Le syndrome de l’intestin irritable (SII) est un trouble fonctionnel d’origine multifactorielle, impliquant des facteurs environnementaux tels que le stress, l’alimentation et met en jeu un dysfonctionnement de l’axe intestin-cerveau, une micro-inflammation, une dysbiose et une hyperperméabilité intestinale. Le rôle du protéasome dans la régulation de la barrière intestinale au cours du SII a été étudié. De plus, ces troubles fonctionnels intestinaux (TFI) ont également été décrits comme exacerbés chez des patients souffrant d’obésité, dont la physiopathologie est complexe. Néanmoins, les mécanismes impliqués dans cette association restent mal compris et ont donc été recherchés. Dans ce travail, des modèles murins « SII-like » comme le modèle de stress « water avoidance stress » ou WAS et le modèle post-inflammatoire « post-TNBS » ont été utilisés afin d’étudier l’impact d’une inhibition du protéasome sur la régulation de la perméabilité intestinale. L’inhibition pharmacologique du protéasome par le PR-957 ou l’utilisation de souris invalidées pour une sous unité β2i du protéasome limite l’hyperperméabilité intestinale. Une supplémentation orale en glutamine permet également de diminuer la perméabilité intestinale. Une étude protéomique au niveau colique des souris WAS et une étude de l’ubiquitome colique de patients souffrant de SII à profil diarrhéique confirment l’implication du protéasome dans la physiopathologie du SII. Nous avons ensuite cherché à comprendre le lien entre l’obésité et le SII en combinant des modèles d’obésité (génétique et induite par une alimentation riche en graisses ou HFD) et le modèle WAS. Seules les souris HFD présentent une exacerbation de l’hyperperméabilité intestinale et une corticostéronémie plasmatique élevée en réponse au modèle WAS. Des études complémentaires suggèrent que ces résultats sont indépendants de la leptine, de la glycémie et du microbiote intestinal. Nos travaux proposent donc de nouvelles pistes de prise en charge des patients souffrant de SII, par intervention nutritionnelle via la glutamine ou en utilisant le protéasome comme cible thérapeutique. Nous suggérons également un rôle de l’alimentation (riche en graisse) dans le développement des TFI au cours de l’obésité. / Irritable bowel syndrome (IBS) is a multifactorial functional disorder, involving environmental factors (stress and diet for instance), gut-brain-axis dysfunction, micro-inflammation, dysbiosis and an alteration of intestinal permeability. The role of the proteasome in the regulation of the intestinal barrier during IBS has been studied. In addition, these intestinal functional disorders have also been described in patients with obesity. Nevertheless, the mechanisms underlying an association of intestinal functional disorders in the obesity context, remain poorly understood and have therefore been investigated in this thesis. In this study, "IBS-like" mouse models such as water avoidance stress (WAS) and the post-inflammatory (post-TNBS) models, were used to study the impact of proteasome inhibition on the regulation of intestinal permeability. We found that the pharmacological inhibition of the proteasome (with PR-957) or the use of knock-out mice for a subunit of the proteasome (β2i -/-) limit intestinal hyperpermeability occured in IBS-Like models. Moreover, we found that oral supplementation with glutamine also reduces intestinal hyperpermeability, wich, thus, can be considered as a putative nutritional treatment for IBS. A colonic proteomic study of WAS mice and a study of colonic ubiquitoma in IBS patients with diarrheal profiles confirmed the involvement of proteasome in the pathophysiology of IBS. Therefore, the link between obesity and IBS was examined by combining models of obesity (ob/ob genetic and high-fat diet [HFD] models) with WAS model. Only HFD mice displayed enhanced intestinal hyperpermeability and higher plasma corticosterone levels in response to WAS. Further studies suggest that these results, themselve, are independent of leptin, glycaemia and gut microbiota. This study paves new ways of treating patients suffering from IBS, by nutritional intervention via glutamine or by using the proteasome as a therapeutic target. We also suggest a role of diet (high fat) in the development of intestinal functional disorders during obesity.

