ERK3 est une protéine de la famille des MAP kinase (MAPK) classifiée comme atypique car elle présente des différences notables comparées aux propriétés redondantes des MAPK dites classiques. ERK3 est notamment une protéine très instable dégradée constitutivement par le système ubiquitine protéasome. Par conséquence, son activité biologique est principalement contrôlée par la régulation de sa dégradation. Pourtant, les facteurs impliqués dans la régulation de la stabilité de ERK3 restent mal compris. Ce travail de thèse vise ainsi à affiner notre compréhension des mécanismes de régulation de la stabilité de ERK3. De manière intéressante, nous avons montré dans une première étude qu’un pH acide stabilise fortement ERK3 alors qu’à l’inverse, un pH basique induit sa rapide dégradation par le protéasome. De plus, la déplétion génétique de NBCn1, un transporteur de bicarbonate impliqué dans la régulation du pH intracellulaire, augmente également la stabilité de ERK3. Ainsi, des variations de pH intracellulaire régulent finement la dégradation de ERK3. Nous avons également montré dans une deuxième étude l’importance de ERK3 dans la progression tumorale dans le cancer du sein. La surexpression de ERK3 au niveau transcriptionnel ou protéique est associée à un mauvais pronostic dans le cancer du sein, que ce soit au niveau de la survie globale ou de la survie sans métastase. Ainsi, la déplétion de ERK3 entraîne une diminution drastique du nombre de métastases au foie et aux poumons. ERK3 est également impliquée dans la migration cellulaire in vitro. Nous avons montré pour la première fois que la stabilité d’une kinase peut être modulée par le pH. Or, le pH est impliqué dans de nombreux processus biologiques comme, entre autres, la prolifération cellulaire, la migration, l’invasion et la mort cellulaire. Les résultats obtenus pendant ce doctorat ouvrent donc de nouveaux champs d’exploration pour étudier l’activité biologique de ERK3 dans des contextes dépendants du pH. / ERK3 is an atypical member of the MAP kinase (MAPK) family because its regulation differs from the canonical module of classical MAPK. ERK3 is also an unstable protein constitutively degraded by the ubiquitin proteasome system (UPS). Therefore, ERK3 stability regulation is an essential element in the control of its biological activity. However, the components implied in the regulation of its stability by the UPS are mainly unknown. This thesis aims to understand the regulation mechanisms controlling ERK3 degradation to better explore its biological function. In a first study, we showed that an acidic extracellular pH strongly stabilizes ERK3. At the opposite, a basic pH triggers its rapid degradation by the proteasome. Moreover, genetic depletion of NBCn1, a bicarbonate transporter involved in the regulation of the intracellular pH (pHi), also impacts ERK3 stability. We demonstrated that pHi variation finely regulates ERK3 degradation. We also explored the role of ERK3 in breast cancer progression in a second study. In breast cancer, high ERK3 expression correlates with a poor overall survival as well as a higher risk to develop metastases. ERK3 depletion triggers a severe decrease in the number of liver and lungs metastasis in a in vivo metastasis model. We also demonstrated that ERK3 is involved in cell migration in vitro. We showed for the first time that a kinase stability is modulated by pH variation. pH homeostasis is finely regulated in cells to assure important cellular functions such as proliferation, invasion, and survival. Therefore, ERK3 protein levels regulation by the pH raises new potential functions to explore for this kinase in a context pH dependent.

