Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3094_1.pdf: 1812433 bytes, checksum: 9e653e1c540a89a588becea9f2d123a8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As células-tronco são dotadas de capacidade de auto-renovação e diferenciação, que têm os tecidos adultos como uma de suas fontes. Essas células podem ser expandidas em cultura e dar origem a múltiplas linhagens. Dentre as células-tronco adultas, as mesenquimais ocupam posição de destaque, uma vez que são células multipotentes com capacidade de originar osteoblastos, adipócitos, condrócitos, neurônios e hepatócitos. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical são funcionalmente similares às derivadas de medula óssea (fonte clássica). Esse tecido apresenta-se como atraente fonte alternativa dessas células também por: existir em abundância, ser normalmente descartado pós-parto, além do procedimento para sua coleta não ser invasivo. No momento, a terapia celular representa grande esperança na medicina regenerativa devido à perspectiva de se reparar a perda de tecidos e/ou até mesmo órgãos nobres do corpo. As pesquisas com células-tronco ainda estão num estágio onde muitas questões científicas precisam ser resolvidas até suas aplicações se tornarem definitivas. Existem inúmeros métodos de isolamento dependendo tanto da origem do tecido, quanto dos procedimentos adotados pelos laboratórios. Neste trabalho analisamos a obtenção de células-tronco da geléia de Wharton de cordão umbilical humano através do método da migração espontânea . Todos os experimentos foram realizados de acordo com protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE (n°.420/2007). O isolamento de células-tronco foi feito a partir da população primária de células mesenquimais. Utilizamos, para isso uma nova metodologia da seleção celular - imunomagnética columnfree conhecida como EasySep Magnet - EMA , no modo de seleção positiva pelo CD44 ou CD90. A eficácia do isolamento foi comprovada por citometria de fluxo (FACSCalibur). A mesma metodologia foi utilizada para detecção da expressão dos marcadores de superfície nas membranas citoplasmáticas das células (fenotipagem). A diferenciação osteogênica foi induzida durante três semanas com meio de cultura suplementado com indutores: ácido ascórbico, dexametasona e β-glicerofosfato. Observamos que as células primárias da migração espontânea (terceira passagem) mostraram presença até 70-80% de células positivas aos marcadores das células-tronco mesenquimais. Todavia, nas culturas das células selecionadas mais de 90% das células foram positivas para os marcadores das células-tronco mesenquimais (CD90+; CD44+; CD29+) e negativas para as de origem hematopoéticas (CD45-; CD34- e CD31-). O tempo de duplicação das células-tronco foi de 2-3 dias. As células tiveram morfologia fibroblastóide e possuíram potencial de diferenciação pronunciado. Especificamente, o estímulo osteogênico originou características osteoblásticas que foram comprovadas por coloração citohistoquímica (von Kossa) onde se observou o aparecimento de cristais de hidroxiapatita na matriz extracelular. Desta forma, estabelecemos que a migração espontânea é um método relativamente simples, que requer menos tempo de processamento e resulta em considerável quantidade das células com alto índice de marcadores específicos das células-tronco já na população primária obtida. A seleção positiva com partículas magnéticas é capaz de aumentar ainda mais a pureza das células-tronco isoladas de cordão umbilical humano

Os leucotrienos (LTs) são mediadores inflamatórios derivados da via 5- lipoxigenase (5-LO), com contribuição relevante na reabsorção óssea. Neste estudo investigamos o papel dos LTs na diferenciação osteogênica e o seu impacto na osteoclatogênese. Assim, foi avaliado o perfil ósseo dos camundongos 129/Sv (WT) e 5-LO Knockout (5-LO KO) por meio de microtomografia computadorizada, evidenciando maior densidade óssea vertebral e trabéculas mais espessas em machos 5-LO KO. Após isso, osteoblastos primários (OBL) foram isolados e cultivados para determinar a atividade de fosfatase alcalina (ALP) e o potencial de mineralização. Resultados mostraram que OBL KO possui maior atividade de ALP e mineralização, em todos os períodos quando comparados com WT. Em adição, o tratamento com os LTs B4 e D4 inibiu a deposição de cálcio. Os inibidores da síntese de LTs e os antagonistas do BLT1/2 foram efetivos em recuperar a formação dos nódulos mineralizados. A cinética do Alox5 apresentou um aumento da expressão nos períodos de maior diferenciação celular em OBL WT. Além disso, a expressão de OCN, MMPs 2 e 9 e RANKL foram aumentadas em células 5-LO KO em quase todos os períodos avaliados. Em geral, o estímulo com LTs, seus inibidores e antagonistas diminuiu a expressão de Sp7, Col1a1, Opg e MMP-9 e aumentou RANKL em células KO. A sinalização por meio de segundos mensageiros também foi avaliada. Células 5-LO KO apresentam menor concentração de cálcio intracelular (Ca2+i) em relação ao WT. No período de 14 dias, o estímulo com LTD4 inibiu a liberação Ca2+i independente da linhagem, em relação ao controle. Os níveis de cAMP foram menores em OBL 5- LO KO, em todos os grupos tratados ou controle. LTD4 diminuiu a concentração de cAMP, mas não LTB4, em OBL 5-LO KO. O estudo também quantificou a produção de LTB4 e outros eicosanoides em osteoblastos mostrando a sua capacidade de síntese. A análise proteômica revelou 89 proteínas com expressão diminuída em OBL 5-LO KO, de um total de 154, sendo a maioria relacionada ao citoesqueleto e ao metabolismo energético. Também foram identificadas 59 proteínas exclusivas em OBL 5-LO KO e 06 unicamente expressas em células WT, revelando as diferenças intrínsecas de cada animal. O perfil osteoclastogênico de camundongos WT vs. 5-LO KO mostrou diferenças significativas na análise fenotípica, TRAP e na expressão gênica de células derivadas da linhagem monocítica-macrofágica. Após o estímulo com M-CSF e RANKL, as células WT apresentaram osteoclastos gigantes multinucleados, porém, células 