L'anémie de Fanconi (AF), causée par les mutations de 22 gènes de l'AF (FANCA-FANCW), est une maladie rare associée à une instabilité du génome. Cette maladie est caractérisée par un large éventail de phénotypes cliniques, notamment des anomalies congénitales, une insuffisance progressive de la moelle osseuse, une susceptibilité au cancer, ainsi qu'une hypersensibilité aux agents causant des pontages inter-brins (ICLs) de l'ADN. Plusieurs modèles de souris ont été produits pour étudier l'AF. Cependant, la manifestation la plus répandue chez les patients AF, soit l'insuffisance médullaire progressive, est à peine retrouvée dans ces modèles. Le formaldéhyde, l'aldéhyde le plus simple, existe dans l'environnement et dans nos corps. En fait, nos corps libèrent une concentration relativement élevée de formaldéhyde. Le formaldéhyde peut entraîner des ICLs et des pontages ADN-protéine (DPCs), qui nuisent à la stabilité du génome. Des modèles de souris ont été créés afin d'identifier si une augmentation du niveau de formaldéhyde contribuait à une insuffisance médullaire ou une leucémie comme chez les patients AF. Les souris portant une double inactivation Fancd2⁻/⁻ Aldh⁻/⁻ainsi que Fancd2⁻/⁻ Adh5⁻/⁻ , permettant l'accumulation d'aldéhydes, ont mis en lumière l'importance potentielle des aldéhydes, en particulier le formaldéhyde, sur l'apparition de l'AF. Le principal objectif de mon doctorat est d'étudier le mécanisme de réponse cellulaire aux dommages de l'ADN induits par le formaldéhyde en essayant d'identifier une cible thérapeutique potentielle pour les patients atteints d'AF. Afin d'identifier tous les gènes susceptibles d'être impliqués dans la réponse aux dommages de l'ADN induits par le formaldéhyde, nous avons effectué un criblage CRISPR-Cas9 à l'aide de la librairie TKOv1 qui cible plus de 17000 gènes humains. Nous avons identifié plusieurs gènes appartenant soit à la voie AF, à la voie de réparation par excision des nucléotides (NER) ou à la voie du métabolisme du formaldéhyde, qui sont capable d'enrayer les dommages induits par le formaldéhyde confirmant la validité de notre criblage. Fait intéressant, l'exonucléase 1 (EXO1), une nucléase qui participe à la fois aux processus réplicatifs et post-réplicatifs, s'est avérée une cible majeure. Nous avons donc caractérisé les rôles d'EXO1 dans la réponse aux dommages à l'ADN induits par le formaldéhyde tant au niveau des ICLs que DPCs. Nous avons effectué un deuxième criblage CRISPR-Cas9 en utilisant la librairie TKOv3 qui cible environ 18000 gènes dans les lignées cellulaires déficientes en FANCA. Notre objectif pour le deuxième crible est d'identifier les gènes qui pourraient devenir des cibles de traitement thérapeutique. L'inactivation de ces gènes ou l'inhibition des protéines correspondantes pourraient aider les cellules AF ou les patients AF à mieux survivre une exposition au formaldéhyde. Nous validons et caractérisons actuellement les candidats probables de ce ciblage. En résumé, cette thèse élucide le rôle d'EXO1 dans les dommages induits par le formaldéhyde et identifie des cibles diagnostiques et thérapeutiques potentielles pour les patients AF. / Fanconi anemia (FA), caused by the mutations of 22 FA genes (FANCA-FANCW), is a rare, genome instability associated disease. FA is characterized by a wide range of clinical phenotypes including congenital abnormalities, progressive bone marrow failure, cancer susceptibility and hypersensitivity to DNA inter-strand crosslinks (ICLs). Several mouse models have been produced to study FA. However, progressive bone marrow failure, the most prevalent manifestation in FA patients, is hardly recaptured in FA mouse models. Formaldehyde, the simplest aldehyde, exists in the environment and in our bodies. In fact, our bodies release a relatively high concentration of formaldehyde. Formaldehyde can cause ICLs and DNA-protein crosslinks (DPCs), which impair genome stability. Mouse models have been created in order to identify whether increased formaldehyde levels contribute to bone marrow failure or leukemia as in FA patients. Fancd2⁻/⁻ Aldh2⁻/⁻as well as Fancd2⁻/⁻ Adh5⁻/⁻ double inactivation mouse models allowing for aldehyde accumulation highlighted the potential importance of aldehydes, in particular formaldehyde, on the development of FA. The main objective of my Ph.D. is to study the mechanism of cellular response to formaldehyde-induced DNA damage to identify a potential therapeutic target for FA patients. To gain insights into deciphering which genes may be involved in responding to formaldehyde-induced DNA damage, we carried out a CRISPR-Cas9 screen using the TKOv1 library that targets more than 17000 genes. Our results were validated by the identification of several genes that belong to the FA pathway, the nucleotide excision repair (NER) pathway, or the formaldehyde metabolism pathway, which have been shown to cope with formaldehyde-induced damages or formaldehyde directly. Interestingly, exonuclease 1 (EXO1), a nuclease that participates in both replicative and post-replicative processes, was found to be a major target. Therefore, we characterized the roles of EXO1 in response to formaldehyde-induced DNA damage in both ICLs and DPCs. We also performed a second CRISPR-Cas9 screen using the TKOv3 library targeting around 18000 genes in FANCA-deficient cell lines. Our aim for the second screen is to identify genes that could become actionable therapeutic targets. The knockout of these genes or the inhibition of corresponding proteins could help FA cells or FA patients survive better under the exposure to formaldehyde. We are currently validating and characterizing the possible candidates. In summary, this thesis elucidates the role of EXO1 in formaldehyde-induced DNA damage and identifies potential diagnostic and therapeutic targets for FA patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LAVAL/oai:corpus.ulaval.ca:20.500.11794/147023 |
| Date | 25 July 2024 |
| Creators | Gao, Yuandi |
| Contributors | Masson, Jean-Yves |
| Source Sets | Université Laval |
| Language | English |
| Detected Language | French |
| Type | COAR1_1::Texte::Thèse::Thèse de doctorat |
| Format | 1 ressource en ligne (xx, 299 pages), application/pdf |
| Rights | http://purl.org/coar/access_right/c_abf2 |
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