Les forces mécaniques dirigeant la valvulogénèse sont mal connues. Chez le poisson zèbre, le flux induit l’expression du facteur de transcription klf2a de façon endothéliale spécifique afin d’initier ce processus. Nous nous sommes intéressés aux mécanismes moléculaires activés par le flux et aboutissant à la formation des valves cardiaques. En altérant et modifiant le pattern fluidique, nous avons observé le rôle des forces engendrées par le flux pour le contrôle de l’expression de klf2a ainsi que du nombre de cellules endocardiques. Nous avons ensuite regardé les divers mécanosenseurs pouvant intervenir lors de ce processus. Ainsi nous avons mis à jour la présence de cils dans l’endocarde et fait la relation entre les canaux membranaires TRPP2 et TRPV4, la présence de calcium intracellulaire dans les cellules endocardiques et la voie moléculaire PKC-PKD2-HDAC5, composants nécessaires à l’expression du gène klf2a en réponse au flux. Ces données nous permettent de suggérer le rôle de TRPP2, TRPV4 et la voie moléculaire récemment découverte, PKC-PKD2-HDAC5 dans la formation valvulaire dépendante de klf2a. / Mechanical forces that dictate valve formation are not well understood. In zebrafish, blood flow induces expression of the transcription factor klf2a in a specific subset of endocardial cells that will go on to form functional valves. We aimed to identify the molecular mechanisms activating this flow-induced valve formation. By altering and modifying blood flow patterns, we observed that flow-mediated forces are necessary to control early klf2a expression and endocardial cell numbers. We then looked at different mechanosensors operating at early stages of valve development. Using in vivo labelling, we identified primary cilia in the endocardium and showed that the membrane channels TRPP2 and TRPV4 increase intracellular calcium which activates a PKC-PKD2-HDAC5 pathway necessary for klf2a expression in response to flow. Together these data suggest a role for TRPV4, TRPP2 and the recently described PKC-PKD2-HDAC5 signalling pathway in klf2a-mediated valvulogenesis.

L’Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) est un peptide vasoconstricteur qui joue un rôle proéminent dans la progression des maladies cardiovasculaires, grâce à la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ERO), ainsi que par l'hyperactivation des voies de signalisation qui promeuvent la croissance et l'expression aberrante des gènes. Les histones désacétylases (HDACs), par leur aptitude à modifier le statut d'acétylation des résidus lysine dans les protéines d'histones et non-histones, régulent la transcription des gènes. Des études récentes ont montré qu'une activation accrue des HDACs, notamment HDAC5, est associée à des troubles vasculaires tels que l'athérosclérose. Cependant, le rôle de l'IGF-1 dans l'activation des HDACs par phosphorylation demeure mal caractérisé. Donc, dans les études présentes, on a examiné l’effet de l’IGF-1 sur la phosphorylation de HDAC5 dans les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV) de type A10 et on a identifié les voies de signalisation impliquées dans ce processus. Le traitement des CMLV avec l’IGF-1 a augmenté la phosphorylation de HDAC5 sur la serine 498 de manière temps- et dose-dépendante. La pré-incubation des cellules avec l’AG1024, un inhibiteur pharmacologique du récepteur membranaire à l’IGF-1, a significativement atténué la phosphorylation d’HDAC5 induite par l'IGF-1. Par contre, le prétraitement avec l’AG1478, un inhibiteur du récepteur du facteur de croissance épidermique, n'a pas eu d'effet significatif sur les niveaux de phosphorylation d’HDAC5. En