La protéine tyrosine kinase c-Src est surexprimée et activée dans de nombreux cancers. De manière remarquable, Src est activé dans plus de 80% des adénocarcinomes coliques où il joue un rôle dans la carcinogenèse et la progression vers un phénotype métastatique. c-Src et son homologue viral v-Src activent un grand nombre de voies cellulaires permettant à la tumeur de proliférer, de résister à la mort cellulaire et d’acquérir des capacités accrues de migration et d’angiogenèse. Au cours de ma thèse nous avons mis en évidence un mécanisme inattendu d’échappement à l’apoptose de fibroblastes murins surexprimant de manière stable v-Src et de plusieurs lignées tumorales humaines (coliques en particulier) présentant une activité c-Src dérégulée. Nous avons montré que Src stimule la dégradation protéasomedépendantede la protéine Bik, un membre pro-apoptotique de la famille Bcl-2, connu pour être un suppresseur de tumeurs. Cette régulation post-traductionnelle du niveau d’expression de Bik est à l’origine d’une forte résistance de la voie mitochondriale de l’apoptose. L’inhibition de l’activité kinase de Src ou le blocage de la dégradation de Bik par le protéasome permettent de restaurer des concentrations normales de la protéine Bik dans les cellules transformées et de les restaurer efficacement l’apoptose. En revanche, l’inhibition des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 par l’ABT-737 semble moins efficace. Par ailleurs, nous avons également contribué à mettre en évidence le rôle anti-migratoire et anti-invasif du lithium sur des cellules transformées par Src. Le mécanisme moléculaire mis en jeu implique l’activation redox des protéines tyrosine phosphatases cellulaires. Enfin, nous avons participé à l’étude de peptides mimant les hélices centrales d’insertion de Bax, Bcl-xL et Bid, représentant les trois sous-groupes de protéines de la famille Bcl-2. Nous avons comparé leur comportement vis-à-vis d’une monocouche lipidique mimant la membrane mitochondriale externe ainsi que leur capacité à perméabiliser des mitochondries isolées. Nos résultats nous ont permis de proposer que les fragments centraux d’insertion membranaire des protéines Bcl-2 seraient directement impliqués dans la divergence fonctionnelle des différents sous groupes qui composent la famille / C-Src tyrosine kinase is overexpressed and activated in a number of cancers. Remarkably, Src is deregulated in more than 80% of colorectal adenocarcinoma, playing a role in carcinogenesis and progression toward a metastatic phenotype. c-Src and v-Src activate a large number of intracellular pathways which allow the tumor to proliferate, to evade the cell death machinery and to acquired enhanced migratory and angiogenic abilities. During my PhD, we discovered an unknown mechanism to evade apoptosis developed by murine fibroblasts stably overexpressing v-Src and by some human tumor cell lines with c-Srcb deregulation. We have shown that Src stimulate the proteasomal degradation of the Bik protein, a proapoptotic member of the Bcl-2 family proteins known to act as a tumor suppressor. This post-translationnal regulation of the Bik protein expression level leads to a strong resistance of the mitochondrial pathway of apoptosis. Inhibition of the Src kinase activity or of the Bik proteasome-dependent degradation restore normal levels of the Bik protein and efficiently resensitize these cells to apoptosis. Inhibition of the antiapoptotic Bcl-2 proteins by ABT737 seems to be less efficient in these cells. We also contribute to show that lithium suppresses motility and invasivity of v-Src transformed cells. The molecular mechanism involve a redox activation of the protein tyrosine phosphatases. Finally, we compared the membrane behavior and the ability to permeabilize mitochondria of synthetic peptides derived from the central helical hairpin of Bax,Bcl-xL and Bid. We showed that these structurally analogous domains have distinct membrane behavior which could account for the functional divergence between the Bcl-2 family members

