Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:33Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3094_1.pdf: 1812433 bytes, checksum: 9e653e1c540a89a588becea9f2d123a8 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / As células-tronco são dotadas de capacidade de auto-renovação e diferenciação, que têm os tecidos adultos como uma de suas fontes. Essas células podem ser expandidas em cultura e dar origem a múltiplas linhagens. Dentre as células-tronco adultas, as mesenquimais ocupam posição de destaque, uma vez que são células multipotentes com capacidade de originar osteoblastos, adipócitos, condrócitos, neurônios e hepatócitos. Células-tronco mesenquimais derivadas de cordão umbilical são funcionalmente similares às derivadas de medula óssea (fonte clássica). Esse tecido apresenta-se como atraente fonte alternativa dessas células também por: existir em abundância, ser normalmente descartado pós-parto, além do procedimento para sua coleta não ser invasivo. No momento, a terapia celular representa grande esperança na medicina regenerativa devido à perspectiva de se reparar a perda de tecidos e/ou até mesmo órgãos nobres do corpo. As pesquisas com células-tronco ainda estão num estágio onde muitas questões científicas precisam ser resolvidas até suas aplicações se tornarem definitivas. Existem inúmeros métodos de isolamento dependendo tanto da origem do tecido, quanto dos procedimentos adotados pelos laboratórios. Neste trabalho analisamos a obtenção de células-tronco da geléia de Wharton de cordão umbilical humano através do método da migração espontânea . Todos os experimentos foram realizados de acordo com protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UFPE (n°.420/2007). O isolamento de células-tronco foi feito a partir da população primária de células mesenquimais. Utilizamos, para isso uma nova metodologia da seleção celular - imunomagnética columnfree conhecida como EasySep Magnet - EMA , no modo de seleção positiva pelo CD44 ou CD90. A eficácia do isolamento foi comprovada por citometria de fluxo (FACSCalibur). A mesma metodologia foi utilizada para detecção da expressão dos marcadores de superfície nas membranas citoplasmáticas das células (fenotipagem). A diferenciação osteogênica foi induzida durante três semanas com meio de cultura suplementado com indutores: ácido ascórbico, dexametasona e β-glicerofosfato. Observamos que as células primárias da migração espontânea (terceira passagem) mostraram presença até 70-80% de células positivas aos marcadores das células-tronco mesenquimais. Todavia, nas culturas das células selecionadas mais de 90% das células foram positivas para os marcadores das células-tronco mesenquimais (CD90+; CD44+; CD29+) e negativas para as de origem hematopoéticas (CD45-; CD34- e CD31-). O tempo de duplicação das células-tronco foi de 2-3 dias. As células tiveram morfologia fibroblastóide e possuíram potencial de diferenciação pronunciado. Especificamente, o estímulo osteogênico originou características osteoblásticas que foram comprovadas por coloração citohistoquímica (von Kossa) onde se observou o aparecimento de cristais de hidroxiapatita na matriz extracelular. Desta forma, estabelecemos que a migração espontânea é um método relativamente simples, que requer menos tempo de processamento e resulta em considerável quantidade das células com alto índice de marcadores específicos das células-tronco já na população primária obtida. A seleção positiva com partículas magnéticas é capaz de aumentar ainda mais a pureza das células-tronco isoladas de cordão umbilical humano

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:08Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3132_1.pdf: 3125724 bytes, checksum: 3bf874d76ef407eac106e41b1d8b6065 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco / Canais iônicos são proteínas integrais, formadoras de poros na membrana plasmática das células e são de extrema importância para as funções intra e extracelulares. Os poros ajudam no transporte rápido e seletivo dos íons, nutrientes e metabolitos pela membrana plasmática, portanto estão diretamente relacionados a diferentes funções no organismo como, transmissão sináptica, contração muscular, secreção hormonal, regulação do volume celular, proliferação celular e diferenciação. Podemos classificar os canais iônicos de acordo com seu principal estímulo para ativação: temos os canais ativados por ligantes intracelulares, canais ativados por ligantes extracelulares, canais de potássio e cloreto ativados por cálcio, canais sensíveis a ácidos e canais dependentes de