q se fixe de façon précoce après induction de l'apoptose et que cette reconnaissance implique un composant membranaire. Dans un deuxième temps, différentes approches (biologie cellulaire, biochimie et biologie structurale) ont permis d'identifier la phosphatidylsérine et le désoxyribose de l'ADN comme cibles de C1q à la surface des cellules apoptotiques. Enfin, le rôle respectif au cours de l'apoptose de partenaires connus de C1q (calréticuline et p33) a été précisé. Etant donné la versatilité des propriétés de reconnaissance de C1q, cette molécule aurait donc la capacité originale de détecter et de collecter différents signaux, qui pris ensemble fourniraient un signal fort permettant l'élimination efficace des cellules apoptotiques.

Pendant très longtemps, les traitements contre les cancers se sont basés sur la cytotoxicité des chimiothérapies, sur leur capacité à tuer directement les cellules malignes ou à induire leur senescence. Mais cette cytotoxicité accrue et non ciblée a également pour effet de tuer les cellules du système immunitaire du patient. Cependant, il a été montré que la radiothérapie, les anthracyclines ainsi que l’oxaliplatine étaient capables d’induire une apoptose décrite comme étant une mort cellulaire immunogène. De ce fait, les cellules tumorales mourantes agiront comme vaccin thérapeutique.La mort cellulaire immunogène se caractérise par trois grands marqueurs : un stress du réticulum endoplasmique pré-mortem qui va induire la translocation de la calréticuline de la lumière du réticulum endoplasmique vers la surface cellulaire, la libération d’ATP dans le milieu extracellulaire permettant le recrutement des cellules dendritiques et l’activation de l’inflammasome NLRP3 via le récepteur P2RX7, et enfin la libération de la protéine HMGB1 dans le milieu extracellulaire, qui va aller interagir avec TLR4 à la surface des cellules dendritiques pour stimuler leur fonction présentatrice d’antigène. La première partie de ce travail a consisté à comprendre les mécanismes moléculaires précis par lesquels l’ATP est sécrétée activement lors d’une mort cellulaire immunogène. En utilisant une combinaison de techniques impliquant des criblages pharmacologiques, des techniques de monitorage de la localisation intracellulaire de l’ATP entre autres, nous avons montré qu’après un traitement par les inducteurs de la mort immunogène, l’ATP était redistribué des lysosomes aux autolysosomes et que sa sécrétion requiert la protéine lysosomale LAMP1. Nous avons également montré qu’il existait d’autres voies de libération d’ATP telles que la voie de signalisation Rho, et également l’ouverture des hémicanaux pannexine 1 (PANX1). De façon surprenante, nous avons observé une implication de PANX1 dans la translocation de LAMP1 à la surface cellulaire. Ces résultats ont permis de comprendre un peu plus précisément les mécanismes de sécrétion d’ATP dans la mort cellulaire immunogène, mettant en évidence l’importance de l’exocytose lysosomale caspases dépendante et PANX1 dépendante.La seconde partie de ce travail s’est portée sur l’étude d’une autre caractéristique de la mort cellulaire immunogène, à savoir l’exposition de la calréticuline à la surface cellulaire. En partant du constat qu’après un traitement par la mitoxantrone, la calréticuline était relocalisée en périphérie à la fois dans les cellules humaines et les cellules de levure, il a été suggéré que la voie d’exposition de la calréticuline était conservée phylogénétiquement. Nous avons montré que les phéromones pouvaient agir comme inducteurs physiologiques de l’exposition de la calréticuline dans les cellules de levure. Un criblage d’ARN interférant et des analyses de transcriptome nous ont permis de montré que les chimiokines, en particulier CXCL8 chez l’humain (appelé également interleukine-8) et son orthologue Cxcl2 chez la souris étaient impliquées dans la translocation de la calréticuline à la surface cellulaire. En traitant les cellules cancéreuses par la mitoxantrone, nous observons une production de CXCL8 par les cellules cancéreuses humaines in vitro et de Cxcl2 par les cellules cancéreuses murines in vivo. Un « knockdown » des récepteurs pour CXCL8/Cxcl2 réduit de manière significative l’exposition de la calréticuline à la surface cellulaire. Ces résultats ont donc montré l’importance des chimiokines dans la voie d’exposition de la calréticuline.L’ensemble de ce travail a permis de comprendre plus en détails deux des trois grandes caractéristiques de la mort cellulaire immunogène. / Cytotoxic anti-neoplastic agents were considered for a long time to mediate their therapeutic effects via their capacity to directly kill malignant cells. Nevertheless, this high cytotoxicity is non-targeted and will eventually diminish immune cells. During the last years, it has been shown that radiotherapy and some anticancer agents, such as anthracyclines and oxaliplatin, can stimulate actively anti-tumor immune responses. In fact, they can induce an immunogenic type of apoptosis, which we termed immunogenic cell death (ICD). Thereby, dying cells can act as therapeutic vaccine against residual cancer cells that overcame the initial treatment.ICD is characterized by three major hallmarks: a pre-mortem stress of the endoplasmic reticulum (ER), which triggers the translocation of the ER chaperone protein called calreticulin (CRT) to the cell surface, the secretion of ATP from apoptotic cells, which acts as a signal for the recruitment of dendritic cells and for the activation of the NLRP3 inflammasome via its receptor P2RX7, and the release of HMGB1 into the extracellular space, allowing it to interact with TLR4 and thus stimulate the antigen-presenting functions of the DCs.The first part of my work focused on the precise molecular mechanisms