Le virus de l’Herpès simplex de type 1 (HSV-1) est le pathogène humain responsable des lésions herpétiques labiales, plus communément appelé « feux sauvages ». Annuellement, il est responsable de plusieurs cas d’encéphalites et d’infections de l’appareil visuel qui sont la principale cause de cécité en Amérique du Nord. Bien qu’il existe quelques traitements antiviraux, aucun vaccin ou médicament ne permet de prévenir ou de guérir les infections causées par ce virus. Aujourd’hui, les infections produites par l’HSV-1 sont présentes partout sur la planète. Récemment, une étude en protéomique effectuée sur les virus matures extracellulaires a permis d’identifier la présence d’ubiquitines libres et d’enzymes reliées à la machinerie d’ubiquitination dans le virus. De plus, le virus exploite cette machinerie au cours de l’infection. Il est connu que certaines protéines virales sont ubiquitinées durant une infection et que le virus imite même certaines enzymes d’ubiquitination. Nous avons donc entrepris des recherches afin d’identifier des protéines virales ubiquitinées qui pourraient être présentes dans les virus matures ainsi que leurs rôles potentiels. La protéine majeure de la capside, VP5, un constituant très important du virus, a été identifiée. Nos recherches nous ont permis de caractériser le type d’ubiquitination, une monoubiquitination sur les lysines K810 et/ou K1275 de VP5. Le rôle que pourrait jouer l’ubiquitination de VP5 dans le cycle de réplication virale et dans les virus matures n’est toutefois pas encore connu. / Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is the human pathogen responsible for herpetic lesion such as cold sores. On a yearly basis, it is responsible for many cases of encephalitis and infections of the eye that are the most common cause of blindness in North America. Antiviral treatments exist, but no vaccines or drugs are able to prevent or cure the diseases caused by this virus. Today, infections caused by HSV-1 are present all around the world. Recently a proteomics approach was used to study mature extracellular viruses. This study highlighted the presence in the virus of free ubiquitin and ubiquitin related enzymes. Furthermore, the virus exploits this machinery during the course of infection. Also, it is known that certain virally encoded proteins are ubiquitinated and that the virus mimics some ubiquitin related enzymes. Our researches focused on identifying ubiquitinated viral proteins that could be present in mature extracellular viruses and their potential roles. The major capsid protein, VP5, an important virus component, was identified. We characterised the type of ubiquitination, a monoubiquitination of lysine K810 and/or K1275 of VP5. The role that could play the ubiquitination of VP5 in the viral cell cycle and in mature virions has yet to be identified.

Le VIH-1 a développé plusieurs mécanismes menant à la dégradation de son récepteur cellulaire, la molécule CD4, dans le but d’augmenter la relâche de particules virales infectieuses et d’éviter que la cellule soit surinfectée. L’un de ces mécanismes est la dégradation, induite par la protéine virale Vpu, du CD4 nouvellement synthétisé au niveau du réticulum endoplasmique (RE). Vpu doit lier CD4 et recruter l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP, via sa liaison à β-TrCP, afin de dégrader CD4. Puisque CD4 doit être retenu au RE pour permettre à Vpu d’induire sa dégradation via le système ubiquitine-protéasome, il a été suggéré que ce processus implique un mécanisme semblable à une voie cellulaire de dégradation des protéines mal-repliées appelée ERAD (« endoplasmic reticulum-associated degradation »). La dégradation par ERAD implique généralement la dislocation des protéines du RE vers le cytoplasme afin de permettre leur poly-ubiquitination et leur dégradation par le protéasome. Nous avons démontré que Vpu induit la poly-ubiquitination de CD4 dans des cellules humaines. Nos résultats suggèrent aussi que CD4 doit subir une dislocation afin d’être dégradé par le protéasome en présence de Vpu. De plus, un mutant transdominant négatif de l’ATPase p97, qui est impliquée dans la dislocation des substrats ERAD, inhibe complètement la dégradation de CD4 par Vpu. Enfin, nos résultats ont montré que l’ubiquitination sur des résidus accepteurs de l’ubiquitine (lysines) de la queue cytoplasmique de CD4 n’était pas essentielle, mais que la mutation des lysines ralentit le processus de dégradation de CD4. Ce résultat suggère que l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 pourrait représenter un événement important dans le processus de dégradation induit par Vpu. L’attachement de l’ubiquitine a généralement lieu sur les lysines de la protéine ciblée. Toutefois, l’ubiquitination sur des résidus non-lysine (sérine, thréonine et cystéine) a aussi été démontrée. Nous avons démontré que la mutation de tous les sites potentiels d’ubiquitination cytoplasmiques de CD4 (K, C, S et T) inhibe la dégradation par Vpu. De plus, la présence de cystéines dans la queue cytoplasmique apparaît suffisante pour rendre CD4 sensible à Vpu en absence de lysine, sérine et thréonine. Afin d’expliquer ces résultats, nous proposons un modèle dans lequel l’ubiquitination de la queue cytosolique de CD4 serait nécessaire à sa dégradation et où les sites d’ubiquitination de CD4 seraient sélectionnés de façon non spécifique par l’ubiquitine ligase recrutée par Vpu. Enfin, nous avons observé que la co-expression d’une protéine Vpu incapable de recruter β-TrCP (Vpu S52,56/D) semble stabiliser le CD4 qui est retenu au RE. De plus, d’autres mutants de Vpu qui semblent capables de recruter β-TrCP et CD4 sont toutefois incapables d’induire sa dégradation. Ces résultats suggèrent que l’association de Vpu à CD4 et β-TrCP est essentielle mais pas suffisante pour induire la dégradation de CD4. Par conséquent, ces résultats soulèvent la possibilité que Vpu puisse recruter d’autres facteurs cellulaires pour induire la dégradation de CD4. Les résultats présentés ont permis de mieux définir le mécanisme de dégradation de CD4 par Vpu dans des cellules humaines. De plus, ces résultats nous ont permis d’élaborer un modèle dans lequel l’ubiquitine ligase cellulaire SCFβ-TrCP démontre de la flexibilité dans le choix des résidus à ubiquitiner afin d’induire la dégradation de CD4. Enfin, ces études jettent un oeil nouveau sur le rôle de Vpu dans