Estudos clínicos tem mostrado resultados satisfatórios na aplicação da matriz derivada de esmalte (MDE) nas superfícies radiculares. Porém, a completa regeneração de todos os tecidos periodontais perdidos permanece como um desafio. Na tentativa de alcançar esse objetivo o uso de células tronco mesenquimais derivadas de medula óssea (CTM-MO) em um veículo apropriado na engenharia tecidual vem sendo bastante estudada. Uma interessante aplicação da MDE seria como um mediador biológico específico para CTMMO no intuito de promover a diferenciação e proliferação celular e auxiliar nos processos de regeneração periodontal. Sendo assim, o objetivo do presente estudo é avaliar a influência do Emdogain (EMD) e seu veículo alginato de propileno glicol (APG) na proliferação, diferenciação e mineralização de CTM-MO CD 45-90+. Células estromais de medula óssea (CE-MO) foram coletadas da crista ilíaca de ratos Wistar-Kyoto, isoladas pelo método Ficoll e separadas em CTM-MO CD 45-90+ por citometria de fluxo. A caracterização dessas células como células tronco se deu por meio de análise da presença de marcadores de células tronco (gene REX-1 e antígeno de superfície CD 90), habilidade de formação de colônias e capacidade de expressar fenótipo osteogênico e adipogênico. Após a caracterização, as CTM-MO CD 45-90+ foram plaqueadas com um dos seguintes tratamentos: Grupo Controle Positivo - meio contendo 10% de soro fetal bovino (SFB); Grupo Controle Negativo - meio contendo 2% de SFB; Grupo APG meio contendo 2% de SFB associado a 25 μg/ml de APG; Grupo EMD meio contendo 2% de SFB associado a 25 μg/ml de EMD. A avaliação da proliferação celular foi realizada por ensaio de MTT em 3, 7, 10 e 14 dias. Após diferenciação osteoblástica, a atividade de fosfatase alcalina (ALP) e a avaliação da capacidade de diferenciação celular feita por análise genética (PCR) dos genes osterix (OSX), osteopontina (OPN), ALP e RUNX2 foram mensuradas em 7, 10 e 14 dias. A mineralização de matriz extracelular foi avaliada qualitativamente por meio de ensaios de Von Kossa e Alizarina Red e quantitativamente pela mensuração do teor de cálcio. CTM-MO CD 45-90+ apresentaram maior expressão de REX-1, maior quantidade de antígeno de superfície CD 90, e mais unidades formadoras de colônia do que CE-MO. Além disso, foram capazes de expressar fenótipos osteoblástico e adipogênico. EMD e APG não influenciaram a proliferação de CTM-MO CD 45-90+. A atividade de ALP não foi influenciada pelo EMD e foi reduzida no grupo APG. Ambos EMD e APG não influenciaram a expressão dos genes OSX e RUNX2 em 7 e 10 dias e reduziram em 14 dias. O EMD não influenciou a expressão gênica de ALP e OPN, mas a presença do gel de alginato de propileno glicol pareceu prover melhores resultados, com maiores expressões de OPN e ALP. Os grupo EMD e APG apresentaram menor mineralização de matriz extracelular em 28 dias comparados aos grupos controles. Conclui-se que o EMD não influenciou a proliferação, atividade de ALP e diferenciação de CTM-MO CD 45-90+, mas a presença do gel (APG) parece otimizar a diferenciação dessas células. Ambos, APG e EMD reduziram a mineralização de matriz extracelular. / Clinical studies have shown satisfactory results in the application of the enamel matrix derivate (EMD) on root surfaces. However, the complete regeneration of all lost periodontal tissues remains a challenge. To achieve this aim the use of bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs) in an appropriate vehicle in tissue engineering has been extensively studied. An interesting application of the EMD would be like a specific biological agent for BM-MSCs in order to promote cell differentiation and proliferation and assist in periodontal regeneration processes. Therefore, the aim of this study is evaluate the influence of Emdogain (EMD) and its vehicle (Propylene Glycol Alginate - PGA) in proliferation, differentiation and mineralization of CD 45-90+ bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs). Rat bone marrow stromal cells (BMSCs) were colleted from iliac crest of rat Wistar-Kyoto, isolated by Ficoll method and separated into CD 45-90+ BM-MSCs by flow cytometer. For cellular characterization the presence of stem cells markers (Rex-1 gen and surface antigen CD 90), capacity to form colonies (CFU) and to express osteoblast and adipogenic phenotype was assessed. Four experimental groups was plated with CD 45-90+ BM-MSCs: Positive Control group: media containing 10% of fetal bovine serum (FBS); (2) Negative Control Group: media containing 2% FBS; (3) EMD Group: 25 μg/ml EMD in 2% FBS media; (4) PGA Group: 25 μg/ml PGA in 2% FBS media. Cellular proliferation was assed in 3, 7, 10 and 14 days with MTT assay. After osteogenic induction, alkaline phosphatase (ALP) activity and gene expression of osterix (OSX), osteopontin (OPN), ALP and RUNX2 by RT-PCR was assessed at 7, 10 and 14 days. Extracellular matrix mineralization was evaluated at 21 and 28 days qualitatively by Von-kossa and Alizarina Red staining, and quantitatively by calcium content. CD 45-90+ BM-MSCs presented higher Rex-1 gen expression, more surface antigen CD 90 and more CFU/well than BMSCs, and expressed osteoblast and adipogenic phenotype. EMD and PGA not influenced proliferation of CD45-90+ BM13 MSCs. ALP activity was not influenced by EMD and was reduced in PGA group. EMD and PGA not influenced expression of OSX and RUNX2 in 7 and 10 days and reduced in 14 days. EMD not influenced ALP and OPN expression, but the presence of the gel provided better results, with higher expressions of ALP and OPN genes. Both PGA and EMD groups presented less mineralized ECM in 28 days. It concludes that EMD not influenced the proliferation, differentiation and ALP activity of CD 45-90+ BM-MSCs, but the presence of the gel (PGA) seems optimize the differentiation of these cells. Both reduced ECM mineralization.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-12072016-161505 |
| Date | 21 June 2016 |
| Creators | Costa, Camila Alves |
| Contributors | Bulle, Daniela Bazan Palioto |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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