Le co-transporteur Na+-K+-2Cl- spécifique du rein et sensible au bumétanide, NKCC2, joue un rôle essentiel dans l’homéostasie hydro-électrolytique et acido-basique de l’organisme. Les mutations inactivatrices de NKCC2 induisent le syndrome de Bartter anténatal de type 1, une grave maladie rénale caractérisée par une hypotension artérielle associée à des anomalies électrolytiques. À l’opposé, une activité accrue de NKCC2 est associée à une hypertension artérielle sensible au sel. Pourtant, peu est connu sur la régulation moléculaire de NKCC2. Le but de ces travaux de thèse a donc été l’identification des déterminants moléculaires impliqués dans la régulation de l’expression et du trafic intracellulaire de NKCC2, plus spécifiquement dans le contrôle de qualité de ce co-transporteur. Suite au criblage par la technique de double hybride chez la levure d’une banque d’ADNc de rein humain, nous avons identifié OS-9 en tant que partenaire de NKCC2. La léctine OS-9 est un facteur clé de régulation du contrôle de qualité des protéines au niveau du RE. Les analyses de co-immunoprécipitation dans les cellules rénales ont montré qu’OS-9 interagit principalement avec la forme immature de NKCC2. De plus, les expériences d’immunofluorescence ont révélé que cette interaction aurait lieu au niveau du RE. La surexpression d’OS-9 diminue l’abondance totale de NKCC2. Cet effet est aboli suite à l’inhibition de la voie de dégradation protéique par le protéasome par le MG132. De plus, les expériences pulse-chase et cycloheximide-chase ont montré que cette diminution est secondaire à l’augmentation de la dégradation de la forme immature de NKCC2. A l’inverse, le knock-down d’OS-9 endogène augmente l’expression du co-transporteur en augmentant la stabilité de sa forme immature. Enfin, la mutation du domaine MRH (Mannose 6-phosphate Receptor Homology) d’OS-9 n’altère pas son effet sur NKCC2, alors que la mutation des deux sites de N-glycosylation de NKCC2 abolie l’effet d’OS-9. L’ensemble de nos résultats démontre l’implication de la lectine OS-9 dans le système ERAD de NKCC2. Le deuxième volet de ce travail a porté sur l’identification de nouveaux mécanismes Moléculaires impliqués dans le Syndrome de Bartter. Nous avons découvert des mutations dans le gène MAGE-D2, situé sur la chromosome X, responsables d’une nouvelle et très sévère forme du syndrome de Bartter anténatal, caractérisé par un polyhydramnios très précoce avec un risque élevé d’accouchement prématuré et de mortalité. Nous avons montré que les anomalies de MAGE-D2 entraînent un défaut de maturation et d’expression membranaire de NKCC2 ainsi que celle du co-transporteur Na-Cl, NCC, du tubule distal. La comparaison in vitro de l’interactome de MAGED2 sauvage et mutée a révélé que la protéine MAGE-D2 sauvage interagit spécifiquement avec DNAJB1 (HSP40) et/ou GNAS, suggérant l’implication de ces deux partenaires protéiques dans la régulation de NKCC2 et NCC par MAGE-D2 pendant la grossesse. Le troisième volet de ce travail a porté sur l’étude de l’effet de DNAJB1/HSP40, partenaire de MAGE-D2, sur l’expression de NKCC2. HSP40 a été identifiée aussi comme partenaire de NKCC2 par la technique de double hybride réalisée par notre équipe. Nous avons montré que HSP40 et son co-chaperon HSPA1A (HSP70) interagissent avec la forme immature de NKCC2 au niveau du RE. La co-expression de HSP40 et HSP70 augmente l’expression de NKCC2 en augmentant sa stabilité et sa maturation. De plus, ces deux co-chaperons régulent l’expression de NCC de la même manière. Ces observations suggèrent que MAGE-D2 coopère avec DNAJB1/HSP40 et HSPA1A/HSP70 pour protéger NKCC2 et NCC contre la rétention et la dégradation de NKCC2 au niveau du RE durant la grossesse, révélant ainsi une nouvelle voie de régulation du trafic intracellulaire de NKCC2 et NCC. (...) / The kidney-specific Na + -K + -2C1 co-transporter, sensitive to bumetanide, NKCC2, plays an essential role in the body's fluid, electrolyte and acid-base homeostasis. Mutations of NKCC2 cause antenatal type 1 Bartter syndrome, a life-threatening kidney disease characterized by arterial hypotension associated with electrolyte abnormalities. In contrast, an increase in NKCC2 activity is associated with salt-sensitive hypertension. Yet the mechanisms underlying the regulation of NKCC2 trafficking in renal cells are scarcely known. The aim of this work was to identify the protein partners involved in the regulation of the expression and the intracellular trafficking of NKCC2, specifically in the quality control of this co-transporter. Using the yeast tow-hybrid system, we identified OS-9 as a specific binding partner of NKCC2. Lectin OS-9 is a key factor in the regulation of protein quality control at ER. Co-immunoprecipitation assay in renal cells