ce processus puisque nos résultats suggèrent que Vpu doive recruter d’autres partenaires cellulaires, mis à part β-TrCP, pour induire la dégradation de CD4. / HIV-1 has developed many mechanisms leading to the down-regulation of its cellular receptor, the CD4 molecule, in order to increase the release of infectious viral particles and to inhibit superinfection of the target cell. One of these mechanisms is the HIV-1 Vpu-mediated degradation of newly synthesized CD4 at the level of endoplasmic reticulum (ER). Vpu must interact with CD4 and recruit the cellular ubiquitin ligase SCFβ-TrCP, via its binding to β-TrCP, in order to induce CD4 degradation. Because CD4 has to be retained in the ER to allow Vpu to induce its degradation via the ubiquitin-proteasome system, it has been suggested that this process involves a mechanism reminiscent of a cellular degradation pathway involved in the proteolysis of unfolded proteins called ERAD (endoplasmic reticulum-associated degradation). The ERAD degradation usually involves the dislocation of proteins from the ER to the cytoplasm in order to induce their poly-ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome. We demonstrated that Vpu induces the poly-ubiquitination of CD4 in human cells. Our results also suggest that CD4 has to be dislocated in order to be degraded by the proteasome in presence of Vpu. Furthermore, the expression of a transdominant negative mutant of the ATPase p97, that is involved in the dislocation of ERAD substrates, inhibits completely the Vpu-mediated CD4 degradation process. Finally, our results demonstrated that the ubiquitination of putative ubiquitin acceptor residues (lysines) in the cytosolic tail of CD4 is not essential but the mutation of these lysines slowed down the process of CD4 degradation induced by Vpu. This results suggests that ubiquitination of CD4 cytosolic tail could represent an important step during Vpu-mediated CD4 degradation. Ubiquitin is usually attached on lysine residues in the targetted protein. However, the ubiquitination on non-lysine residues (S, T and C) has also been demonstrated. We demonstrated that the mutation of all cytosolic potential ubiquitination sites (K, C, S and T) of CD4 abolishes Vpu-mediated degradation. In addition, the presence of cysteines in the cytosolic tail of CD4 appeared sufficient to render CD4 sensitive to Vpu in absence of lysine, serine or threonine. In order to explain these results, we propose a model in which CD4 cytosolic tail ubiquitination is necessary for its degradation and where ubiquitination sites are selected non specifically by the ubiquitin ligase recruited by Vpu. Finally, we observed that co-expression of a phosphorylation mutant of Vpu unable to interact with β-TrCP (Vpu S52,56/D) appears to stabilize ER-retained CD4 molecules. In addition, other Vpu mutants seem able to recruit β-TrCP and CD4 without inducing CD4 degradation. These results suggest that Vpu association with CD4 and β-TrCP is essential but not sufficient for CD4 degradation. Consequently, these results raised the possibility that other cellular factors could be recruited by Vpu in order to induce CD4 degradation. The results presented here allowed us to better define the mechanism underlying Vpu-mediated CD4 degradation. In addition, these results allowed us to elaborate a model in which the ubiquitin ligase SCFβ-TrCP show some flexibility in the choice of ubiquitination sites in order to induce CD4 degradation. Finally, theses studies shed a new light on the role of Vpu in the CD4 degradation process because our results suggest that Vpu could recruit, in addition of β-TrCP, other cellular partners in order to induce CD4 degradation.

La polyarthrite rhumatoïde (PR) est une maladie auto-immune chronique. Elle est caractérisée par une inflammation persistante touchant de multiples petites articulations, causant douleurs, rougeurs, gonflements et déformations. Des études menées auprès de patients et d’animaux ont démontré que certains auto-anticorps, cytokines et enzymes tissue-déstructives sont des médiateurs importants dans le développement de la PR. Au cours des deux dernières décennies, les traitements de fond (DMARDs en anglais) ont été démontrés très efficaces pour traiter la PR. D'autre part, des effets secondaires ont été rapportés pour ces traitements, par exemple l'augmentation du risque d'infections opportunistes. L’objectif de ce travail est d’acquérir des connaissances sur le rôle du TL1A (TNF-like molécule 1 A; TNFSF15) et son partenaire Nob1 (Pno1 ; YOR145c) dans la pathogenèse de la PR afin de découvrir de nouveaux médicaments contre ces molécules dans l'avenir. TL1A est un membre de la famille du TNF. Il déclenche des signaux co-stimulateurs via le récepteur de mort 3 (DR3) et induit la prolifération ainsi que la production des cytokines pro inflammatoires par les lymphocytes. Des données multiples suggèrent l'implication de la cascade TL1A-DR3 dans plusieurs maladies auto-immunes. Donc, nous avons proposé les hypothèses suivantes:1) la production locale de TL1A dans les articulations est un composant d’un cercle vicieux qui aggrave la PR; 2) dans la PR, la production de TL1A dans les organes lymphoïde augmente la production d’auto-anticorps pathogénique. Au cours de ce travail, nous avons démontré que la TL1A aggrave la maladie chez les souris où l’arthrite a été induite par le collagène (AIC). Par ailleurs, nous avons constaté que l’expression de TL1A est élevée dans les tissus atteints de PR ainsi que dans les ganglions lymphatiques drainant de la souris AIC. Mécaniquement, nous avons découvert que la TL1A est induite par le TNF-α et IL-17 produits par les cellules T in vitro. Ces résultats montrent directement que les TL1A-DR3 jouent un rôle essentiel dans la pathogenèse de la PR. De plus, afin de poursuivre notre étude, la TL1A a été génétiquement supprimée dans les souris (TL1A KO). Nous avons montré que les souris TL1A KO n’ont aucune anomalie apparente et aucun dysfonctionnement du système immunitaire dans des conditions normales. Cependant, ces souris manifestent des AIC améliorées et une réduction significative des niveaux d'anticorps, anti-collagène du type II i dans le sérum. Nous avons trouvé que les ganglions lymphatiques de drainage (dLNs) de souris KO étaient plus petites avec une cellularité inférieure comparativement aux souris WT de 14 jours après l’immunisation. De