Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2013-11-04T12:15:31Z
No. of bitstreams: 1
Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-11-04T12:15:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1
Dissertação Mestrado Felipe Leprevost.pdf: 8130365 bytes, checksum: 2af7aa9ac89832c8e4c552a4d889c5e9 (MD5)
Previous issue date: 2009 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Atualmente novas abordagens e metodologias de pesquisa nos permitem iniciar
projetos de caracterização de um conjunto de proteínas de um determinado
organismo em escalas superiores aos realizados há algum tempo. Novas
tecnologias para seqüenciamento, clonagem e expressão protéica permitem a
geração de uma quantidade grande de novas informações numa fração de tempo
relativamente curta. Organismos como o Trypanosoma cruzi, que possuem
praticamente metade de seu genoma sem função conhecida, necessitam que
estudos sejam realizados para que se consiga atribuir às proteínas de função
desconhecida características funcionais. Em um esforço para se conhecer melhor os
genes de função desconhecida deste parasita, um grupo de 10 genes foi
selecionado com base na sua expressão diferencial durante a metaciclogênese,
consistindo de genes anotados como ‘proteína hipotética’ em banco de dados
públicos, com domínio identificado pelo banco de famílias protéicas PFAM e com
ortólogos em outros organismos. Os 10 genes selecionados foram amplificados e
clonados na plataforma de clonagem Gateway e as proteínas recombinantes foram
expressas em Escherichia coli. Dos 10 genes destinados à expressão protéica, 8
expressaram proteínas insolúveis as quais foram utilizadas para obtenção de soro
policlonal. Os soros obtidos foram utilizados em ensaios de Western Blot para
averiguação da expressão protéica ao longo da metaciclogênese do parasita e
ensaios de localização celular por microscopia ótica e eletrônica. Foram realizados
também ensaios de transfecção em T. cruzi para a expressão das proteínas
fusionadas com GFP, visando à determinação da localização celular, utilizando um
vetor compatível com a plataforma Gateway, e foram realizados ensaios de
imunoprecipitação para todas as 8 proteínas expressas. Os resultados obtidos no
presente trabalho auxiliam na atribuição de informações experimentais a genes e
proteínas anotados como ‘proteína hipotética de função desconhecida’ e avaliam a
possibilidade de implementação de um estudo sistemático com este para uma
aplicação em média/larga escala / Recent research approaches and methodologies allow us to develop projects for
the characterization of proteins of a given organism in scales greater than possible
some time ago. New technologies for sequencing, cloning and protein expression
allow the generation of large amounts of new information in relatively short time.
Organisms such as Trypanosoma cruzi, which have nearly half of its genome with no
known function, require studies to assign functions to proteins of unknown function.
In an effort to characterize the genes of unknown function of this parasite, a group of
10 genes was selected based on their differential expression during
metacyclogenesis. The genes were annotated as 'hypothetical protein' in public
databases, with domains identified in the PFAM database and with orthologs in other
organisms. The 10 selected genes were amplified and cloned in Gateway cloning
platform and the recombinant proteins were expressed in Escherichia coli. Eight of
the 10 genes expressed insoluble proteins which were used to obtain polyclonal
serum. The sera were used in Western Blot analysis to verify protein expression
throughout the parasite metacyclogenesis as well as cellular localization by optical
and electron microscopy. To determine cellular localization, transfection experiments
were conducted in T. cruzi for the expression of proteins fused with GFP using a
vector compatible with the Gateway platform. Immunoprecipitation assays were also
performed for the 8 expressed proteins. The results obtained in this work uncover
experimental information of genes annotated as 'hypothetical protein of unknown
function' and assess the possibility of implementing a systematic approach with this
methodology in medium to large scale
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/7217 |
| Date | January 2009 |
| Creators | Leprevost, Felipe da Veiga |
| Contributors | Domingues, Alejandro Correa, Moraes, Milton Ozório, Ramos, Augusto Savio, Krieger, Marco Aurélio, Pavoni, Daniela Parada |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0021 seconds