O nitrato é uma das principais fontes de nitrogênio disponível para as plantas, sendo a nitrato redutase (NR) a enzima responsável pela sua redução a nitrito. O nitrito é considerado tóxico em altas concentrações e, por esse motivo, a atividade da NR possui uma regulação complexa, principalmente em nível transcricional e pós-traducional. Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando plantas de abacaxizeiro cultivadas in vitro, demonstraram que, em condições de termoperíodo de 28ºC dia/15ºC noite, as raízes apresentaram um estímulo positivo de atividade da NR na ausência de luz quando comparado às plantas crescidas em temperatura constante de 28ºC, associado posteriormente à atividade da NR de membrana plasmática (NRPM). Baseado nesses resultados questionou-se qual seria a influência da aplicação do estímulo de frio associado ou não à presença de luz na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro. Este trabalho teve como objetivos investigar os efeitos do frio na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro em diferentes tempos de exposição, na presença ou ausência da luz e em diferentes fases do ciclo de 24 horas (claro/escuro). Buscou-se averiguar qual NR estaria envolvida nessas respostas: a NR citossólica (NRc) ou de membrana plasmática (NRPM), assim como verificar o envolvimento do NO na sinalização pela baixa temperatura. O ritmo diário de atividade da NR também foi avaliado, logo após a exposição ao frio, em diferentes fases do ciclo de claro/escuro. As plantas foram expostas a 1, 3, 6 ou 9 horas a 10ºC ou 25ºC (controle) na luz ou no escuro. A NR foi avaliada pelo método in vitro. O estímulo positivo na atividade da NR pelo frio ocorreu principalmente após 6 horas no claro, para as folhas, e após 6 horas no escuro, para as raízes. Novas plantas foram submetidas às mesmas condições para o fracionamento celular, mostrando que, tanto em folhas como em raízes, o incremento de atividade da NR observado a 10ºC foi associado à NR citossólica (NRc). Em ambos os casos, o estímulo ocorreu utilizando-se o NADPH como doador de elétrons, sugerindo o possível envolvimento de uma isoforma NAD(P)H biespecífica. A quantificação do NO foi realizada por leitura em espectrofluorímetro, apontando uma maior emissão induzida pelo frio para as folhas tanto na presença da luz (após 1 e 3 horas) como em sua ausência (1 e 9 horas) e em raízes apenas no escuro (9 horas), sugerindo o envolvimento do NO na sinalização da baixa temperatura. Para verificar a influência do frio em diferentes fases do dia, 4 horários foram selecionados (início da fase clara, meio da fase clara, início da fase escura, meio da fase escura) para início de cada experimento. A NR foi medida logo após a exposição ao frio (6 horas a 10ºC), pelo método in vitro e durante 24 horas em reaquecimento (25ºC), quantificada a cada 3 horas pelo método in vivo. As raízes apresentaram aumento da atividade da NR apenas quando o estímulo da baixa temperatura foi aplicado na fase escura, enquanto as folhas sofreram incremento da atividade da NR independente da condição luminosa. Em reaquecimento, a NR das folhas teve seu ritmo atrasado em todas as situações, com exceção quando o frio foi aplicado no início da fase escura, na qual houve perda quase completa de variação ao longo do dia. As raízes não mostraram grandes alterações no ritmo diário da NR. Este trabalho mostrou que a temperatura de 10ºC tem efeitos diferentes sobre folhas e raízes, sendo que as modificações na atividade da NR, em curto prazo, parecem ocorrer por alterações na NRc. O NO parece estar envolvido na sinalização do frio, mas não se determinou sua origem biossintética. As raízes tiveram um aumento da atividade da NR pela baixa temperatura, que foi dependente do escuro, enquanto as respostas das folhas dependeram da fase do ciclo na qual foram submetidas a 10ºC / Nitrate is the main nitrogen source available to plants, and nitrate reductase (NR) is the enzyme responsible for its reduction to nitrite. Because of its toxicity in high concentrations, nitrite production by NR has a complex regulation, especially at transcriptional and post-translational level. A previous work from our group, using pineapple plants cultivated in vitro, showed that, under thermoperiod of 28ºC day/15ºC night, NR activity increased in roots during absence of light compared to activity in plants grown under constant temperature of 28ºC. Based on these results it was questioned what would be the effect of cold stimulus application with or without light on NR activity in leaves and roots of pineapple plants. This study aimed to investigate the effects of low temperature on NR activity in leaves and roots of pineapple plants at different exposure times in the presence or absence of light and at different phases of a 24 hour cycle (light/darkness). We also investigated which NR was involved in these responses: cytosolic (cNR) or plasma membrane NR (PMNR), as well as verifying the role of nitric oxide (NO) signaling at low temperature. Furthermore, the NR daily rhythm activity was measured after cold exposure, in different phases of the light/dark cycle. Plants were exposed to 10ºC or 25ºC (control group) during 1, 3, 6 or 9 hours. NR was quantified by in vitro method. In the leaves, the increase of NR activity by low temperature (10ºC) occurred mainly after 6 hours in the presence of light, while in the roots the highest NR activity occurred after 6 hours at 10ºC in darkness. Based on these results, other groups of plants were subjected to the same conditions for cell partitioning, showing that in both leaves and roots the increase of NR activity by cold was associated with cytosolic NR (NRc). In both cases, the positive stimulation occurred with NADPH as the electron donor, suggesting the possible involvement of a NAD(P)H bispecific isoform. NO quantification, measured by spectrofluorimetry, indicated a greater emission induced by cold in the leaves both in the presence (after 1 and 3 hours) and absence (1 and 9 hours) of light and in roots only in darkness (9 hours), suggesting an involvement of NO in low temperature signaling. To evaluate the influence of cold at different day phases, we performed 4 experiments beginning at different times of the 24-hour cycle (beginning of light phase, middle of light phase, beginning of dark phase, middle of dark phase). NR activity was measured immediately after cold exposure (6 hours at 10°C) by in vitro method and after rewarming at 25°C during 24 hours, quantified by in vivo method every 3 hours. In roots, NR activity showed an increase only when the cold stimulus was applied at dark phase, while in leaves, NR was independent of the light condition. Upon rewarming, leaves presented a delay in NR daily behavior in all situations, except when low temperature was applied at the beginning of dark phase, showing almost no variation throughout the day. This study demonstrated that the temperature of 10ºC affected leaves and roots differently, and the changes in NR activity after short exposure time could be associated with NRc. NO seemed to be involved in cold signaling, but its biosynthetic origin has not been determined yet. Roots showed an increment of NR activity by low temperature dependent of the dark condition, while the responses of leaves depended on the phase of the 24-hour cycle in which they were subjected to 10ºC
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-04062013-105340 |
| Date | 06 February 2013 |
| Creators | Matsumura, Aline Tiemi |
| Contributors | Mercier, Helenice |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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