plus, nous avons découvert que le DR3 a été exprimé par les cellules plasmatiques dans l’étape de la différenciation terminale et ces cellules surviennent mieux en présence de TL1A. La conclusion de cette étude apporte des nouvelles connaissances sur le rôle de TL1A qui amplifie les réponses humorales d’AIC. Nous avons suggéré que TL1A pourrait augmenter la réponse d’initiation d'anticorps contre collagène II (CII) ainsi que prolonger la survie des cellules plasmatiques. Une autre molécule qui nous intéresse est Pno1. Des études antérieures menées chez la levure ont suggéré que Pno1 est essentielle pour la néogénèse du protéasome et du ribosome Le protéasome étant crucial pour la différenciation terminale des cellules plasmatiques pendant les réponses humorales chez les mammifères, nous avons donc supposé que Pno1 joue un rôle dans la production d'anticorps pathogenique dans la PR via la voie du protéasome. Nous avons donc généré des souris génétiquement modifiées pour Pno1 afin d’étudier la fonction de Pno1 in vivo. Cependant, une mutation non-sens dans le Pno1 provoque une létalité embryonnaire à un stade très précoce chez les souris. D'autre part, une réduction de 50% de Pno1 ou une surexpression de Pno1 n’ont aucun effet ni sur le fonctionnent des cellules T et B, ni sur les activités du protéasome ainsi que sur la réponse humorale dans l’AIC. Ces résultats suggèrent que Pno1 est une molécule essentielle sans redondance. Par conséquent, il n’est pas une cible appropriée pour le développement de médicaments thérapeutiques. En conclusion, nos études ont révélé que la TL1A n’est pas essentielle pour maintenir les fonctions du système immunitaire dans des conditions normales. En revanche, il joue un rôle critique dans la pathogenèse de la PR en favorisant l'inflammation locale et la réponse humorale contre des auto-antigènes. Par conséquent, une inhibition de la TL1A pourrait être une stratégie thérapeutique pour le traitement de la PR. Au contraire, Pno1 est essentiel pour la fonction normale des cellules. Une délétion totale pourrait entraîner des conséquences graves. Il n’est pas une cible appropriée pour développer des médicaments de la PR. / Rheumatoid Arthritis (RA) is a chronic autoimmune disease characterized by persistent inflammation of multiple small joints, which manifests pain, redness, swelling, and deformation. Studies with patients and animal models have found that autoantibodies, cytokines and tissue-destructive enzymes are important mediators of the pathogenesis of RA. In the past two decades, biologic disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) have achieved great success in the treatment of RA. On the other hand, they are also associated with adverse effect like increasing the chance of opportunistic infections. The aim of present work was to investigate the roles of TNF-like molecule 1A (TL1A; TNFSF15) and partner of Nob1 (Pno1; YOR145c) in the pathogenesis of RA for developing novel drugs based on these molecules in the future. TL1A is a member of the TNF superfamily. It triggers costimulatory signals though death receptor 3 (DR3) and induces the proliferation and pro-inflammatory cytokine production in lymphocytes. Multiple lines of evidence suggest the implication of TL1A-DR3 signaling in several autoimmune diseases. Therefore, We hypothesized that 1) local TL1A production in the joints is a component of a vicious circle aggravating RA; 2) in RA, TL1A production in lymphoid organs enhances pathogenic autoantibody production. We demonstrated that the TL1A aggravates disease in murine collagen-induced arthritis (CIA). Moreover, we found elevated TL1A expression in RA-affected tissues, as well as in the draining lymph nodes (dLNs) of CIA mice. Mechanistically, we discovered that TL1A induces TNF-α and IL-17 production by T cells in vitro. These findings provided direct evidence that TL1A-DR3 signaling plays a critical role in the pathogenesis of RA. TL1A knockout (TL1A KO) mice were generated to further our study. We showed that TL1A KO mice have no visual anomaly, and no malfunction of immune system under a normal circumstance. However, they display ameliorated CIA and significantly reduced anti-Collagen II antibody levels in sera. We found that the draining lymph nodes (dLNs) from KO mice were smaller in size and lower in cellularity compared with their WT counterparts 14 days after immunization. Furthermore, we discovered that terminally differentiated plasma cells express DR3 and they survive better in the presence of TL1A. Our findings in this study present novel knowledge about the role of iii TL1A promoting the humoral responses in CIA; we suggest that TL1A could elevate the initial Ab response against Collagen II (CII), as well as prolong the survival of plasma cells producing such pathogenic Abs. Another molecule we were interested in present study is Pno1. Previous studies conducted in yeast suggest that Pno1 is essential to the proteasome and ribosome neogenesis. Since proteasome is crucial for the terminal differentiation of plasma cells during the humoral response in mammals, we hypothesized that Pno1 plays a role in the pathogenic Ab production in RA by affecting the proteasome assembly. For this purpose, we generated pno1 gene- modified mice to investigate the function of Pno1 in vivo. However, null-mutation in pno1 causes embryonic lethality in mice at a very early stage. On the other hand, a half amount reduction or overexpression of Pno1 is neither harmful nor useful to the T and B cell function, proteasome activities as well as humoral immune responses in CIA. These findings suggest that Pno1 is a vital molecule with no redundancy and is absolutely required for cell function, but animals can function normally with a small fraction of the normal Pno1 expression level. Thus, it might not be an appropriate target for developing therapeutic drugs. In conclusion, our studies suggest that TL1A seems not essential in maintaining the immune functions under normal circumstances, but plays critical roles in the pathogenesis of RA by promoting local inflammation and humoral immune responses against autoantigens. Therefore, inhibiting TL1A could be a propitious therapeutic strategy for treating RA. In contrast, Pno1 is vital to the normal cell function, and its disruption could cause disastrous consequences. Thus, it might not be a good drug target for treating RA.

