Em 2015, de acordo com a Organização Mundial da Saúde, o total de mortes na população humana foi de 52,5 milhões de pessoas, em que as doenças infecciosas mais especificamente, infecções respiratórias - aparecem em terceiro lugar no ranking de causas de morte. No total foram 3,5 milhões de mortes ou 6,7% do total, demonstrando um aumento significativo quando comparado com a pesquisa anterior, realizada em 2011, na qual as doenças infecciosas foram responsáveis por 3,2 milhões ou 5,9% do total. Das doenças infecciosas, podemos destacar a Malária, HIV/AIDS, Hepatite, Tuberculose - que aparece em 8º lugar neste mesmo ranking, e a Hanseníase - que é uma importante preocupação no Brasil. A tuberculose, causada pelo Mycobacterium tuberculosis sendo uma das principais causas de morte por doenças infecciosas na população humana, já apresenta cepas resistentes ao tratamento denominadas Cepas multirresistentes (MDR) e Cepas extremamente resistentes (XDR). Enquanto que a hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, apesar de não ser letal, causa a invalidez dos portadores e o Brasil possui o segundo maior número de casos desta doença. Outro patógeno de importância médica é a Pseudomonas aeruginosa que causa sérias doenças em pacientes com baixa imunidade, principalmente aqueles em hospitais em especial, pacientes com queimaduras. A via do Folato tem despertado a atenção das indústrias farmacêuticas para o desenvolvimento de novos fármacos, uma vez que está via oferece seletividade para estes novos inibidores. Isso se deve ao fato de que o tetrahidrofolato é um componente essencial para os organismos procariotos, e apenas eles, precisam realizar a produção de novo desta substância, enquanto que os eucariotos, o adquirem através da alimentação. Entretanto, o surgimento de cepas resistentes não só reforça a necessidade do desenvolvimento de novos fármacos, mas também a compreensão dos mecanismos de resistências destas cepas. O presente trabalho tem como objetivo obter informações biofísicas e estruturais de três enzimas da via do folato, a 7,8 dihidroneopterina aldolase, dihidropteroato sintase e dihidrofolato redutase. Além disso, esse trabalho teve como objetivo a compreensão do mecanismo de resistência através da indução de mutações nos códons 53 e 55 na enzima dihidropteroato sintase (DHPS), caracterização estrutural preliminar da enzima DHNA e estudos estruturais da enzima DHFR em complexo com cicloguanil. Assim, neste trabalho foi realizado a clonagem gênica da região codificando do gene para a enzima DHNA e expressão da proteína recombinante, purificada e utilizada em ensaios biofísicos. Além disso a mutagênese sítio dirigida foi feita com o intuito de se produzir DHPSs mutantes (T70S e P72R), na qual foram utilizadas nos ensaios de ITC, fluorescência, e cristalização, o que possibilitou demonstrar que a resistência de M. leprae às sulfas pode ser devido a troca de uma prolina por uma arginina na posição 72. Por fim, para DHFR, foi possível obter sua estrutura em complexo com cicloguanil que possibilitou avaliar as diferenças estruturais entre a forma aberta e fechada desta enzima. Além disso, confirmamos que o grupo nicotidamida tem essencial importância para a interação com os ligantes. / In 2015, according to the World Health Organization, the total number of deaths in the human population was 52.5 million people, in which infectious diseases - specifically, respiratory infections - appear third in the ranking of causes of death. In total, 3.5 million deaths or 6.7% of the total occurred, showing a significant increase when compared to the previous survey conducted in 2011, in which infectious diseases accounted for 3.2 million or 5.9% of the total total. Of the infectious diseases, we can highlight Malaria, HIV / AIDS, Hepatitis, Tuberculosis - which appears in 8th place in this same ranking, and Leprosy - which is an important concern in Brazil. Tuberculosis, caused by Mycobacterium tuberculosis is one of the main causes of death due to infectious diseases in the human population, and already presents resistant strains to the treatment - denominated multiresistant strains (MDR) and extremely resistant strains (XDR). While leprosy, caused by Mycobacterium leprae, despite not lethal, causes the invalidity of patients and Brazil has the second largest number of cases for this disease. Another pathogen of medical importance is Pseudomonas aeruginosa, which causes serious illness in patients with low immunity, especially those in hospitals - especially patients with burns. The Folate pathway has brought the attention of the pharmaceutical industries to the development of new drugs, since this pathway offers selectivity for these new inhibitors. This is since Tetrahydrofolate is an essential component for prokaryote organisms, and only they, need to perform the new production of this cofactor, while Eukaryotes acquire it through food. However, the emergence of resistant strains, not only reinforces the need for the development of new drugs, but also the understanding of the mechanisms of resistance of these strains. The aim of the present work was to obtain biophysical and structural information of three folate pathway enzymes, 7,8 dihydroneopterin aldolase, Dihydropteroate synthase and Dihydrofolate reductase. In addition, this work aimed to understand the mechanism of resistance through the induction of mutations at the codons 53 and 55 in the enzyme dihydropteroate synthase (DHPS), preliminary structurally characterize the DHNA enzyme and structurally study the enzyme DHFR in complex with cycloguanil. Thus, the cloning of the coding region of the gene for DHNA and the expression of the recombinant protein, purification and biophysical characterization were performed in this work. In addition, site-directed mutagenesis was performed aiming of producing mutant DHPSs (T70S and P72R), which were used in ITC, fluorescence, and crystallization tests to demonstrate that M. lepreae resistance to sulfas may be due to the exchange of a proline to an arginine at position 72. Finally, for DHFR, it was possible to obtain its structure in complex with cycloguanil which made it possible to evaluate the structural differences between the open and closed conformation of this enzyme. In addition, we have confirmed that the nicotidamide group has a crucial importance for interaction with the ligands.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-06062018-140141 |
| Date | 05 February 2018 |
| Creators | Giudice, João Henrique Pimenta |
| Contributors | Dias, Marcio Vinícius Bertacine |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Reter o conteúdo por motivos de patente, publicação e/ou direitos autoriais. |
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