showed that OS-9 interacts mainly with NKCC2 immature forms. Accordingly, immunocytochemistry analysis showed co-localization of the proteins mainly in the ER. Overexpression of OS-9 decreased the total abundance of NKCC2. This effect is abolished following the inhibition of the proteasome protein degradation pathway by MG132. In addition, the pulse-chase and cycloheximide-chase assays demonstrated that the marked reduction in the co-transporter protein levels was essentially due to increased protein degradation of NKCC2 immature forms. Conversely, knock-down endogenous of OS-9 increased the expression of the co-transporter by increasing the stability of its immature form. Finally, inactivation of the Mannose 6-phosphate Receptor Homology domain had no effect on its action on NKCC2, while mutation of the two NKCC2 N-glycosylation sites abolished the effect of OS- 9. In summary, our results demonstrate the involvement of lectin OS-9 in the ERAD of NKCC2. The second part of this work focused on the identification of new molecular mechanisms involved in Bartter Syndrome. We found that MAGE-D2 mutations caused X-linked new and severe form of antenatal Bartter's syndrome, characterized by a very early polyhydramnios with a high risk of premature delivery and mortality. We have shown that MAGE-D2 abnormalities lead to a lack of maturation and membrane expression of NKCC2 as well as that of the Na-Cl co-transporter, NCC, of the distal tubule. In vitro comparison of the wild-type and mutated MAGED2 interactome revealed that wild-type MAGE-D2 interacts specifically with DNAJB1 (HSP40) and / or GNAS, suggesting involvement of these two protein partners in NKCC2 and NCC regulation by MAGE-D2 during pregnancy. The third part of this work focused on the study of the effect of DNAJB1 / HSP40, partner of MAGE-D2, on the expression of NKCC2. HSP40 was also identified as a specific binding partner of NKCC2 by the yeast two-hybrid system realized by our team. We have shown that HSP40 and its co-chaperone HSPA1A (HSP70) interact with the immature form of NKCC2 at the ER. The co-expression of HSP40 and HSP70 increased the expression of NKCC2 by increasing its stability and maturation. In addition, these two co-chaperones regulate the expression of NCC in the same way. These findings suggest that MAGE-D2 cooperates with DNAJB1 / HSP40 and HSPA1A / HSP70 to protect NKCC2 and NCC against retention and degradation of NKCC2 at ER during pregnancy, revealing a new pathway for regulating NKCC2 and NCC intracellular trafficking. A better understanding of NKCC2 and NCC regulatory pathways would help to better understand the pathophysiology of sodium retention and ultimately would provide a new target for a pharmaceutical approach to preventing and / or treating kidney disease related to sodium balance.

Les fichiers accompagnant le document sont en format Microsoft Excel 2010. / Les modèles classiques de signalisation cellulaire eucaryotes sont généralement organisés en voies linéaires et hiérarchiques, impliquant un ensemble de facteurs restreint. Ces facteurs forment un circuit isolé qui transmet une information externe vers sa destination, d’où une réponse cellulaire sera alors engendrée. Or, ces modèles sont justement le fruit d’approches expérimentales réductionnistes qui ne permettent pas d’intégrer aisément la contribution de facteurs multiples, ni de faire une évaluation quantitative de l’apport des composantes du système. Le développement de techniques d’investigation plus holistiques, telles la génomique fonctionnelle et la protéomique, permettent d’examiner de manière systématique et quantitative l’apport d’ensembles larges de facteurs et de les mettre en relation avec d’autres systèmes cellulaires. Il y aurait donc lieu de réévaluer le modèle de voie de signalisation linéaire au profit d’un modèle de réseau de signalisation multiparamétrique, comportant plusieurs branches d’entrée et sortie de signal interagissant avec d’autres systèmes cellulaires. Cet ouvrage porte sur la voie RAS/MAPK, l’un des principaux axes de signalisation associé à la prolifération et la différenciation cellulaires. Le sujet y est d’abord abordé sous l’angle d’une perspective historique, en mettant l’emphase sur les contributions des études de génétique classique chez les organismes modèles D. melanogaster et C. elegans. Il fait ensuite état du développement du criblage par ARNi