5-LO KO apresentaram uma população de células com formas e tamanhos variáveis, e menor grau de maturação. Em adição, os LTsexógenos não modularam a atividade da TRAP. O meio condicionado proveniente dos OBL WT e KO, retardaram o processo de formação dos osteoclastos. A análise da expressão gênica em osteoclastos mostrou diminuição da expressão de Alox5, Il- 1b, Il-6 e TNFa em células 5-LO KO. BLT1/2, CysLt1 e os marcadores da diferenciação Acp5, Ctsk e Nfact1 não apresentaram diferenças entre os animais. Em adição, o LTB4 diminuiu a expressão do Alox5 e a Il-1b foi aumentada em osteoclastos WT. Assim, os resultados demonstram que os LTs são capazes de modular o metabolismo ósseo, e a ausência do gene da 5-LO está relacionada ao maior perfil osteogênico. / Leukotrienes (LTs) are inflammatory mediators derived from the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway, with a relevant contribution in bone resorption. In this study we investigated the role of LTs in osteogenic differentiation and its impact on osteoclastogenesis.Thus, the bone profile of the 129/Sv (WT) and 5-LO Knockout mice (5-LO KO) was evaluated by computerized microtomography, showing higher vertebral bone density and thicker trabeculae in 5-LO KO males. After that, primary osteoblasts (OBL) were isolated and cultured to determine alkaline phosphatase activity (ALP) and mineralization potential. Results showed that OBL KO has higher ALP activity and mineralization, in all periods when compared with WT. In addition, the treatment with LTB4 and LTD4 inhibited calcium deposition. Inhibitors of LT synthesis and BLT1/2 antagonists were effective to recover the mineralized nodules formation. The kinetics of Alox5 showed an increase in expression during cellular differentiation period in WT OBL. In addition, expression of OCN, MMPs 2 and 9 and RANKL were increased in 5- LO KO cells in almost all evaluated periods. In general, the stimulation with LTs, their inhibitors and antagonists decreased the expression of Sp7, Col1a1, Opg and MMP- 9. But it increased the RANKL expression in KO cells. The second messengers signaling was also evaluated. 5-LO KO cells showed lower concentration levels of intracellular calcium (Ca2+ i) when compared to WT cells. In the 14-day period, the LTD4 treatment inhibited the Ca2+i independent of the murine lineage, relative to the control. cAMP levels were lower in OBL 5-LO KO, in all treated or control groups. LTD4 decreased the concentration of cAMP, but not LTB4, in KO cells. The study also quantified the production of LTB4 and other eicosanoids in osteoblasts showing their ability to synthesize those metabolites. The proteomic analysis revealed 89 downregulated proteins in OBL KO, out of a total of 154, most of them related to cytoskeleton and energy metabolism. Also 59 identified proteins were unique in OBL 5-LO KO and 06 exclusively expressed in WT cells, revealing the intrinsic differences of each strain. The osteoclastogenic profile of WT vs. 5-LO KO showed significant differences in phenotypic analysis, TRAP and in the gene expression of cells derived from the monocyte-macrophage-lineage. After M-CSF and RANKL stimulation, WT cells showed multinucleated giant osteoclasts. However, 5-LO KO cells presented a population of cells with variable shapes and sizes, and a lower maturation stage. In addition, exogenous LTs did not modulate TRAP activity. The conditioned medium from OBL WT and 5-LO KO delayed the formation process of osteoclasts. Gene expression analysis in osteoclasts showed decreased expression of Alox 5, Il-1b, Il-6 and TNF in 5-LO KO cells. BLT1/2, CysLt1 and the osteoclast differentiation markers Acp5, Ctsk and Nfact1 showed no differences between the strains. In addition, LTB4 decreased the expression of Alox5, and IL-1b was increased in WT osteoclasts. Thus, the results demonstrate that the LTs are able to modulate the bone metabolism, and the absence of the 5-LO gene is related to the greater osteogenic profile.

The use of stem cells is a promising therapeutic approach for tissue engineering by their ability to boost tissue regeneration, and to model in vitro human genetics disorders since it provides continuous supplies of cells with differentiation potential. Our study has been focused in the identification of molecules or mechanisms that could contribute to a better osteogenesis in mesenchymal stem cells (MSC). To achieve our goals we have explored the osteopontential differences of stem cells from different sources. In this regard, we have observed that MSCs from human exfoliated deciduous teeth (SHED) presented higher in vitro osteogenic differentiation potential (OD) as compared to MSCs derived from human adipose tissue (hASCs). Through microarray analysis and cell sorting, we have shown that IGF2 and CD105 expression levels contribute to these osteopontential cell differences, that is, higher IGF2 expression levels and lower CD105 expression levels were associated with the increased osteogenic potential of SHED as compared to hASCs. The molecular mechanisms associated with the diferent expression levels of IGF2 and CD105 in these cells were also investigated. Despite the advantages of adult MSCs they can exhibit drawbacks such as restricted self-renewal and limited cell amounts. Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) technology has emerged as an alternative cell source, as they provide more homogeneous cellular populations with prolonged self-renewal and higher plasticity. We verified that the OD of MSC-like iPSC differs from MSCs and it depends on the iPSCs originating cellular source. Comparative in vitro osteogenesis analysis showed higher osteogenic potential in MSC-like cells derived from iPS-SHED when compared with MSC-like cells from iPS-FIB and SHED. iPSCs can be also used as a tool to model genetic disorders. We have thus proposed to verify if it could be possible to in vitro model Treacher-Collins syndrome, a condition with deficient craniofacial bone development. We have compared the effects of pathogenic mutations in TCOF1 gene in cell proliferation, differentiation potential between MSCs, dermal fibroblasts, neural-crest like and MSC-like cells differentiated from iPSCs.TCS cells showed changes in cell properties anddysregulated expression of chondrogenesis markers during osteogenic and chondrogenic differentiation. In summary, the comparative analysis of stem cells of different sources allow us to identify markers that may facilitate osteogenesis and that it is possible to establish an in vitro model to Treacher-Collins syndrome / O uso de células-tronco trata-se de uma abordagem terapêutica promissora para a engenharia de tecidos, devido à sua capacidade na regeneração de tecidos, e para modelamento in vitro de distúrbios genéticos humanos, uma vez que fornece um abastecimento contínuo de células com potencial de diferenciação. Nosso estudo se propos a identificar moléculas e mecanismos que contribuem na otimização da osteogênese de células-tronco mesenquimais (MSCs). Para atingir nossos objetivos exploramos as diferenças no potencial osteogênico (PO) de MSCs de diferentes fontes. Observamos que MSCs de polpa de dente decíduo humano (SHED) apresentaram maior PO em comparação com as MSC derivadas de tecido adiposo humano (hASCs). Através de análise de microarray de expressão e cell sorting, demonstramos que os níveis de expressão de IGF2 e CD105 contribuem para as diferenças do PO, onde a maior expressão de IGF2 e menor expressão de CD105 estão associadas a maior PO em SHED quando comparado as hASCs. Também investigamos os mecanismos moleculares associados aos diferentes níveis de expressão de IGF2 E CD105 em ambas as fontes celulares. Apesar das vantagens, as MSCs podem apresentar pontos negativos como restrita auto-renovação e menor quantidade de células. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) surgem como uma fonte celular alternativa, proporcionando populações celulares homogêneas com auto-renovação prolongada e maior plasticidade. O PO de MSC-like iPSC difere de MSCs, e este potencial é dependente da fonte celular em que as iPSCs são obtidas. Análise comparativa de PO in vitro demonstrou maior osteogênse em células MSC-like derivadas de iPS-SHED quando comparada as células MSC-like de iPSCs-fibroblastos e SHED. iPSCs também podem ser utilizadas como ferramenta para investigar doenças genéticas humanas. Propomos a modelagem in vitro da síndrome de Treacher-Collins (TSC), doença que acomete as estruturas craniofaciais durante o desenvolvimento ósseo. Comparamos os efeitos de mutações patogênicas no gene TCOF1 na proliferação celular, potencial de diferenciação entre MSCs, fibroblastos dérmicos, neural-crest like e células MSC-like diferenciadas de iPSCs. Células de pacientes TCS exibiram alterações em propriedades celulares e na expressão de marcadores osteogênicos e condrogênicos. Em resumo, a análise comparativa de células-tronco de diferentes fontes permitiu a identificação de marcadores e mecanismos que podem facilitar a osteogênese e tambem demonstramos que é possível modelar in vitro a síndrome de Treacher-Collins

The use of stem cells is a promising therapeutic approach for tissue engineering by their ability to boost tissue regeneration, and to model in vitro human genetics disorders since it provides continuous supplies of cells with differentiation potential. Our study has been focused in the identification of molecules or mechanisms that could contribute to a better osteogenesis in mesenchymal stem cells (MSC). To achieve our goals we have explored the osteopontential differences of stem cells from different sources. In this regard, we have observed that MSCs from human exfoliated deciduous teeth (SHED) presented higher in vitro osteogenic differentiation potential (OD) as compared to MSCs derived from human adipose tissue (hASCs). Through microarray analysis and cell sorting, we have shown that IGF2 and CD105 expression levels contribute to these osteopontential cell differences, that is, higher IGF2 expression levels and lower CD105 expression levels were associated with the increased osteogenic potential of SHED as compared to hASCs. The molecular mechanisms associated with the diferent expression levels of IGF2 and CD105 in these cells were also investigated. Despite the advantages of adult MSCs they can exhibit drawbacks such as restricted self-renewal and limited cell amounts. Induced Pluripotent Stem Cells (iPSC) technology has emerged as an alternative cell source, as they provide more homogeneous cellular populations with prolonged self-renewal and higher plasticity. We verified that the OD of MSC-like iPSC differs from MSCs and it depends on the iPSCs originating cellular source. Comparative in vitro osteogenesis analysis showed higher osteogenic potential in MSC-like cells derived from iPS-SHED when compared with MSC-like cells from iPS-FIB and SHED. iPSCs can be also used as a tool to model genetic disorders. We have thus proposed to verify if it could be possible to in vitro model Treacher-Collins syndrome, a condition with deficient craniofacial bone development. We have compared the effects of pathogenic mutations in TCOF1 gene in cell proliferation, differentiation potential between MSCs, dermal fibroblasts, neural-crest like and MSC-like cells differentiated from iPSCs.TCS cells showed changes in cell properties anddysregulated expression of chondrogenesis markers during osteogenic and chondrogenic differentiation. In summary, the comparative analysis of stem cells of different sources allow us to identify markers that may facilitate osteogenesis and that it is possible to establish an in vitro model to Treacher-Collins syndrome / O uso de células-tronco trata-se de uma abordagem terapêutica promissora para a engenharia de tecidos, devido à sua capacidade na regeneração de tecidos, e para modelamento in vitro de distúrbios genéticos humanos, uma vez que fornece um abastecimento contínuo de células com potencial de diferenciação. Nosso estudo se propos a identificar moléculas e mecanismos que contribuem na otimização da osteogênese de células-tronco mesenquimais (MSCs). Para atingir nossos objetivos exploramos as diferenças no potencial osteogênico (PO) de MSCs de diferentes fontes. Observamos que MSCs de polpa de dente decíduo humano (SHED) apresentaram maior PO em comparação com as MSC derivadas de tecido adiposo humano (hASCs). Através de análise de microarray de expressão e cell sorting, demonstramos que os níveis de expressão de IGF2 e CD105 contribuem para as diferenças do PO, onde a maior expressão de IGF2 e menor expressão de CD105 estão associadas a maior PO em SHED quando comparado as hASCs. Também investigamos os mecanismos moleculares associados aos diferentes níveis de expressão de IGF2 E CD105 em ambas as fontes celulares. Apesar das vantagens, as MSCs podem apresentar pontos negativos como restrita auto-renovação e menor quantidade de células. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) surgem como uma fonte celular alternativa, proporcionando populações celulares homogêneas com auto-renovação prolongada e maior plasticidade. O PO de MSC-like iPSC difere de MSCs, e este potencial é dependente da fonte celular em que as iPSCs são obtidas. Análise comparativa de PO in vitro demonstrou maior osteogênse em células MSC-like derivadas de iPS-SHED quando comparada as células MSC-like de iPSCs-fibroblastos e SHED. iPSCs também podem ser utilizadas como ferramenta para investigar doenças genéticas humanas. Propomos a modelagem in vitro da síndrome de Treacher-Collins (TSC), doença que acomete as estruturas craniofaciais durante o desenvolvimento ósseo. Comparamos os efeitos de mutações patogênicas no gene TCOF1 na proliferação celular, potencial de diferenciação entre MSCs, fibroblastos dérmicos, neural-crest like e células MSC-like diferenciadas de iPSCs. Células de pacientes TCS exibiram alterações em propriedades celulares e na expressão de marcadores osteogênicos e condrogênicos. Em resumo, a análise comparativa de células-tronco de diferentes fontes permitiu a identificação de marcadores e mecanismos que podem facilitar a osteogênese e tambem demonstramos que é possível modelar in vitro a síndrome de Treacher-Collins

Submitted by Luciana Daniele Trino (lucianadtrino@gmail.com) on 2018-06-08T15:40:25Z No. of bitstreams: 1 Tese_Luciana_Daniele_Trino_POSMAT.pdf: 6699069 bytes, checksum: be06e9652268b5025a7ed7d568576862 (MD5) / Approved for entry into archive by Lucilene Cordeiro da Silva Messias null (lubiblio@bauru.unesp.br) on 2018-06-08T17:37:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 trino_ld_dr_bauru.pdf: 6603946 bytes, checksum: dacabdf3e79f4b7c7de3dc9da7bdaa1f (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-08T17:37:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 trino_ld_dr_bauru.pdf: 6603946 bytes, checksum: dacabdf3e79f4b7c7de3dc9da7bdaa1f (MD5) Previous issue date: 2018-04-19 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O titânio e suas ligas são utilizados em diversas aplicações, dentre elas em implantes ortopédicos e dentários devido à sua reconhecida biocompatibilidade. No entanto, falhas e subsequentes efeitos colaterais clínicos ainda são recorrentes em implantes. Neste contexto, melhorias podem ser alcançadas projetando biomateriais nos quais o bulk e a superfície do titânio são independentemente modificadas. Deste modo, filmes finos nanoestruturados de óxidos metálicos, tais como TiO2 e ZnO, podem melhorar as propriedades físico-químicas, a biocompatibilidade e a resistência à corrosão dos implantes de titânio. Além disso, a conjugação de biomoléculas, como peptídeos derivados da proteína da matriz dentinária 1 (DMP1), na superfície dos óxidos metálicos pode melhorar sua bioatividade, acelerando o processo de osteointegração. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi funcionalizar óxidos metálicos com diferentes moléculas bifuncionais e investigar as propriedades físico-químicas de grupos silano, amino, ácido carboxílico, tiol e hidroxila que atuaram como espaçadores entre os óxidos metálicos e os peptídeos da DMP1. Além disso foram realizadas análises de biocompatibilidade, mineralização, resistência à corrosão e à tribocorrosão das superfícies bio-funcionalizadas com os peptídeos da DMP1. Neste trabalho, filmes de TiO2 e ZnO nanométricos foram sintetizados pelo método sol-gel e depositados pela técnica spin coating em substratos de titânio. Posteriormente, os filmes finos de óxidos metálicos foram funcionalizados com (3-aminopropil) trimetoxissilano (APTMS), ácido 3- (4-aminofenil) propiônico (APPA), ácido 3-mercaptopropiônico (MPA) ou polietilenoglicol (PEG), que atuam como espaçadores entre os óxidos metálicos e os peptídeos da DMP1. As análises físico-químicas por XPS, microscopia confocal, AFM, ângulo de contato e energia de superfície revelaram a efetiva modificação das superfícies dos óxidos metálicos com APTMS, APPA, MPA e PEG. Após a bio-funcionalização as análises físico-químicas confirmaram a presença dos peptídeos da DMP1 na superfície dos óxidos metálicos. Além disso, testes biológicos indicaram que os peptídeos puderam modular a afinidade, proliferação e diferenciação de células mesenquimais humanas. Para a amostra contendo o dióxido de titânio, foram observados melhores resultados para o TiO2 funcionalizado com MPA e os peptídeos da DMP1. Já para o óxido de zinco, melhores resultados de biocompatibilidade foram observados para ZnO funcionalizado com APPA e os peptídeos. Além disso, a imobilização dos peptídeos da DMP1 através dos espaçadores APPA e MPA, para ambos os óxidos, levou à formação de biominerais de apatita. Os resultados eletroquímicos indicaram um aumento da resistência à corrosão nos materiais bio-funcionalizados, sendo que melhores resultados foram observados para o TiO2 quando comparado ao ZnO. Além disso a análise de tribocorrosão apresentou menor perda de massa para as amostras de TiO2 bio-funcionalizadas. Considerando os aspectos de biocompatibilidade, diferenciação osteogênica, mineralização, resistência à corrosão e à tribocorrosão a amostra de