by which ATP is actively secreted during ICD. Using a large panel of techniques, including chemical compounds screens and monitoring the subcellular localization of ATP, we showed that following treatment of various tumor cells with ICD inducers, ATP is redistributed from lysosomes to autolysosomes and the lysosomal protein LAMP1 is required for active ATP secretion. We also showed that Rho and pannexin 1 (PANX1) are indispensable for efficient ATP release in response to ICD inducers. Surprisingly, we observed an unexpected link between PANX1 and the exposure of LAMP1 at the cell surface. These results will help to understand the mechanisms necessary for ATP secretion during ICD.In the second part of this work we further studied the surface exposure of CRT during ICD. We observed that mitoxantrone (MTX), which belongs to the group of anthracyclines, can induce a peripheral relocalisation of CRT, both in human cells and yeast cells. In addition, we showed that pheromones can act as a physiological inducer of CRT translocation in yeast. Focused siRNA screening combined with transcriptome analyses revealed that human CXCL8 (also called interleukin-8) and its mouse ortholog Cxcl2 play an essential role in the translocation of CRT to the cell surface. Interestingly, MTX-treated human cancer cells displayed an elevated production of CXCL8 in vitro. These results were confirmed in vivo, with MTX treated murine tumors, which also displayed elevated Cxcl2 levels. The MTX-induced CRT exposure was significantly reduced when we performed a knockdown of CXCL8/Cxcl2 receptors. Altogether, these results showed the importance of chemokine signaling circuitries in immunogenic CRT exposure.This work allows for the detailed understanding of the mechanisms of ICD and might thus be useful for further targeted drug development.

Au cours de cette thèse, nous avons étudié plus particulièrement deux calréticulines de parasite et leur interaction avec la protéine C1q humaine, dans un contexte de détournement du système immunitaire. En effet, une stratégie de mimétisme moléculaire avec des cellules apoptotiques a été proposée pour l'exposition de calréticuline à la surface de la forme infectieuse du parasite Trypanosoma cruzi, agent vecteur de la maladie de Chagas. Dans le cas du parasite Entamoeba histolytica, agent vecteur de l'amibiase, l'interaction de C1q avec la calréticuline exposée à la surface de l'amibe est utilisée pour mieux phagocyter les cellules de l'hôte.La calréticuline est une protéine principalement localisée dans le réticulum endoplasmique où elle joue le rôle de protéine chaperonne en favorisant le repliement des protéines monoglucosylées. Une des fonctions extracellulaires de la calréticuline humaine est de favoriser l'élimination des cellules apoptotiques par les macrophages. Pour cela, la calréticuline est exposée à la surface des deux types cellulaires, à la surface desquelles elle est reconnue par C1q.Nous avons résolu la structure de fragments des deux CRTs de parasite. Des interactions de type chaperonne et un aperçu de la flexibilité du domaine P ont été observés dans l'empilement cristallin et approfondis par analyse de diffusion des rayons X aux petits angles. Ces fragments générés pour l'analyse structurale nous ont permis en plus d'identifier une région clé dans l'interaction des calréticulines avec C1q. Du côté de C1q, deux mutations dans les régions globulaires de C1q (GRC1q), inhibent l'interaction avec la CRT et les IgM, suggérant un site partagé. Pour approfondir la caractérisation de l'interaction, des études du complexe par RMN ont débuté et nous avons développé une première forme recombinante monocaténaire de GRC1q, dont nous avons déterminé la structure. Nos recherches peuvent aider à développer des traitements contre ces parasites, aussi bien qu'à décrypter le rôle de la CRT des mammifères présente à la surface des macrophages et des cellules apoptotiques. / During this thesis, we were interested in two parasite calreticulin and their interaction with the human C1q protein in the context of the subversion of the immune system. Indeed, a molecular mimicry strategy with human apoptotic cells is suggested for the calreticulin exposure on the surface of the infectious form of the parasite Trypanosoma cruzi, which is responsible of Chagas' disease. In the case of the parasite Entamoeba histolytica, which is involved in amoebiasis, the interaction of C1q with the surface-exposed calreticulin is used to enhance phagocytosis of host cells.Calreticulin is mainly localised in the endoplasmic reticulum, where it acts as a chaperone protein to favour the folding of monoglycosylated proteins. Moreover one of the extracellular functions of human calreticulin is to enhance the clearance of apoptotic cells by macrophages. This function is mediated through C1q interaction with calreticulin exposed on the surface of both cells.We solved the structure of fragments of both parasite calreticulins. Chaperone-like interactions and an overview of the flexibility of the P domain were observed in the crystal packing and deepened using SAXS analyses. The fragments generated for X-ray crystallography studies allowed us to identify a key region of the interaction between C1q and the calreticulins. Two C1q mutations located in its globular regions (GRC1q) inhibit the interaction with calreticulin and IgM, suggesting a common binding area. To further characterise theses interactions, we started NMR experiments and we produced the first single-chain recombinant form of GRC1q, which allowed solving its structure at high-resolution. Our investigations could provide tools to develop therapies against these parasites, and to decipher the role of mammal CRT on the surface of macrophages and apoptotic cells.