Le myélome multiple (MM) est une hémopathie dont la croissance et la prolifération sont liés à une variété de facteurs de croissance, y compris « insulin-like growth factor type 1 » (IGF-1). Bortézomib est le premier inhibiteur protéasome ayant une activité anti-tumorale significative dans le myélome multiple. Nous avons analysé l'impact de l'IGF-1 recombinant associé à l'inhibiteur du protéasome bortezomib sur des lignées humaines de MM, in vivo et sur des cellules de myélome frais humaines ex vivo. Nous avons montré que l'IGF-1 améliore l'activité cytotoxique du bortezomib in vitro, in vivo et ex vivo. Nous avons montré que l'accroissement de la toxicité peut être inhibé par la présence d'un anticorps monoclonal dirigé contre le récepteur de l'IGF-1 (IGF1-R). IGF-1 renforce l'activité cytotoxique des autres inhibiteurs de protéasome, y compris MG115, MG132, PSI et epoxomicin. Nos résultats confirment le fait que l'IGF-1sensibilise des cellules de myélome à l'activité cytotoxique des inhibiteurs du protéasome tels que le bortezomib, en raison du niveau accru du stress de réticulum endoplasmique et l'induction de la une réponse protéine dépliée (UPR) / Multiple Myeloma (MM) is a clonal plasma cell disorder whose growth and proliferation are linked to a variety of growth factors, including insulin-like growth factor type 1 (IGF-1). Bortezomib, the first-in-class proteasome inhibitor, has displayed significant antitumor activity in multiple myeloma. We analyzed the impact of recombinant IGF-1 combined with the proteasome inhibitor bortezomib in MM cell lines, in vivo and on fresh human myeloma cells ex vivo. We found that IGF-1 enhanced the cytotoxic activity of bortezomib in vitro, in vivo and ex vivo. We showed that the enhanced toxicity could be inhibited by the presence of a monoclonal antibody directed against the IGF-1 receptor (IGF1-R). IGF-1 enhances the cytotoxic activity of other proteasome inhibitors, including MG115, MG132, PSI and epoxomicin. Our results support the fact that IGF-1sensitize myeloma cells to the cytotoxic activity of proteasome inhibitors such as bortezomib, as a consequence of enhanced level of endoplasmic reticulum stress and the induction of an unfolded protein response (UPR)

Le protéasome 26S est une macromolécule impliquée dans la dégradation de la majorité des protéines cellulaires. Parmi ces protéines, il y a les différents régulateurs de processus cruciaux tels que les protéines responsables de la progression du cycle cellulaire, de l’apoptose, des réponses inflammatoires, de l’activation de NF-B, de la présentation antigénique et de la différenciation cellulaire. Par conséquent, les inhibiteurs du protéasome sont des agents thérapeutiques dans des pathologies tels que le cancer, l’inflammation et les maladies auto-immunes. En effet, les inhibiteurs du protéasome sont connus pour induire la mort sélective des cellules cancéreuses tout en les rendant plus sensibles aux autres traitements anticancéreux existants (chimiothérapie, radiothérapie…). L’objectif de notre laboratoire est de développer des inhibiteurs non covalents du protéasome de structures peptidomimétiques fluorés ou non fluorés, et de montrer l’intérêt du fluor en chimie médicinale. Mon projet de thèse s’inscrit dans ce cadre. Dans un premier temps nous avons mis en évidence la grande diversité et la quantité des inhibiteurs du protéasome montrant ainsi l’importance de cette macromolécule comme cible dans le traitement du cancer. D’ailleurs, deux de ces inhibiteurs sont utilisés dans le traitement du myélome multiple et du lymphome du manteau et, plusieurs composés sont en études cliniques pour différents cancers. Nous avons aussi mis en évidence le bénéfice apporté par l’incorporation de groupement fluoré sur une molécule bioactive en particulier dans les structures peptidomimétiques. En revanche, ce rappel bibliographique a aussi montré que les peptidomimétiques contraints et fluorés sont peu décrits dans la littérature et le seul exemple à notre connaissance est l’analogue contraint et fluoré de la substance P contenant le motif (Z)-fluoroalcène.La deuxième partie de ces travaux de thèse s’est focalisée sur la conception, la synthèse et l’évaluation biologique d’inhibiteurs originaux du protéasome. Nous avons mis au point une synthèse facile et efficace de pseudopeptides possédant les motifs α et β-hydrazino acides et le motif β-hydrazino acide trifluorométhyle (schéma 1). Ces molécules inhibent de manière efficace