TiO2 funcionalizada com MPA e os peptídeos da DMP1 foi a que apresentou melhores resultados. Portanto, os resultados obtidos sugerem que a bio-funcionalização de óxidos metálicos é capaz de projetar implantes de melhor qualidade aplicados à medicina regenerativa. / Titanium and its alloys are used in a variety of applications, including orthopedic and dental implants because of their recognized biocompatibility. However, failures and subsequent clinical side effects are still recurrent in implants. In this context, improvements can be achieved by designing biom aterials in which the bulk and surface of the titanium are independently tailored . Thus, nanostructured metal oxides thin films , such as TiO 2 and ZnO, can improve the physicochemical properties, biocompatibility and corrosion resistance of titanium implant s. In addition, the conjugation of biomolecules, such as peptides derived from the dentin matrix 1 protein (DMP1), on the surface of the metal oxides can improve their bioactivity, accelerating the os t eointegration process. Therefore, the objective of thi s work was to functionalize metal oxides with different bifunctional molecules and to investigate the physicochemical properties of silane, amino, carboxylic acid, thiol and hydroxyl groups that act as spacers between metal oxides and DMP1 peptides. In add ition, biocompatibility, mineralization, corrosion and tribocorrosion resistance of the bio - functionalized surfaces were performed. In this work, nanosized TiO 2 and ZnO thin films were synthesized by sol - gel method and deposited by spin coating technique o n titanium substrates. Subsequently, the thin films of metal oxides were functionalized with (3 - aminopropyl) trimethoxysilane (APTMS), 3 - (4 - aminophenyl) propionic acid (APPA), 3 - mercaptopropionic acid (MPA) or polyethylene glycol (PEG), which acted as spac ers between the metal oxides and the DMP1 peptides. The physicochemical analyzes by XPS, confocal microscopy, AFM, contact angle and surface energy revealed the effective modification of the metal oxides surfaces with APTMS, APPA, MPA and PEG. After the bi o - functionalization the physicochemical analyzes confirmed the presence of the DMP1 peptides on the surface of the metal oxides. In addition, biological tests indicated that the peptides could modulate the affinity, proliferation and differentiation of hum an mesenchymal stem cells. For the sample containing the titanium dioxide, better results were observed for the TiO 2 functionalized with MPA and the DMP1 peptides. On the other hand, better biocompatibility results were observed for ZnO functionalized with APPA and peptides. In addition, the immobilization of the DMP1 peptides through the APPA and MPA spacers for both oxides led to the formation of apatite biominerals. The electrochemical results indicated an increase in corrosion resistance in the bio - func tionalized materials, and better results were observed for TiO 2 when compared to ZnO. In addition, the tribocorrosion analysis presented lower mass loss for the bio - functionalized TiO 2 samples. Considering the aspects of biocompatibility, osteogenic differ entiation, mineralization, resistance to corrosion and tribocorrosion, the TiO 2 functionalized with MPA and DMP1 peptides presented the best results. Therefore, the results suggest that the bio - functionalization of metal oxides can design better quality im plants applied to regenerative medicine / 2014/01713-3

Os leucotrienos (LTs) são mediadores inflamatórios derivados da via 5- lipoxigenase (5-LO), com contribuição relevante na reabsorção óssea. Neste estudo investigamos o papel dos LTs na diferenciação osteogênica e o seu impacto na osteoclatogênese. Assim, foi avaliado o perfil ósseo dos camundongos 129/Sv (WT) e 5-LO Knockout (5-LO KO) por meio de microtomografia computadorizada, evidenciando maior densidade óssea vertebral e trabéculas mais espessas em machos 5-LO KO. Após isso, osteoblastos primários (OBL) foram isolados e cultivados para determinar a atividade de fosfatase alcalina (ALP) e o potencial de mineralização. Resultados mostraram que OBL KO possui maior atividade de ALP e mineralização, em todos os períodos quando comparados com WT. Em adição, o tratamento com os LTs B4 e D4 inibiu a deposição de cálcio. Os inibidores da síntese de LTs e os antagonistas do BLT1/2 foram efetivos em recuperar a formação dos nódulos mineralizados. A cinética do Alox5 apresentou um aumento da expressão nos períodos de maior diferenciação celular em OBL WT. Além disso, a expressão de OCN, MMPs 2 e 9 e RANKL foram aumentadas em células 5-LO KO em quase todos os períodos avaliados. Em geral, o estímulo com LTs, seus inibidores e antagonistas diminuiu a expressão de Sp7, Col1a1, Opg e MMP-9 e aumentou RANKL em células KO. A sinalização por meio de segundos mensageiros também foi avaliada. Células 5-LO KO apresentam menor concentração de cálcio intracelular (Ca2+i) em relação ao WT. No período de 14 dias, o estímulo com LTD4 inibiu a liberação Ca2+i independente da linhagem, em relação ao controle. Os níveis de cAMP foram menores em OBL 5- LO KO, em todos os grupos tratados ou controle. LTD4 diminuiu a concentração de cAMP, mas não LTB4, em OBL 5-LO KO. O estudo também quantificou a produção de LTB4 e outros eicosanoides em osteoblastos mostrando a sua capacidade de síntese. A análise proteômica revelou 89 proteínas com expressão diminuída em OBL 5-LO KO, de um total de 154, sendo a maioria relacionada ao citoesqueleto e ao metabolismo energético. Também foram identificadas 59 proteínas exclusivas em OBL 5-LO KO e 06 unicamente expressas em células WT, revelando as diferenças intrínsecas de cada animal. O perfil osteoclastogênico de camundongos WT vs. 5-LO KO mostrou diferenças significativas na análise fenotípica, TRAP e na expressão gênica de células derivadas da linhagem monocítica-macrofágica. Após o estímulo com M-CSF e RANKL, as células WT apresentaram osteoclastos gigantes multinucleados, porém, células 5-LO KO apresentaram uma população de células com