outre, le blocage pharmacologique de la voie MAP kinase avec divers inhibiteurs (PD98059, UO126, SP600125 et SB203580) n’a pas abrogé la phosphorylation d’HDAC5, cependant les inhibiteurs de la voie protéine kinase B (PKB)/PI3-K, SC-66 et wortmannine respectivement, ont complètement aboli la phosphorylation d’HDAC5 induite par l’IGF-1. Ces données ont été confirmées par des expériences d’immunofluorescence et de silençage génique de PKB par interférence d’ARN. En outre, le prétraitement des cellules avec le diphénylèneiodonium (DPI) et l’apocynine, deux inhibiteurs de la NAD(P)H oxydase, ainsi que l'antioxydant N-acétyl-cystéine (NAC), a atténué la phosphorylation de HDAC5 et de PKB par l’IGF-1. De plus, le silençage génique de Nox4, la principale NAD(P)H oxydase des CMLV, a atténué la phosphorylation d’HDAC5 induite par l’IGF-1. De plus, l’utilisation des techniques d’extraction nucléaire a indiqué que le SC-66 et le DPI inhibent l’exportation nucléaire de HDAC5 induit par IGF-1. En résumé, ces données suggèrent que l'IGF-1 induit la phosphorylation et l’exportation nucléaire de HDAC5 de façon ERO et PKB-dépendante dans les CMLV. / Insulin-like growth factor 1 (IGF-1), a potent mitogenic and vasoactive factor, has been shown to play a role in the development of cardiovascular diseases. This occurs through the generation of reactive oxygen species (ROS) as well as through the hyperactivation of mitogenic and growth promoting signaling pathways and the subsequent alteration in gene expression. Histone deacetylases (HDACs), by their ability to modify the acetylation status of the lysine residues in histone and non-histone proteins, regulate gene transcription. Recent studies have demonstrated that a heightened activation of HDACs, notably HDAC5, is associated with vascular disorders such as atherosclerosis. However, a role of IGF-1 in HDAC phosphorylation and activation has not been investigated. Therefore, in the present studies, we examined the effect of IGF-1 on the phosphorylation of HDAC5 in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and identified the signaling pathways involved in this process. Treatment of A10 VSMCs with IGF-1 enhanced the phosphorylation of HDAC5 at serine 498 in a time and dosedependent fashion. Pretreatment of cells with AG1024, a selective pharmacological inhibitor of IGF-1R, significantly inhibited IGF-1-induced HDAC5 phosphorylation in A10 VSMCs whereas AG1478, a selective inhibitor of epidermal growth factor receptor (EGFR), did not have an inhibitory effect on the levels of phospho-HDAC5. Pharmacological blockade of the MAPK pathway with PD98059, UO126, SP600125 and SB203580 had no effect on HDAC5 phosphorylation, whereas inhibitors of the PI3K/ PKB pathways, wortmannin and SC-66 respectively, almost completely attenuated IGF- 1-induced HDAC5 phosphorylation. These findings were confirmed by immunofluorescence localization of phospho-HDAC5 and by siRNA-induced silencing of PKB. In addition, pretreatment of A10 VSMCs with Diphenyleneiodonium (DPI) and apocynin, two NAD(P)H oxidase inhibitors, as well as the antioxidant N-Acetyl-Cysteine (NAC), resulted in an attenuation of IGF-1-induced HDAC5 and PKB phosphorylation. Furthermore, siRNA-induced silencing of Nox4, the main NADPH oxidase expressed in VSMC, inhibited IGF-1 induced HDAC5 phosphorylation. Moreover, IGF-1-induced phosphorylation of HDAC5 resulted in its nuclear export, which was reversed by blockade of PKB by SC-66 or NAD(P)H oxidase inhibition by DPI. In summary, these data demonstrate that IGF-1 induces the phosphorylation and nuclear export of HDAC5 in a Nox4-derived ROS- and PKB-dependent fashion in VSMCs.

