The major aim of this work was the identification of new phloem sap proteins and a metabolic characterisation of this transport fluid. The experiments were performed on the three plant species <i>C. sativus</i>, <i>C. maxima</i> and <i>B. napus</i>. To characterise the phloem samples from <i>B. napus</i>, a new model plant for phloem analysis, western blot tests together with metabolite profiling were performed. GC-MS metabolite profiling and enzyme assays were used for measuring metabolites in the phloem of B. napus. Results from the phloem sap measurements showed, as expected, a typical sugar distribution for apoplasmic phloem loaders with sucrose being the predominant sugar. In stem extracts, the most abundant sugar was glucose with much lower fructose and sucrose levels. With the GC-MS approach it was possible to identify a number of metabolites which showed a differential distribution when phloem and stem tissue extracts were compared. For protein identification, two different approaches were employed (i) screening expression libraries with total phloem protein specific antisera and (ii) protein separation on 2 DE gels followed by ESI-MS/MS sequence analyses. For the first approach, three different phloem protein-specific antisera were produced and expression libraries were constructed. Phloem protein antisera were tested for specificity and some attempts to estimate specific epitopes were undertaken. Screening of the libraries resulted in the identification of 14 different proteins from all investigated species. Analyses of <i>B. napus</i> phloem sap proteins from 2 DE with ESI-MS/MS resulted in the identification of 5 different proteins. The phloem localisation of the identified proteins was additionally confirmed by western blot tests using specific antibodies. In order to functionally characterise some selected phloem proteins from <i>B. napus</i>, the group of potential calcium-binding polypeptides was analysed for functional Ca<sup>+2</sup> binding properties and several Ca<sup>+2</sup>–binding proteins could be isolated. However, their sequences could as yet not be determined. Another approach used for functional protein characterisation was the analysis of <i>Arabidopsis</i> T-DNA insertion mutants. Four available mutants with insertions in phloem protein-specific genes were chosen from the SALK and GABI-Kat collections and selected homozygous lines were tested for the presence of the investigated proteins. In order to verify if the product of one of the mutated gene (GRP 7) is transported through the phloem, grafting experiments were performed followed by western blot analyses. Although the employed antiserum against GRP 7 protein did not allow distinguishing between the mutant and the wild type plants, successful <i>Arabidopsis</i> grafting could be established as a promising method for further studies on protein translocation through the phloem. / Das Hauptziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung neuer Phloemsaftproteine sowie die metabolische Charakterisierung dieser Transportflüssigkeit. Die beschriebenen Experimente wurden an den vier Pflanzenarten <i>Cucumis sativus</i>, <i>Curcurbita maxima</i>, <i>Brassica napus</i> und <i>Arabidopsis thaliana</i> durchgeführt. Für die Analyse von Phloemsaftproteinen aus <i>B. napus</i> war zunächst wichtig, die Herkunft und Reinheit der gewonnenen Phloemproben mittels Western Blot Analysen, Bestimmungen der Zuckerkonzentration und einer metabolischen Charakterisierung mittels GC-MS zu überprüfen. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigten erwartungsgemäß die typische Zuckerzusammensetzung für apoplastische Phloembelader, mit Saccharose als vorherrschendem Zucker. In Stängelextrakten war dagegen Glukose der vorherrschende Zucker, wogegen Fruktose und Saccharose in wesentlich geringeren Mengen nachweisbar waren. Mit diesem GS-MS Ansatz war es möglich eine Vielzahl von Metaboliten zu identifizieren, die eine differentielle Verteilung in Phloemsaft und Stängelextrakt aufweisen. Ein Versuchsansatz zur Proteinanalyse war es Gene, welche Phloemproteine kodieren, zu klonieren. Zu diesem Zweck wurden Expressionsbibliotheken von <i>C. maxima</i>, <i>C. sativus</i> und <i>B. napus</i> konstruiert und anschließend mittels Phloemprotein-spezifischen Antiseren der entsprechenden Arten durchforstet. Des Weiteren wurden die Antiseren auf ihre Spezifität getestet und es wurden Versuche durchgeführt, um mögliche spezifische Epitope zu identifizieren. Die Durchforstung der Expressionsbibliotheken führte zur Identifizierung von 14 verschiedenen Proteinen aus den drei untersuchten Pflanzenarten. Im Rahmen einer umfassenden Charakterisierung des Phloemproteoms von <i>B. napus</i> mittels zwei-dimensionaler Gelelektorphorese (2 DE) und anschließender Massenspektrometrie (ESI-MS/MS), wurden insgesamt 5 neue Phloemproteine identifiziert. Die Lokalisierung dieser Proteine im Phloem wurde zusätzlich mittels Western Blot Analysen unter Verwendung spezifischer Antikörper verifiziert. Die funktionelle Analyse einiger dieser neu identifizierten Proteine wurde unter Zuhilfenahme von „knock-out“ Mutanten der Modelpflanze <i>Arabidopsis thaliana</i> begonnen. Das vorrangige Ziel dabei war, zu überprüfen, ob die ausgewählten Proteine tatsächlich im Phloem transportiert werden. Dazu wurden so genannte Pfropfungsversuche durchgeführt. Vier <i>Arabidopsis</i> Mutanten, die Insertionen in Phloemprotein-spezifischen Genen aufweisen wurden aus der SALK bzw. aus der GABI-KAT Sammlung ausgewählt und die selektierten, homozygoten Linien auf die Anwesenheit der entsprechenden Proteine hin untersucht. Um letztendlich den Transport eines der mutierten Genprodukte zu verifizieren (GRP 7), wurden Pfropfungsversuche mit anschließender Western Blot Analyse durchgeführt. Obwohl das entwickelte Antiserum gegen GRP 7 es nicht erlaubte zwischen mutierten und Wildtyp Pflanzen zu unterscheiden, konnte doch die Pfropfung von <i>Arabidopsis</i> Pflanzen erfolgreich etabliert werden. Somit steht nun eine Erfolg versprechende Methode zur Verfügung, um den Proteintransport durch das Phloem zu untersuchen. Eine weitere Gruppe von Phloemproteinen aus <i>B. napus</i>, solche mit einer potentiellen Calcium-bindenden Domäne, wurden ebenfalls funktionell auf mögliche Ca<sup>2+</sup>-bindende Eigenschaften hin untersucht, dabei konnten einige Ca<sup>2+</sup>–bindende Proteine isoliert werden, deren Sequenz bislang jedoch noch unbekannt ist.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:Potsdam/oai:kobv.de-opus-ubp:693 |
| Date | January 2005 |
| Creators | Kolasa, Anna |
| Publisher | Universität Potsdam, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät. Institut für Biochemie und Biologie |
| Source Sets | Potsdam University |
| Language | English |
| Detected Language | German |
| Type | Text.Thesis.Doctoral |
| Format | application/pdf |
| Rights | http://opus.kobv.de/ubp/doku/urheberrecht.php |
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