le site CT-L du protéasome du lapin avec une IC50 de l’ordre du submicromolaire. Nous avons ainsi démontré que l’activité biologique est maintenue en remplaçant un α-amino acide par un scaffold α ou β-hydrazino acide. La pharmacomodulation effectuée autour de ces motifs nous a permis d’établir des relations structure-activité. Nous avons aussi mis au point un modèle de docking assez fiable qui va nous permettre de prédire le potentiel inhibiteur de nos futures molécules.Enfin, nous avons déterminé l’IC50 de nos molécules en utilisant la technique du FABS en RMN du 19F. Schéma1: voies d’accès aux peptidomimétiques contenant les motifs α et β-hydrazino acide et le motif β-hydrazino acide trifluorométhyl.Ces travaux de thèses ont été complétés par une méthodologie de synthèse portant sur le développement de nouveaux synthons contraints fluorés dans le but de les incorporer dans nos inhibiteurs de protéasome. Les cyclopropanes trifluorométhyles ont été obtenus en utilisant la réaction tandem de Michael, addition nucléophile suivie de cyclisation avec une excellente diastéréosélectivité pour certaines réactions. Les cyclopropanes obtenus ont été fonctionnalisés en amino acides ce qui faciliterait leur incorporation dans nos pseudopeptides. Les N-aminoaziridines fluorés ont été synthétisés à partir d’oléfines fluorés et de précurseurs de nitrène en présence de diacétate d’iodobenzène (PhI(OAc)2. L’incorporation de ces nouveaux scaffolds dans la structure de nos inhibiteurs de protéasome est en cours de réalisation dans le laboratoire. / The proteasome is a multicatalytic protease complex that is responsible for the ubiquitin-dependent turnover of cellular proteins. Proteasome substrates include misfolded or misassembled proteins as well as short-lived components of signaling cascades that regulate cell proliferation and survival pathways. Inhibition of the proteasome leads to an accumulation of substrate proteins and results in cell death. The proteasome consists of a 20S proteolytic core and two 19S regulatory caps that assemble with the core at either end to form a 26S complex. Clinical validation of the proteasome as a therapeutic target in oncology has been provided by bortezomib, a dipeptide boronic acid, which is approved for the treatment of patients with multiple myeloma1and mantle cell lymphoma. In the first part of my PhD, I designed (by the help of molecular modeling) and synthesized an original series of proteasome inhibitors introducing fluorinated peptidomimetics. Fluorine atom is able to favour hydrogen bond and to increase hydrophobicity and metabolic stability of the molecules. I also synthesized a series of non fluorinated peptidomimetics containing hydrazino acid moieties as proteasome inhibitors. Thereby, we designed and synthesized a library of 50 molecules that allowed us to establish a structure-activity relationship. The biological evaluation showed that half of these compounds have a micromolar IC50 (inhibitor concentration giving 50% inhibition). Then we decided to test the inhibitor activity of our synthesized molecules by 19F NMR using the FABS technique. So we developed a fluorine substrate for screening and determination of IC50 of our potential protéasome inhibitors. In order to increase the activity of our molecules and according to encouraging observation by molecular modelling, we decided to introduce constrained scaffolds such as trifluoromethyl cyclopropane or trifluoromethyl N-aminoaziridine scaffolds in our peptidomimetics structures. So we needed trifluoromethyl cyclopropane and trifluoromethyl N-aminoaziridine amino acids that could be easily incorporate in peptidic structure. To our knowledge there is no precedent on the synthesis of fluorinated N-aminoaziridines or trifluoromethyl cyclopropane β-amino acids which allowed us to develop a new synthesis methodology of these scaffolds. First, I synthesized different trifluoromethyl N-Aminoaziridine with several protective groups. The reaction of N-Aminoaziridine was performed in DCM with K2CO3 as base and (Diacetoxyiodo)benzene. For the synthesis of trifluomethyl cyclopropane β-amino acid, we used the cyclopropanation of Michael acceptors (tandem Michael Additions-Nucleophilic Cyclization (MA-NC)). Encouraged by this result and in order to develop different scaffolds trifluoromethyl cyclopropanes, we screened other nucleophiles. These scaffolds have been functionalized to amino acid in order to introduce it in peptidic structure.

