Os leucotrienos (LTs) são mediadores inflamatórios derivados da via 5- lipoxigenase (5-LO), com contribuição relevante na reabsorção óssea. Neste estudo investigamos o papel dos LTs na diferenciação osteogênica e o seu impacto na osteoclatogênese. Assim, foi avaliado o perfil ósseo dos camundongos 129/Sv (WT) e 5-LO Knockout (5-LO KO) por meio de microtomografia computadorizada, evidenciando maior densidade óssea vertebral e trabéculas mais espessas em machos 5-LO KO. Após isso, osteoblastos primários (OBL) foram isolados e cultivados para determinar a atividade de fosfatase alcalina (ALP) e o potencial de mineralização. Resultados mostraram que OBL KO possui maior atividade de ALP e mineralização, em todos os períodos quando comparados com WT. Em adição, o tratamento com os LTs B4 e D4 inibiu a deposição de cálcio. Os inibidores da síntese de LTs e os antagonistas do BLT1/2 foram efetivos em recuperar a formação dos nódulos mineralizados. A cinética do Alox5 apresentou um aumento da expressão nos períodos de maior diferenciação celular em OBL WT. Além disso, a expressão de OCN, MMPs 2 e 9 e RANKL foram aumentadas em células 5-LO KO em quase todos os períodos avaliados. Em geral, o estímulo com LTs, seus inibidores e antagonistas diminuiu a expressão de Sp7, Col1a1, Opg e MMP-9 e aumentou RANKL em células KO. A sinalização por meio de segundos mensageiros também foi avaliada. Células 5-LO KO apresentam menor concentração de cálcio intracelular (Ca2+i) em relação ao WT. No período de 14 dias, o estímulo com LTD4 inibiu a liberação Ca2+i independente da linhagem, em relação ao controle. Os níveis de cAMP foram menores em OBL 5- LO KO, em todos os grupos tratados ou controle. LTD4 diminuiu a concentração de cAMP, mas não LTB4, em OBL 5-LO KO. O estudo também quantificou a produção de LTB4 e outros eicosanoides em osteoblastos mostrando a sua capacidade de síntese. A análise proteômica revelou 89 proteínas com expressão diminuída em OBL 5-LO KO, de um total de 154, sendo a maioria relacionada ao citoesqueleto e ao metabolismo energético. Também foram identificadas 59 proteínas exclusivas em OBL 5-LO KO e 06 unicamente expressas em células WT, revelando as diferenças intrínsecas de cada animal. O perfil osteoclastogênico de camundongos WT vs. 5-LO KO mostrou diferenças significativas na análise fenotípica, TRAP e na expressão gênica de células derivadas da linhagem monocítica-macrofágica. Após o estímulo com M-CSF e RANKL, as células WT apresentaram osteoclastos gigantes multinucleados, porém, células 5-LO KO apresentaram uma população de células com formas e tamanhos variáveis, e menor grau de maturação. Em adição, os LTsexógenos não modularam a atividade da TRAP. O meio condicionado proveniente dos OBL WT e KO, retardaram o processo de formação dos osteoclastos. A análise da expressão gênica em osteoclastos mostrou diminuição da expressão de Alox5, Il- 1b, Il-6 e TNFa em células 5-LO KO. BLT1/2, CysLt1 e os marcadores da diferenciação Acp5, Ctsk e Nfact1 não apresentaram diferenças entre os animais. Em adição, o LTB4 diminuiu a expressão do Alox5 e a Il-1b foi aumentada em osteoclastos WT. Assim, os resultados demonstram que os LTs são capazes de modular o metabolismo ósseo, e a ausência do gene da 5-LO está relacionada ao maior perfil osteogênico. / Leukotrienes (LTs) are inflammatory mediators derived from the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway, with a relevant contribution in bone resorption. In this study we investigated the role of LTs in osteogenic differentiation and its impact on osteoclastogenesis.Thus, the bone profile of the 129/Sv (WT) and 5-LO Knockout mice (5-LO KO) was evaluated by computerized microtomography, showing higher vertebral bone density and thicker trabeculae in 5-LO KO males. After that, primary osteoblasts (OBL) were isolated and cultured to determine alkaline phosphatase activity (ALP) and mineralization potential. Results showed that OBL KO has higher ALP activity and mineralization, in all periods when compared with WT. In addition, the treatment with LTB4 and LTD4 inhibited calcium deposition. Inhibitors of LT synthesis and BLT1/2 antagonists were effective to recover the mineralized nodules formation. The kinetics of Alox5 showed an increase in expression during cellular differentiation period in WT OBL. In addition, expression of OCN, MMPs 2 and 9 and RANKL were increased in 5- LO KO cells in almost all evaluated periods. In general, the stimulation with LTs, their inhibitors and antagonists decreased the expression of Sp7, Col1a1, Opg and MMP- 9. But it increased the RANKL expression in KO cells. The second messengers signaling was also evaluated. 5-LO KO cells showed lower concentration levels of intracellular calcium (Ca2+ i) when compared to WT cells. In the 14-day period, the LTD4 treatment inhibited the Ca2+i independent of the murine lineage, relative to the control. cAMP levels were lower in OBL 5-LO KO, in all treated or control groups. LTD4 decreased the concentration of cAMP, but not LTB4, in KO cells. The study also quantified the production of LTB4 and other eicosanoids in osteoblasts showing their ability to synthesize those metabolites. The proteomic analysis revealed 89 downregulated proteins in OBL KO, out of a total of 154, most of them related to cytoskeleton and energy metabolism. Also 59 identified proteins were unique in OBL 5-LO KO and 06 exclusively expressed in WT cells, revealing the intrinsic differences of each strain. The osteoclastogenic profile of WT vs. 5-LO KO showed significant differences in phenotypic analysis, TRAP and in the gene expression of cells derived from the monocyte-macrophage-lineage. After M-CSF and RANKL stimulation, WT cells showed multinucleated giant osteoclasts. However, 5-LO KO cells presented a population of cells with variable shapes and sizes, and a lower maturation stage. In addition, exogenous LTs did not modulate TRAP activity. The conditioned medium from OBL WT and 5-LO KO delayed the formation process of osteoclasts. Gene expression analysis in osteoclasts showed decreased expression of Alox 5, Il-1b, Il-6 and TNF in 5-LO KO cells. BLT1/2, CysLt1 and the osteoclast differentiation markers Acp5, Ctsk and Nfact1 showed no differences between the strains. In addition, LTB4 decreased the expression of Alox5, and IL-1b was increased in WT osteoclasts. Thus, the results demonstrate that the LTs are able to modulate the bone metabolism, and the absence of the 5-LO gene is related to the greater osteogenic profile.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-24052018-182709 |
| Date | 26 January 2018 |
| Creators | Oliveira, Flávia Amadeu de |
| Contributors | Oliveira, Rodrigo Cardoso de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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