Este trabalho teve como objetivo estudar a permeabilização celular de Candida guilliermondii FTI 20037 empregando processos químicos (agentes tensoativos) e físicos (congelamento-descongelamento) e verificar o potencial uso das células permeabilizadas na redução de xilose em xilitol. Os ensaios de permeabilização empregaram suspensão celular de 2 g/L, temperatura de 30ºC e pH 7. Para os processos químicos foram avaliados CTAB (Brometo de cetiltrimetilamônio) e Triton X-100 e os ensaios foram realizados empregando metodologia do planejamento experimental. O monitoramento da permeabilidade celular foi realizado através da dosagem in situ e no sobrenadante da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD), selecionada como marcador do tratamento. As enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XD) também foram dosadas. A permeabilização de C. guilliermondii com CTAB permitiu a dosagem in situ de G6PD e XD, mas não de XR. As três enzimas avaliadas não foram detectadas no sobrenadante. As condições que promoveram máxima permeabilidade celular (0,41 mM de CTAB, 200 rpm de agitação e 50 min de tempo de contato) resultaram em níveis in situ de G6PD de 283,4 ± 60,7 U/L e 122,4 ± 15,7 U/gcélulas. Nestas condições de tratamento, o CTAB influenciou negativamente a atividade catalítica de G6PD, XR e XD presentes no homogenato das células rompidas (não tratadas). O estudo de permeabilização celular com Triton X-100 mostrou que o tensoativo foi pouco efetivo, permitindo a dosagem in situ apenas da G6PD. As condições que promoveram máxima permeabilidade celular, ou seja, 2,78 mM de Triton X-100, 200 rpm de agitação e 50 min de tempo de contato, resultaram em níveis in situ de G6PD de 44,7 ± 0,0 U/L e 16,9 ± 0,0 U/gcélulas. Nestas condições, Triton X-100 não afetou a atividade catalítica de G6PD, XR e XD presentes no homogenato das células rompidas (não tratadas). O processo físico de permeabilização consistiu no congelamento da suspensão celular (-18ºC) por período de 48h, seguido do descongelamento em banho-maria (30ºC). Este tratamento permitiu a dosagem in situ das enzimas G6PD (108,7 ± 3,8 U/L e 54,3 ± 1,9 U/ gcélulas) e XR (26,4 ± 0,1U/L e 13,2 ± 0,1 U/gcélulas), mas não da XD. O tratamento não foi suficiente para liberar G6PD, no entanto, cerca de 60% da atividade total de XR foi detectada no sobrenadante (47,1 ± 0,4 U/L e 23,6 ± 0,2 U/gcélulas). Os ensaios de biotransformação mostraram que, nas condições avaliadas, a conversão de xilose em xilitol foi dependente do tipo de tratamento de permeabilização do biocatalisador. Os ensaios de cultivo mostraram que o tratamento das células com Triton X-100 não foi suficiente para causar perda de viabilidade e atividade metabólica de C. guilliermondii, enquanto o congelamento-descongelamento promoveu perda parcial da viabilidade celular. O tratamento das células com CTAB foi mais agressivo, causando a perda total de viabilidade celular. Foi também verificado que resting cells (células em estado de repouso) de C. guilliermondii sem tratamento e permeabilizadas com Triton X-100 foram capazes de converter xilose em xilitol com rendimento de ~60%, após 10 h de reação. Com o presente trabalho pode se concluir que os métodos estudados podem ser especialmente úteis para a determinação in situ de G6PD. Além disto, a utilização de células permeabilizadas pode ajudar a superar os problemas/custos associados com a extração e purificação das enzimas e conseqüentemente contribuírem para o desenvolvimento de uma tecnologia de baixo custo para a produção de xilitol. / This work describes the effect of the surfactants (CTAB and Triton X-100) and freezing-thawing treatment on the permeabilization of C. guilliermondii cells. The potential use of these cells (unpermeabilized and permeabilized by CTAB, Triton X-100 and freezing-thawing treatment) was also evaluated. Response surface methodology was used to investigate the effect of different parameters (detergent concentration, agitation and treatment time) on the permeabilization of C. guilliermondii cells. The experimentation was aimed to find the values of process variables to achieve maximal glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) activity in situ. The intracellular G6PD of the C. guilliermondii could not be detected in intact (unpermeabilized) whole cells. However, on treatment of C.guilliermondii with detergents (CTAB and Triton X-100) and freeze-thawing, the G6PD activity could be measured.The effectiveness of detergent permeabilization of C.guilliermondii cells was dependent on its concentration and exposure time. Maximum permeabilization, measured in terms of assayable G6PD activity in situ, was obtained when the cells were treated with CTAB. Triton X-100 and freeze-thawing were also found to permeabilize the cells, but to a lesser degree than CTAB. The optimum operating conditions for permeabilization process were 0.41 mM (CTAB) or 2.78 mM (Triton X-100) under agitation of 200 rpm at 30ºC temperature and process duration of 50 min and pH 7. At these conditions of process variables, the maximum value of enzyme activity was found to be 283.4 ± 60.7 U/L (122.4 ± 15.7 U/gcells) and 44.7 ± 0.0 U/L (16.9 ± 0.0 U/gcells) for permeabilized cells with CTAB and Triton X-100, respectively. The Triton X-100 was not enough to cause loss of viability and metabolic activity of C. guilliermondii. Freezing-thawing treatment promoted partial loss of cell viability. On the other hand the cells treated with CTAB were totally affected. The biotransformation of xylose to xylitol was studied by employing C. gulliermondii FTI 20037 in two different forms namely unpermeabilized cells and permeabilized cells. The maximum xylitol yield of about 60% was observed with unpermeabilized yeast cells and Triton X-100 permeabilized cells after 10 h of reaction time. In conclusion, surfactants and freezing-thawing treatment provides a simple and mild procedure for C.guilliermondii permeabilization. The method may be especially useful for the in situ determination of G6PD. Response surface methodology was found effective in optimizing and determining the interactions among process variables for the permeabilization process. The use of permeabilized cells can help to overcome the problems/costs associated with enzyme extraction and purification from yeast cells and in the development of a low-cost technology for xylitol production.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-26092012-164832 |
| Date | 16 April 2010 |
| Creators | Cortez, Daniela Vieira |
| Contributors | Roberto, Inês Conceição |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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