Le maintien de la masse musculaire est étroitement lié à la balance entre la synthèse et la dégradation des protéines. L'exercice physique est un puissant régulateur de la balance protéique et plus particulièrement l'exercice en résistance. S'intéresser à la balance protéique après un exercice s'inscrit dans une compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires conduisant aux phénomènes d'hypertrophie et/ou d'atrophie musculaire. Nos travaux mettent en évidence que l'hypertrophie obtenue dans le muscle FDP après 10 semaines d'un entraînement en résistance chez le rat, est en lien avec l'activation chronique de la voie IL-6/STAT3 après chaque exercice aigu, en partie au sein du pool de cellules satellites activées. En phase proliférative, les cellules dont la voie de signalisation STAT1/STAT3 est activée, répriment l'expression des facteurs myogéniques comme MyoD et retournent ainsi à l'état quiescent, concourant à augmenter le pool de réserve. Ces mécanismes participent à la synthèse protéique par l'apport de nouveau matériel génétique au sein des fibres musculaires conduisant à une augmentation de leur surface de section ainsi qu'à leur conversion phénotypique avec l'entraînement. L'exercice en résistance favorisant la protéolyse, nos travaux ont cherché à caractériser les systèmes protéolytiques (autophagique-lysosomal, ubiquitine-protéasome) impliqués dans la balance protéique post-exercice. Les marqueurs moléculaires étudiés (activités enzymatiques du protéasome et de la cathepsine L, expression protéique et génique de LC3B, des E3 ligases…) ne permettent pas d'expliquer clairement les +30% de protéolyse obtenus une heure après des contractions excentriques sur muscle EDL isolé de rat en condition à jeun. Des perspectives d'étude des systèmes des calpaines, des caspases et/ou des métalloprotéases matricielles sont alors à envisager. / The maintain of muscle mass is closely controlled by protein synthesis and degradation balance. Physical activity and mainly resistance exercise is a powerful stimulus to positive muscle protein balance. To understand how protein balance is regulated after exercise, cellular and molecular mechanisms leading to muscular hypertrophy and/or atrophy have to be elucidated. Our works point out that FDP muscular hypertrophy after 10 weeks of resistance training in rat is partly due to the chronically activation of IL-6/STAT3 signaling pathway, occurring in the activated satellite cell pool, after each single exercise bout. Once activated and engaged in the myogenic program, cells in which STAT1/STAT3 signaling pathway is activated, could downregulate MyoD and return to a quiescent state, leading to increase satellite cell reserve's pool. These events participate to enhance protein synthesis by the incorporation of new genetic material into muscle fiber leading to increase their cross sectional area and phenotypic shift after training. As resistance exercise increases proteolysis, our works attempt to characterize the proteolysis systems (lysosomal-autophagic, ubiquitin-proteasome) involved in protein balance after exercise. The molecular markers measured ( chymotrypsin-like and cathepsin L activities, protein and gene expressions of LC3B, E3 ligases…) could not explain the +30% of proteolysis obtained one hour after resistance eccentric contractions on EDL muscle of starved rats. Further studies based on calpains, caspases and metalloproteinase activities and/or expressions should bring us valuable information.

Le protéasome est une protéase multimérique essentielle et hautement conservée au cours de l’évolution. Le protéasome 26S eucaryote est l’unité catalytique du système Ubiquitine-Protéasome et contrôle de ce fait de nombreux processus cellulaires. Son dysfonctionnement participe à la pathogenèse de nombreuses maladies. Le protéasome émerge notamment comme une cible thérapeutique de choix dans le traitement de cancers. Il semble donc important d’identifier l’ensemble des processus cellulaires dans lesquels le protéasome est impliqué ainsi que l’ensemble de ses régulateurs.Mon travail de thèse a consisté à identifier et caractériser de nouveaux partenaires physiques et fonctionnels du protéasome par une approche multi-technique. Nous étudions ces facteurs dans l’organisme modèle S. cerevisiae et déterminons s’ils sont fonctionnellement conservés dans les cellules de Mammifères.Après avoir identifié des partenaires physiques et fonctionnels au moyen de cribles à grande échelle, j’ai analysé les données et établi une bibliothèque pondérée de ces partenaires. J’ai ainsi mis en évidence de nouveaux acteurs potentiellement impliqués dans le fonctionnement du protéasome. De plus, j’ai caractérisé les protéines Spg5p et Poc5p. Mes données suggèrent que Spg5p participe à la régulation du protéasome en quiescence. Poc5p, présente à la fois chez l’Homme et la levure, participe à la régulation du protéasome à au moins deux niveaux différents : elle joue un rôle de point de contrôle dans l’assemblage du complexe et un rôle inhibiteur sur son activité. / The proteasome is a highly conserved essential proteolytic machine. The eukaryotic 26S proteasome is the hydrolytic heart of the ubiquitin-mediated degradation pathway and therefore controls many cellular pathways. Its dysfunction is involved in the pathogenesis of numerous diseases. Notably, the proteasome has emerged as an interesting drug target for anti-cancer therapy. It seems therefore important to identify all cellular processes in which the proteasome is involved and all of its regulators.My work was to identify and characterize new physical and functional partners of the proteasome by a multi-technical approach. We characterize these factors in the model organism S. cerevisiae and determine if they are functionally conserved in mammalian cells.After identifying physical and functional partners through large-scale screens, I analyzed the data and developed a weighted library of these partners. I have thus highlighted new actors potentially involved in the proteasome functioning. In addition, I characterized the Spg5p and Poc5p proteins. My data suggest that Spg5p participates in the regulation of proteasome during quiescence. Poc5p, presents both in human and yeast, is involved in the regulation of proteasome at at least two different levels: it acts as a checkpoint in the complex assembly and have an inhibitory effect on its activity.