formas e tamanhos variáveis, e menor grau de maturação. Em adição, os LTsexógenos não modularam a atividade da TRAP. O meio condicionado proveniente dos OBL WT e KO, retardaram o processo de formação dos osteoclastos. A análise da expressão gênica em osteoclastos mostrou diminuição da expressão de Alox5, Il- 1b, Il-6 e TNFa em células 5-LO KO. BLT1/2, CysLt1 e os marcadores da diferenciação Acp5, Ctsk e Nfact1 não apresentaram diferenças entre os animais. Em adição, o LTB4 diminuiu a expressão do Alox5 e a Il-1b foi aumentada em osteoclastos WT. Assim, os resultados demonstram que os LTs são capazes de modular o metabolismo ósseo, e a ausência do gene da 5-LO está relacionada ao maior perfil osteogênico. / Leukotrienes (LTs) are inflammatory mediators derived from the 5-lipoxygenase (5-LO) pathway, with a relevant contribution in bone resorption. In this study we investigated the role of LTs in osteogenic differentiation and its impact on osteoclastogenesis.Thus, the bone profile of the 129/Sv (WT) and 5-LO Knockout mice (5-LO KO) was evaluated by computerized microtomography, showing higher vertebral bone density and thicker trabeculae in 5-LO KO males. After that, primary osteoblasts (OBL) were isolated and cultured to determine alkaline phosphatase activity (ALP) and mineralization potential. Results showed that OBL KO has higher ALP activity and mineralization, in all periods when compared with WT. In addition, the treatment with LTB4 and LTD4 inhibited calcium deposition. Inhibitors of LT synthesis and BLT1/2 antagonists were effective to recover the mineralized nodules formation. The kinetics of Alox5 showed an increase in expression during cellular differentiation period in WT OBL. In addition, expression of OCN, MMPs 2 and 9 and RANKL were increased in 5- LO KO cells in almost all evaluated periods. In general, the stimulation with LTs, their inhibitors and antagonists decreased the expression of Sp7, Col1a1, Opg and MMP- 9. But it increased the RANKL expression in KO cells. The second messengers signaling was also evaluated. 5-LO KO cells showed lower concentration levels of intracellular calcium (Ca2+ i) when compared to WT cells. In the 14-day period, the LTD4 treatment inhibited the Ca2+i independent of the murine lineage, relative to the control. cAMP levels were lower in OBL 5-LO KO, in all treated or control groups. LTD4 decreased the concentration of cAMP, but not LTB4, in KO cells. The study also quantified the production of LTB4 and other eicosanoids in osteoblasts showing their ability to synthesize those metabolites. The proteomic analysis revealed 89 downregulated proteins in OBL KO, out of a total of 154, most of them related to cytoskeleton and energy metabolism. Also 59 identified proteins were unique in OBL 5-LO KO and 06 exclusively expressed in WT cells, revealing the intrinsic differences of each strain. The osteoclastogenic profile of WT vs. 5-LO KO showed significant differences in phenotypic analysis, TRAP and in the gene expression of cells derived from the monocyte-macrophage-lineage. After M-CSF and RANKL stimulation, WT cells showed multinucleated giant osteoclasts. However, 5-LO KO cells presented a population of cells with variable shapes and sizes, and a lower maturation stage. In addition, exogenous LTs did not modulate TRAP activity. The conditioned medium from OBL WT and 5-LO KO delayed the formation process of osteoclasts. Gene expression analysis in osteoclasts showed decreased expression of Alox 5, Il-1b, Il-6 and TNF in 5-LO KO cells. BLT1/2, CysLt1 and the osteoclast differentiation markers Acp5, Ctsk and Nfact1 showed no differences between the strains. In addition, LTB4 decreased the expression of Alox5, and IL-1b was increased in WT osteoclasts. Thus, the results demonstrate that the LTs are able to modulate the bone metabolism, and the absence of the 5-LO gene is related to the greater osteogenic profile.

Submitted by Sandro Camargo (sandro.camargo@unipampa.edu.br) on 2015-05-07T22:56:27Z No. of bitstreams: 1 126110041.pdf: 1662239 bytes, checksum: 4c1751ff15692d571713c45fca07289c (MD5) / Made available in DSpace on 2015-05-07T22:56:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 126110041.pdf: 1662239 bytes, checksum: 4c1751ff15692d571713c45fca07289c (MD5) Previous issue date: 2014-03-24 / Células tronco são células indiferenciadas e multipotentes, capazes de se diferenciar nos mais diversos tipos celulares. São definidas por duas características principais, a autorrenovação e o potencial de diferenciação. Devido ao seu potencial de diferenciação, facilidade de isolamento e expansão em cultura, as células tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cell – MSCs) são largamente utilizadas em testes para o tratamento de inúmeras doenças, como doenças cardíacas, mieloma e osteoartrite. O corticosteroide dexametasona é amplamente utilizado como indutor de diferenciação óssea em células tronco e está envolvido no aumento da atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP). Há quatro genes que codificam a ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 e ALPI. A ALPL é um dos principais marcadores de diferenciação óssea promovida pelo tratamento com dexametasona, esse gene possui três diferentes variantes que são geradas por splicing alternativo. Porém, até hoje não se tem conhecimento de qual dessas variantes atua na deposição de matriz óssea. O objetivo do trabalho foi analisar, por PCR quantitativo (qPCR), a atividade das variantes de ALPL durante a diferenciação de MSCs tratadas com dexametasona. Os primers das três variantes do gene ALPL foram desenhados pelo nosso grupo de pesquisa. Para o experimento, aproximadamente 3x10 4 células por mL foram semeadas em placa de cultura. Para o tratamento utilizou-se dexametasona 10 -7 M, tendo como período de tratamento 0, 3 e 7 dias. Os resultados da qPCR mostraram que os primers desenhados possuem uma eficiência superior a 90% e R 2 = 1, sendo os primers da variante 2 mais eficiente que os primers da variante 1, e os primers de ambas as variantes mais eficientes que os primers de ALP atualmente utilizados. Os primers da ALPL/v3 não apresentaram amplificação. Nossa análise estatística indica que a diferença de expressão entre as células tratadas e os controles se mostrou relevante, apontando para um grande aumento de ALPL/v1 nas células tratadas. A expressão de ALPL/v2, apesar de significativa entre os controles e tratados, é baixa quando comparada à ALPL/v1. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a dexametasona, além de aumentar a atividade do promotor de ALPL, também dá preferência ao splicing alternativo que origina o mRNA da variante 1 do gene. / Stem cells are undifferentiated and pluripotent cells that are able to differentiate into several cell types. Stem cells are distinguished from other cell types by two important characteristics: self-renewal and differentiation potential. Due to their differentiation potential and easiness for isolate and growth in vitro, mesenchymal stem cells (MSCs) are widely used in trials for the treatment of numerous diseases such as heart disease, myeloma and osteoarthritis. The corticosteroid dexamethasone is broadly used to induce bone differentiation in stem cells and is involved in the increased activity of alkaline phosphatase (ALPL). There are four genes coding ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 and ALPI. The ALPL is one of the main markers for bone differentiation stimulated by dexamethasone. This gene has three different variants which are generated by alternative splicing. However, to date it is not known which of these variants act in the bone matrix deposition. In this context, the aim of this work was to analyze the activity of ALPL variants during the differentiation of MSCs treated with dexamethasone. Primers for the three ALPL variants were designed by our group. For the experiment, approximately 3x10 4 cells per ml were seeded in culture plate. For treatment, we used 10 -7 M dexamethasone for 0, 3 and 7 days. The qPCR results showed that the primers designed had an amplification efficiency higher than 90% and R 2 = 1; variant 2 (V2) primers was more efficient than the variant 1 (V1) primers and primers of both variants are more efficient than the currently used ALP primers. The primers of ALPL/v3 showed no amplification. Our statistical data showed that the differences in expression between treated and control cells were significant, indicating an expressive increase of ALPL/v1 in treated cells. The expression of ALPL/v2, although significant between controls and treated cells, was low when compared to ALPL/v1. The results of this study indicate that dexamethasone, besides increasing the activity of the ALPL promoter, gives preference to alternative splicing that originates the variant1 mRNA.

A descoberta das células tronco adultas tornou possível a sua aplicação clínica em protocolos de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos para a reparação de órgãos danificados ou pouco funcionais. Neste sentido, são conhecidas muitas fontes diferentes de células tronco adultas, entre elas o tecido epitelial, o tecido muscular e a medula óssea. Recentemente, o tecido adiposo adulto foi reconhecido como uma fonte alternativa, acessível e rica em células tronco mesenquimais (MSCs), também denominadas de células tronco derivadas do tecido adiposo (hADSCs). As hADSCs são as células tronco adultas que apresentam a maior plasticidade, e são facilmente isoladas pela característica de aderência a substratos plásticos. Sob condições específicas de cultivo, as hADSCs podem diferenciar-se em células precursoras osteoblásticas. Dentre as proteínas necessárias para a diferenciação das hADSCs, o papel do complexo minichromosome maintenance (MCM) não é muito bem conhecido. A proteína MCM2 é parte do complexo MCM, fazendo parte do complexo pré-replicativo (pre-RC). Em células proliferativas, o gene MCM2 apresenta alta expressão, sendo que o seu produto gênico está relacionado com os mecanismos de reparação de DNA. Sendo assim, analisamos as mudanças na expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação das hADSCs em diferentes meios de cultura, contendo BMP-4 ou OM. Os genes relacionados com a osteodiferenciação, como osteocalcina (OC), osteopontina (OP) e fosfatase alcalina (ALP) foram analisados por RT-PCR, por PCR em tempo real e citoquímica. Os dados obtidos pelas técnicas citoquímicas e de biologia molecular indicaram uma diminuição da expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação, que pode estar relacionada com danos ao DNA ou senescência nas hADSCs. / The discovery of adult stem cells is a promise field in regenerative medicine and tissue engineering. There are many sources of adult stem cells among which of whom are the skin, muscle and bone marrow. Currently, the adipose tissue has been an alternative source of mesenchymal stem cells (MSCs), termed human adipose-derived stem cells (hADSCs). The MSCs are the most plastic adult stem cells known until now and are easily isolated by adherence in plastic substrates. Under specifics conditions of culture hADSCs can be differentiated in osteoblast cell precursors. Among proteins needed for hADSCs differentiation, the roles of minichromosome maintenance (MCM) complex remains poorly understood. The protein complex MCM2-7 is part of DNA pre-replicative complex (pre-RC), being abundant in proliferating cells and involved in DNA repair mechanisms. In this sense, the Mcm2 is essential for the activity of the MCM complex. Thus, we analysed MCM2 gene expression changes during osteoinduction by culturing hADSCs in different media containing BMP-4 or in osteogenic medium. Genes related to osteodifferentiation, like osteocalcin (OC), osteopontin (OP) and alkaline phosphatase (ALP) were analysed by molecular and cytochemistry approaches during osteodifferentiation. Interestingly, we observed a decrease in the MCM2 gene level osteoinduction of hADSCs in osteogenic medium, which could be related to an increase in genome damage and senescence in hADSCs.

