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Previous issue date: 2014-03-24 / Células tronco são células indiferenciadas e multipotentes, capazes de se diferenciar nos mais
diversos tipos celulares. São definidas por duas características principais, a autorrenovação e
o potencial de diferenciação. Devido ao seu potencial de diferenciação, facilidade de
isolamento e expansão em cultura, as células tronco mesenquimais (Mesenchymal Stem Cell
– MSCs) são largamente utilizadas em testes para o tratamento de inúmeras doenças, como
doenças cardíacas, mieloma e osteoartrite. O corticosteroide dexametasona é amplamente
utilizado como indutor de diferenciação óssea em células tronco e está envolvido no aumento
da atividade da enzima fosfatase alcalina (ALP). Há quatro genes que codificam a ALP:
ALPL, ALPP, ALPPL2 e ALPI. A ALPL é um dos principais marcadores de diferenciação
óssea promovida pelo tratamento com dexametasona, esse gene possui três diferentes
variantes que são geradas por splicing alternativo. Porém, até hoje não se tem conhecimento
de qual dessas variantes atua na deposição de matriz óssea. O objetivo do trabalho foi
analisar, por PCR quantitativo (qPCR), a atividade das variantes de ALPL durante a
diferenciação de MSCs tratadas com dexametasona. Os primers das três variantes do gene
ALPL foram desenhados pelo
nosso grupo de pesquisa. Para o experimento,
aproximadamente 3x10 4 células por mL foram semeadas em placa de cultura. Para o
tratamento utilizou-se dexametasona 10 -7 M, tendo como período de tratamento 0, 3 e 7 dias.
Os resultados da qPCR mostraram que os primers desenhados possuem uma eficiência
superior a 90% e R 2 = 1, sendo os primers da variante 2 mais eficiente que os primers da
variante 1, e os primers de ambas as variantes mais eficientes que os primers de ALP
atualmente utilizados. Os primers da ALPL/v3 não apresentaram amplificação. Nossa análise
estatística indica que a diferença de expressão entre as células tratadas e os controles se
mostrou relevante, apontando para um grande aumento de ALPL/v1 nas células tratadas. A
expressão de ALPL/v2, apesar de significativa entre os controles e tratados, é baixa quando
comparada à ALPL/v1. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que a dexametasona,
além de aumentar a atividade do promotor de ALPL, também dá preferência ao splicing
alternativo que origina o mRNA da variante 1 do gene. / Stem cells are undifferentiated and pluripotent cells that are able to differentiate into several
cell types. Stem cells are distinguished from other cell types by two important characteristics:
self-renewal and differentiation potential. Due to their differentiation potential and easiness
for isolate and growth in vitro, mesenchymal stem cells (MSCs) are widely used in trials for
the treatment of numerous diseases such as heart disease, myeloma and osteoarthritis. The
corticosteroid dexamethasone is broadly used to induce bone differentiation in stem cells and
is involved in the increased activity of alkaline phosphatase (ALPL). There are four genes
coding ALP: ALPL, ALPP, ALPPL2 and ALPI. The ALPL is one of the main markers for
bone differentiation stimulated by dexamethasone. This gene has three different variants
which are generated by alternative splicing. However, to date it is not known which of these
variants act in the bone matrix deposition. In this context, the aim of this work was to analyze
the activity of ALPL variants during the differentiation of MSCs treated with dexamethasone.
Primers for the three ALPL variants were designed by our group. For the experiment,
approximately 3x10 4 cells per ml were seeded in culture plate. For treatment, we used 10 -7 M
dexamethasone for 0, 3 and 7 days. The qPCR results showed that the primers designed had
an amplification efficiency higher than 90% and R 2 = 1; variant 2 (V2) primers was more
efficient than the variant 1 (V1) primers and primers of both variants are more efficient than
the currently used ALP primers. The primers of ALPL/v3 showed no amplification. Our
statistical data showed that the differences in expression between treated and control cells
were significant, indicating an expressive increase of ALPL/v1 in treated cells. The
expression of ALPL/v2, although significant between controls and treated cells, was low
when compared to ALPL/v1. The results of this study indicate that dexamethasone, besides
increasing the activity of the ALPL promoter, gives preference to alternative splicing that
originates the variant1 mRNA.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:10.1.0.46:riu/215 |
| Date | 24 March 2014 |
| Creators | Kercher, Dione Larissa |
| Contributors | Cañedo, Andrés Delgado |
| Publisher | Universidade Federal do Pampa |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UNIPAMPA, instname:Universidade Federal do Pampa, instacron:UNIPAMPA |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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