Une augmentation de la concentration de l’angiotensine II (Ang II) contribue à la prolifération, la migration et l’hypertrophie des cellules musculaires lisses vasculaires (CMLVs) par l’activation des voies des mitogen-activated protein kinases (MAPK) et de la phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protéine kinase B (PKB/Akt). L’Ang II induit l’activation du facteur de transcription early growth response protein-1 (Egr-1) et sa suractivation est remarquée dans les lésions athérosclérotiques et les modèles animaux de lésions vasculaires. La régulation des facteurs de transcription est effectuée par des histones désacétylases (HDACs) qui désacétylent les lysines des histones et protéines non-histones. L’Ang II induit la phosphorylation et l’export nucléaire de la classe IIa des HDACs, particulièrement les HDAC5, et une augmentation de celles-ci est observée dans les maladies vasculaires. L’Ang II est un puissant activateur des voies des MAPK et de la PI3K/Akt, toutefois l’implication de ces voies dans la phosphorylation des HDAC5 et l’expression de l’Egr-1 dans les CMLVs reste inexplorée. Dans cette étude, l’Ang II a induit la phosphorylation des HDAC5 sur la sérine 498 dans les A10 CMLVs. Un blocage pharmacologique de l’extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) par U0126 n’a montré aucun effet significatif sur la phosphorylation et l’exclusion nucléaire des HDAC5 induite par l’Ang II. Par contre, l’inhibition de la voie PI3K par wortmannin, de l’Akt par SC66 ou le knockdown de l’Akt par des petits ARN interférents (siRNA) a atténué la phosphorylation et l’export nucléaire des HDAC5 induits par l’Ang II. Par ailleurs, l’inhibition de l’Akt ou le knockdown de cette kinase a diminué l’expression de l’Egr-1 induite dans les CMLVs stimulées par l’Ang II. L’inhibition des HDACs de la classe IIa par MC1568 ou TMP-195 ou bien le knockdown des HDAC5 a diminué l’expression de l’Egr-1 induite par l’Ang II. De plus, le blocage de l’export nucléaire des HDAC5 par la leptomycine B ou la KPT-330 a empêché la localisation cytoplasmique des HDAC5 et a atténué l’expression de l’Egr-1 en réponse à une stimulation de l’Ang II. L’hypertrophie vasculaire induite par l’Ang II a pu être inhibée par la suppression de l’HDAC5 et l’Egr-1. En conclusion, l’Ang II induit la phosphorylation et l’exclusion nucléaire des HDAC5 par la voie PI3K/Akt et non celle de ERK1/2; de plus, l’Ang II induit l’expression de l’Egr-1 à l’aide des HDAC5 via la voie Akt contribuant ainsi à l’hypertrophie des CMLVs. / Elevated concentration of angiotensin II (Ang II) contributes to vascular smooth muscle cells (VSMCs) proliferation, migration and hypertrophy by the activation of the mitogen-activated protein kinases (MAPK) and phosphoinositide 3-kinase (PI3K)/protein kinase B (PKB/Akt) pathways. Ang II induced the expression of early growth response protein-1 (Egr-1), which is a transcription factor that is upregulated in atherosclerosis lesions and in animal models of vascular injuries. The activation or derepression of gene transcription is mediated by histone deacetylases (HDACs), which deacetylate lysine residues from histone and non-histones proteins. Ang II-induced the phosphorylation and nuclear export of class IIa HDACs, notably HDAC5, and its elevated activation is observed in vascular pathologies. Ang II is a potent activator of the MAPK and PI3K/Akt pathways, however their implication in the phosphorylation of HDAC5 and Egr-1 expression in VSMCs remain unexplored. In this study, Ang II-induced HDAC5 phosphorylation at serine 498 in A10 VSMCs and pharmacological blockade of the extracellular signal-regulated kinase 1/2 (ERK1/2) by U0126 did not affect the phosphorylation and nuclear exclusion of HDAC5 in response to Ang II. Whereas, pharmacological inhibition of the PI3K by wortmannin, Akt by SC66 or small interfering RNA (siRNA)-induced silencing of Akt attenuated Ang II-induced HDAC5 phosphorylation and its nuclear export. Furthermore, inhibition or knockdown of Akt suppressed Ang II-induced Egr-1 expression. In addition, the inhibition of class IIa HDAC5 by MC1568, TMP-195 or HDAC5 knockdown by siRNA reduced Ang II-induced Egr-1 expression. The blockade of the nuclear export of HDAC5 by leptomycin B or KPT-330 prevented the cytoplasmic localization of HDAC5 and attenuated the expression of Egr-1 by Ang II in VSMCs. Moreover, HDAC5 or Egr-1 depletion prevented Ang II-induced cell hypertrophy. In summary, Ang II-induced HDAC5 phosphorylation and its nuclear export is mediated by the PI3K/Akt and not the ERK1/2 pathway, in addition, Ang II-induced Egr-1 expression involves the implication of HDAC5 via the Akt pathway which subsequently leads to VSMC hypertrophy.