Les lymphomes non hodgkiniens (LNH) regroupent un panel hétérogène de pathologies originaires de cellules lymphatiques. Parmi les LNH à cellules B matures, la leucémie lymphoïde chronique (LLC) constitue la forme de leucémie de l’adulte la plus fréquente en Occident. La physiopathologie des LNH à cellules B matures est marquée par l’inhibition des mécanismes de la mort cellulaire, notamment via la surexpression de la protéine MCL-1. Une première partie de ce travail de thèse a été de déterminer quelles pouvaient être les enzymes de déubiquitination (DUBs) impliquées dans la survie des LNH à cellules B matures et la stabilisation de MCL-1. Notre étude a permis d’identifier la DUB USP14, qui est liée au système ubiquitine-protéasome, comme capable de réguler MCL-1 et la survie cellulaire. Nos travaux montrent également pour la première fois que l’activité DUB des cellules, ainsi que l’activité d’USP14, sont directement régulées par la signalisation du BCR via l'activité de la tyrosine kinase SYK. Le FTY720, un analogue de la sphingosine utilisé comme immunosuppresseur dans la sclérose en plaques, a montré un effet cytotoxique dans des hémopathies malignes sans toutefois que son mécanisme d’action soit clairement expliqué. Une deuxième partie de ce travail de thèse a été de caractériser la mort induite par le FTY720. Notre étude montre que la caractérisation de la morphologie cellulaire et des marqueurs induits par la mort due au FTY720 dans les LLC correspond en fait à une nécrose cellulaire programmée indépendante de RIPK1, mais dépendante d'une enzyme régulatrice de la fission mitochondriale, DRP1. / Non-Hodgkin lymphoma (NHL) include a diverse range of pathologies originate from the lymphatic cells. Among the mature B-cell NHL, chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common adult leukemia in the western countries. The pathophysiology of mature B-cell NHL is marked by the inhibition of cell death mechanisms, particularly through the overexpression of MCL-1 protein. The first part of this thesis was to determine which deubiquitinating enzymes (DUBs) are involved in the survival of mature B-cell NHL and in the stabilization of MCL-1. Our study identified the DUB USP14, which is linked to the ubiquitin-proteasome system, as able to regulate MCL-1 and cell survival. Our work also shows for the first time that the DUB activity of the cells and the activity of USP14 are directly regulated by BCR signaling through the activity of the SYK tyrosine kinase. FTY720, a sphingosine analog used as an immunosuppressive drug in multiple sclerosis, showed a cytotoxic effect in hematological malignancies but its mechanism of action is not well understood. A second part of this thesis was to characterize the death induced by FTY720. Our study shows that the characterization of the cellular morphology and markers induced by death due to FTY720 in the LLC corresponds in fact to a programmed RIPK1-independent necrosis cell death, but dependent on DRP1, a regulatory enzyme of the mitochondrial fission.

Avant le début de ma thèse, le laboratoire avait découvert et caractérisé HDAC6, une Histone Déacétylase atypique qui possède deux domaines déacétylases et peut interagir directement avec l'ubiquitine, grâce à son domaine ZnF-UBP. De plus, le laboratoire avait montré que HDAC6 interagit avec UFD3/PLAP, un régulateur du recyclage de l'ubiquitine, et p97/VCP, un orthologue murin de la chaperonne de levure Cdc48p. Cependant, aucune fonction biologique dans la voie d'ubiquitination des protéines n'était connue pour HDAC6. Nous avons tout d'abord observé que la surexpression de HDAC6 ralenti la dégradation des protéines poly-ubiquitinées, via son ZnF-UBP, son domaine de liaison à l'ubiquitine. Grâce à une série d'expériences, nous avons pu montrer que les complexes HDAC6-p97/VCP régulent directement la stabilité des protéines poly-ubiquitinées. L'accumulation intracellulaire de protéines poly-ubiquitinées peut être toxique pour les cellules si aucune réponse cellulaire n'est engagée. En réalité, une telle accumulation active le facteur de transcription Heat Shock Factor 1 (HSF1) afin de promouvoir la survie de la cellule. Grâce à ces considérations, nous avons découvert que HDAC6 contrôle la réponse cellulaire à l'accumulation de protéines poly-ubiquitinées et avons disséqué les mécanismes impliqués dans ce contrôle. Nous avons trouvé qu'en l'absence de stress, HDAC6 et HSF1 sont en complexes avec p97/VCP et HSP90. Cependant, lorsque la concentration intracellulaire en protéines poly-ubiquitinées augmente, comme lors d'une inhibition du protéasome, HDAC6 est re-larguée du complexe de manière ubiquitine et ZnF-UBP dépendante. Un tel re-largage permet ensuite à p97/VCP d'activer HSF1 et d'engager la cellule dans la réponse au stress.