A descoberta das células tronco adultas tornou possível a sua aplicação clínica em protocolos de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos para a reparação de órgãos danificados ou pouco funcionais. Neste sentido, são conhecidas muitas fontes diferentes de células tronco adultas, entre elas o tecido epitelial, o tecido muscular e a medula óssea. Recentemente, o tecido adiposo adulto foi reconhecido como uma fonte alternativa, acessível e rica em células tronco mesenquimais (MSCs), também denominadas de células tronco derivadas do tecido adiposo (hADSCs). As hADSCs são as células tronco adultas que apresentam a maior plasticidade, e são facilmente isoladas pela característica de aderência a substratos plásticos. Sob condições específicas de cultivo, as hADSCs podem diferenciar-se em células precursoras osteoblásticas. Dentre as proteínas necessárias para a diferenciação das hADSCs, o papel do complexo minichromosome maintenance (MCM) não é muito bem conhecido. A proteína MCM2 é parte do complexo MCM, fazendo parte do complexo pré-replicativo (pre-RC). Em células proliferativas, o gene MCM2 apresenta alta expressão, sendo que o seu produto gênico está relacionado com os mecanismos de reparação de DNA. Sendo assim, analisamos as mudanças na expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação das hADSCs em diferentes meios de cultura, contendo BMP-4 ou OM. Os genes relacionados com a osteodiferenciação, como osteocalcina (OC), osteopontina (OP) e fosfatase alcalina (ALP) foram analisados por RT-PCR, por PCR em tempo real e citoquímica. Os dados obtidos pelas técnicas citoquímicas e de biologia molecular indicaram uma diminuição da expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação, que pode estar relacionada com danos ao DNA ou senescência nas hADSCs. / The discovery of adult stem cells is a promise field in regenerative medicine and tissue engineering. There are many sources of adult stem cells among which of whom are the skin, muscle and bone marrow. Currently, the adipose tissue has been an alternative source of mesenchymal stem cells (MSCs), termed human adipose-derived stem cells (hADSCs). The MSCs are the most plastic adult stem cells known until now and are easily isolated by adherence in plastic substrates. Under specifics conditions of culture hADSCs can be differentiated in osteoblast cell precursors. Among proteins needed for hADSCs differentiation, the roles of minichromosome maintenance (MCM) complex remains poorly understood. The protein complex MCM2-7 is part of DNA pre-replicative complex (pre-RC), being abundant in proliferating cells and involved in DNA repair mechanisms. In this sense, the Mcm2 is essential for the activity of the MCM complex. Thus, we analysed MCM2 gene expression changes during osteoinduction by culturing hADSCs in different media containing BMP-4 or in osteogenic medium. Genes related to osteodifferentiation, like osteocalcin (OC), osteopontin (OP) and alkaline phosphatase (ALP) were analysed by molecular and cytochemistry approaches during osteodifferentiation. Interestingly, we observed a decrease in the MCM2 gene level osteoinduction of hADSCs in osteogenic medium, which could be related to an increase in genome damage and senescence in hADSCs.

A descoberta das células tronco adultas tornou possível a sua aplicação clínica em protocolos de medicina regenerativa e de engenharia de tecidos para a reparação de órgãos danificados ou pouco funcionais. Neste sentido, são conhecidas muitas fontes diferentes de células tronco adultas, entre elas o tecido epitelial, o tecido muscular e a medula óssea. Recentemente, o tecido adiposo adulto foi reconhecido como uma fonte alternativa, acessível e rica em células tronco mesenquimais (MSCs), também denominadas de células tronco derivadas do tecido adiposo (hADSCs). As hADSCs são as células tronco adultas que apresentam a maior plasticidade, e são facilmente isoladas pela característica de aderência a substratos plásticos. Sob condições específicas de cultivo, as hADSCs podem diferenciar-se em células precursoras osteoblásticas. Dentre as proteínas necessárias para a diferenciação das hADSCs, o papel do complexo minichromosome maintenance (MCM) não é muito bem conhecido. A proteína MCM2 é parte do complexo MCM, fazendo parte do complexo pré-replicativo (pre-RC). Em células proliferativas, o gene MCM2 apresenta alta expressão, sendo que o seu produto gênico está relacionado com os mecanismos de reparação de DNA. Sendo assim, analisamos as mudanças na expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação das hADSCs em diferentes meios de cultura, contendo BMP-4 ou OM. Os genes relacionados com a osteodiferenciação, como osteocalcina (OC), osteopontina (OP) e fosfatase alcalina (ALP) foram analisados por RT-PCR, por PCR em tempo real e citoquímica. Os dados obtidos pelas técnicas citoquímicas e de biologia molecular indicaram uma diminuição da expressão do gene MCM2 durante a osteodiferenciação, que pode estar relacionada com danos ao DNA ou senescência nas hADSCs. / The discovery of adult stem cells is a promise field in regenerative medicine and tissue engineering. There are many sources of adult stem cells among which of whom are the skin, muscle and bone marrow. Currently, the adipose tissue has been an alternative source of mesenchymal stem cells (MSCs), termed human adipose-derived stem cells (hADSCs). The MSCs are the most plastic adult stem cells known until now and are easily isolated by adherence in plastic substrates. Under specifics conditions of culture hADSCs can be differentiated in osteoblast cell precursors. Among proteins needed for hADSCs differentiation, the roles of minichromosome maintenance (MCM) complex remains poorly understood. The protein complex MCM2-7 is part of DNA pre-replicative complex (pre-RC), being abundant in proliferating cells and involved in DNA repair mechanisms. In this sense, the Mcm2 is essential for the activity of the MCM complex. Thus, we analysed MCM2 gene expression changes during osteoinduction by culturing hADSCs in different media containing BMP-4 or in osteogenic medium. Genes related to osteodifferentiation, like osteocalcin (OC), osteopontin (OP) and alkaline phosphatase (ALP) were analysed by molecular and cytochemistry approaches during osteodifferentiation. Interestingly, we observed a decrease in the MCM2 gene level osteoinduction of hADSCs in osteogenic medium, which could be related to an increase in genome damage and senescence in hADSCs.