voltagem (Na+, K+, Ca+ e Cl-). Os canais iônicos têm sido extensamente estudados, e novas informações vêm sendo acumuladas nos últimos anos, mostrando a importância da participação destes canais em processos relacionados à homeostase, como também sua contribuição na proliferação e diferenciação celular. Nesse trabalho procuramos identificar os níveis de RNAm em quatro tipos de canais iônicos, canal de potássio de alta condutância ativado por cálcio (MaxiK), canal aniônico dependente de voltagem (pl-VDAC), Canal de cloreto ativado por cálcio (CLCA1) e Canal de potássio dependente de voltagem (hEAG1) nas células-tronco mesenquimais de cordão umbilical, a partir da geléia de Wharton (hwCTMs), nas diferentes fases do ciclo (G0/G1, S e G2/M) e diferenciação celular (adipo- e osteogênica), visando contribuir no processo de terapia celular. O RNA total de hwCTMs foi extraído utilizando RNeasy mini kit (QIAGEN). O RNA transcrito em cDNA com superScript reverse (Invitrogen). PCR em Tempo Real foi realizada no ABI prisma 7500 (Applied Biosystems) usando supermix UDG (Invitrogen). Em acordo com os dados publicados, o estímulo osteogênico originou características osteoblásticas das células comprovadas por coloração histoquímica (alizarin red S) onde se observou o aparecimento células alongadas com presença de granulações escuras (cristais de hidroxiapatita) na matriz extracelular. A comprovação da diferenciação adipogênica foi feita por coloração histoquímica com oil red O, mostrando células com morfologia mais arredondada e presença de vacúolos de gordura. Estabelecemos que entre os quatro canais estudados, dois, CLCA1 e hEAG1, não se expressaram, enquanto a expressão dos MaxiK e pl-VDAC foi consideravelmente alto atingindo ~10% do valor de housekeeping gene Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Encontramos que a expressão dos MaxiK e pl-VDAC aumentaram durante a progressão do ciclo celular (G0/G1, S e G2/M) nas hwCTMs. Detectamos que a diferenciação muda a expressão dos canais MaxiK e pl-VDAC de maneira oposta: o canal MaxiK aumenta enquanto que o pl-VDAC diminui. Os dados ampliam o conhecimento sobre os tipos dos canais iônicos e o nível da expressão nas hwCTMs aumentando a compreensão da biologia de células-tronco mesenquimais

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo6489_1.pdf: 1208262 bytes, checksum: c1b40f981f11c014c773e3922d544d81 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A caracterização de canais iônicos em células tronco é importante pelo fato destas estruturas atuarem no controle da proliferação e diferenciação destas células. Há poucos trabalhos focados nos canais iônicos presentes nas membranas plasmáticas das células tronco e nenhum deles trata das células tronco mesenquimais da geléia de Wharton do cordão umbilical humano (whMSC). O cordão umbilical é uma fonte importante de células tronco para tão esperada terapia celular. Estes fatos motivaram o estudo dos canais iônicos das whMSC como objetivo maior do presente trabalho. Foi utilizada a técnica de patch-clamp na configuração whole-cell e a atuação de inibidores específicos para identificar os canais iônicos presentes nas whMSC. Os inibidores escolhidos foram: tetraetilamonio (TEA) e 4-aminopiridina (4-AP) como inibidores de canais de potássio dependentes de voltagem e de Ca2+, Glibenclamida (GB) um inibidor de canais de potássio dependentes de ATP, canais aniônicos dependentes de volume celular e CFTR e 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) ácido benzóico (NPPB) um potente bloqueador dos canais de cloreto, mas que também é capaz de bloquear os canais de potássio dependentes de Ca2+ de condutância intermediária. Os resultados mostraram que as correntes iônicas ativadas por voltagem das whMSC podem ser bloqueadas consideravelmente por TEA (10 mM), 4-AP (5 mM) e NPPB (100 μM) indicando a presença dos canais de K+ dependentes de voltagem e de Ca2+ e de canais de Cl- dependentes de voltagem conforme descrito para células tronco de outras origens. Utilizando GB (100 μM) observamos um aumento (estimulação) significativo da corrente. Este é um resultado inédito, pois estudos anteriores demonstram que o GB atua inibindo a corrente iônica transmembrana. Em todos os casos, com todos os inibidores testados, os efeitos foram reversíveis. Estes resultados demonstram que as membranas citoplasmáticas das whMSC possuem canais de K+ dependentes de voltagem e de Ca2+ e canais de Cl- dependentes de voltagem. O surpreendente efeito da glibenclamida indica a presença de canais iônicos desconhecidos nas membranas das whMSC