pan-génomique dans ces deux modèles en le comparant aux approches de criblage génétique classique. Le corps de l’ouvrage décrit ensuite les résultats expérimentaux d’une campagne de criblage par ARNi visant à dresser une carte globale des régulateurs de la voie chez la drosophile. Trois groupes de régulateurs identifiés dans ce crible ont été caractérisés de manière plus détaillée. Dans un premier article, nous démontrons que les composantes du complexe EJC ont un impact sur l’épissage de mapk; une découverte doublement intéressante puisque l’EJC était jusqu’alors associé qu’à la régulation post-épissage des ARNm. Une seconde publication fait état de l’ensemble des résultats du crible ARNi, mettant l’emphase sur un ensemble de facteurs d’épissage qui modulent également mapk. Nous y montrons que l’impact de ces facteurs sur l’épissage alternatif est différent de celui de l’EJC, suggérant ainsi deux modes de régulation distincts. Finalement, dans un troisième manuscrit, nous nous attardons au rôle d’Usp47, une déubiquitinase qui, contrairement aux autres facteurs identifiés dans le crible, régule l’expression de MAPK de manière post-traductionnelle. Nous y détaillons une stratégie de criblage d’interaction génétique par ARNi visant à identifier des facteurs reliés fonctionnellement à Usp47. Ce second crible a permis l’identification de trois facteurs reliés au « N-end rule », un mécanisme de dégradation des protéines caractérisé par la reconnaissance des résidus N-terminaux de protéines ou peptides. Il existait jusqu’alors très peu de données quant à la régulation de l’expression des composantes de la voie MAPK, ce qui rend la description d’un large réseau de régulateurs agissant sur l’expression de MAPK d’autant plus insoupçonnée. L’absence d’un réseau équivalent rattaché aux autres composantes de la voie laisse supposer que MAPK serait un noeud servant de point d’entrée à ce type de régulation dans le système RAS/MAPK. De plus, nos travaux témoignent de la capacité de la génomique fonctionnelle à mettre en relation différents systèmes cellulaires de manière plus globale et à quantifier les liens établis entre eux. / The classical model of eukaryotic cellular signalling generally involves hierarchically organized linear pathways involving a restricted set of elements. These generally function together as an insulated circuit, transmitting information from the outside to the intracellular compartment involved in eliciting a response. These models, often the fruit of reductionist experimental approaches, do not allow for the integration of multiple inputs nor for a gradation of responses. The recent emergence of more holistic investigation techniques has brought about the re-evaluation of these classical models in favor of multiparametric signalling networks. This thesis focuses on the RAS/MAPK pathway, one of the cell’s main proliferation and differentiation signalling conduits, beginning with a historical perspective covering the contributions of model organism genetics to the current pathway model. This provides context for the description of a whole-genome RNAi screen experiment that we carried out to obtain a global view of regulators in Drosophila. Three groups of factors emerging from this screen were then examined in more detail. A first article shows that the exon junction complex (EJC) plays a role in mapk alternative splicing, an observation that is unexpected given that this complex was not previously known to act on splicing. A second paper details the genome wide screening campaign and focuses on a large set of splicing factors that also regulate mapk, albeit in a distinct manner than the EJC’s. Finally, a manuscript in a third segment examines Usp47 function and finds it to control MAPK levels post-translationally. An RNAi-based genetic interaction screen is then used to identify factors functionally related to Usp47 capable of counteracting its impact on MAPK levels. Three such factors identified through this technique are linked to the N-end rule protein degradation pathway. Regulation of core pathway component expression is a poorly described process, which makes the identification of a large set of factors regulating MAPK expression all the more unusual. Moreover, the absence of such regulation linked to other pathway components suggests that MAPK may act as a node incorporating inputs of this type into RAS/MAPK signaling dynamics.