A citricultura é de extrema importância para a economia do Estado de São Paulo. O cancro cítrico, causado pela bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), é um grave problema nesse setor, causando inúmeros prejuízos à produção de frutos e seus derivados. Nosso objetivo principal foi o estudo das interações proteína-proteína que ocorrem em Xac. Com este intuito, utilizamos como principal ferramenta, o sistema duplo-híbrido em leveduras, baseado nos domínios ativador e de ligação da proteína Gal4. Estivemos particularmente interessados em proteínas pertencentes aos Sistemas de dois-componentes, devido à sua importância em mecanismos de sinalização celular. A complexidade desses sistemas tornou a análise genômica comparativa de grande valor para estudos das vias de sinalização que podem levar a bactéria a colonizar o hospedeiro. Xac possui 37 histidina cinases (HKs) e 60 reguladores de resposta (RRs) além de 21 proteínas híbridas contendo ambos os domínios. Nossos resultados mostraram interações específicas entre várias proteínas desse sistema dentre as quais destacamos algumas HKs e seus RRs cognatos: XAC0135 e XAC0136, XAC0620 e XAC0621, XAC0683 e XAC0684, XAC0759 e XAC0760, além de interações entre XAC1669 e XAC1670 e XAC1669 e XAC1282, estas últimas possivelmente envolvidas em quimiotaxia. Outro foco de nosso trabalho foi a identificação de interações entre proteínas com similaridade aos componentes do Sistema de Secreção do Tipo IV (T4SS), envolvido em processos de conjugação e secreção em bactérias. Xac possui dois loci vir que codificam proteínas com similaridade aos componentes do T4SS, um localizado no plasmídeo e outro localizado no cromossomo. Identificamos novas interações entre proteínas hipotéticas adjacentes a esse locus no plasmídeo: XACb0018 e XACb0019 e interações entre VirB8 e VirB9 e VirB9 e XAC2610, estas últimas codificadas por genes presentes no cromossomo. Apesar da importância de alguns T4SSs na secreção de proteínas patogênicas em bactérias, verificamos que o nocaute da proteína VirD4, codificada pelo gene XAC2623 apresentou fenótipo de virulência alterado em apenas um, dos cinco clones infiltrados em folhas de laranja pêra. O nocaute da proteína VirB4 do T4SS plasmidial não apresentou alteração na virulência de Xac, quando infiltrado em folhas de laranja e limão cravo, corroborando a hipótese de o T4SS codificado pelo plasmídeo não estar envolvido em virulência, mas sim em processos conjugativos. Outro sistema secretório importante em bactérias é o Sistema de Secreção do Tipo III (T3SS). Em Xac, o T3SS é o responsável pela secreção de fatores patogênicos, entre eles a proteína HpaA e a proteína de avirulência PthA. Com esse intuito, estudamos possíveis alvos dessas proteínas em Citrus sinensis. Identificamos interações de PthA com a alfa-importina, corroborando dados da literatura que mostram que PthA é importada para o núcleo. Além disso, identificamos três proteínas que interagiram com HpaA, dentre elas, destacamos uma proteína dedo de zinco com domínio RING C3HC4" característico de E3 ubiquitina-ligases. Isto sugere que HpaA interfere na degradação de proteínas do hospedeiro através do complexo ubiquitina/proteossomo, um processo que pode contribuir para a sobrevivência de Xac nos tecidos de plantas infectadas. / Citriculture is an important sector of the economy of the State of São Paulo. Citrus canker, caused by Xanthomonas axonopodis pv. citri (Xac), is a devastating disease responsible for large losses to Agroindustry every year. In this work, we used the yeast two-hybrid system to study protein-protein interactions that occur in Xac. We were particularly interested in proteins of two-component systems, due to their importance in cell signaling. The complexity of these systems makes genomic analysis an important tool in the study of signalling pathways that allow bacteria to infect the host. Xac has 37 histidine kinases (HK) and 60 response regulators (RR), besides 21 hybrid proteins with both domains. We detected specific interactions between several proteins that belong to this system, notably the following HKs and their cognate RRs: XAC0135 and XAC0136, XAC0620 and XAC0621, XAC0683 and XAC0684, XAC0759 and XAC0760, besides XAC1669 and XAC1670 and XAC1669 and XAC1282, the later possibly involved in bacterial chemotaxis. We were also interested in studying interactions between proteins that make up the Type IV Secretion System (T4SS), involved in bacterial conjugation and protein secretion. Xac has two loci vir, which code for proteins with sequence similarity to T4SS components, one in the plasmid and the other in the chromosome. We identified new interactions between hypothetical proteins adjacent to this locus in the plasmid (XACb0018 and XACb0019) and between VirB8 and VirB9 and VirB9 and XAC2610, coded within the chromosomal locus. Despite the importance of T4SS in the pathogenesis of bacteria, a chromosomal VirD4 knockout strain presented alterated virulence in only one out of five mutants tested in the leaves of Citrus sinensis. Plasmidial VirB4 knockout strains did not present any alteration in Xac virulence when tested in Citrus sinensis or Citrus limonia, consistent with the hypothesis that the T4SS coded by the plasmid is not involved virulence, but in bacterial conjugation. Another secretory system involved in bacterial pathogenesis is the Type III Secretion System (T3SS), responsible for secretion of pathogenic factors like HpaA protein and the avirulence protein PthA. We investigated possible targets for these proteins using a Citrus sinensis cDNA library. We identified interactions between PthA and importin alpha, corroborating previous data that suggest PthA translocation to the host cell nucleus. We also identified three proteins which interacted with HpaA. One of them is a zinc finger protein containing the RING C3HC4" domain characteristic of E3 ubiquitin-ligases. This suggests that HpaA interferes in the ubiquitin/proteasome-dependent degradation of host target proteins, a process that may contribute towards Xac survival in host tissues.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-01122006-143944 |
| Date | 06 October 2006 |
| Creators | Docena, Cássia |
| Contributors | Farah, Chuck Shaker |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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