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Thesis (Ph. D.)--Ohio State University, 2003. / Title from first page of PDF file. Document formatted into pages; contains xvi, 176 p.; also includes graphics (some col.). Includes abstract and vita. Advisor:, Dept. of Biochemistry. Includes bibliographical references (p. 168-176).

Azotobacter vinelandii is a free-living diazotroph. This bacterium fixes atmospheric nitrogen in different environments using three genetically distinct nitrogenases. A. vinelandii is also capable of utilizing nitrate and nitrite from the environment. Nitrate is reduced sequentially into nitrite and ammonia. The assimilatory nitrate reductase and nitrite reductase are encoded by the nasAB operon. Previous genetic studies identified a number of factors that influence nasAB expression. However, the molecular mechanisms controlling the expression of nasAB are unclear.The current study was initiated to characterize the region preceding the nasAB operon which was previously implicated in its regulation and to further study the molecular mechanisms of nasAB regulation. The results confirm that nasAB is subject to multiple layers of regulation. The operon is under the control of an NtrC-dependent promoter; nitrate/nitrite induction occurs at the post-transcriptional level via antitermination within the nasAB leader region; and nitrate/nitrite induction is mediated by NasS/NasT, a sensor-antiterminator two-component regulatory system.Together, these data suggest a model for the regulation of the assimilatory nitrate reductase operon in A. vinelandii.

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A nitrato redutase (NR) atua juntamente com a nitrito redutase (NiR) catalisando a primeira etapa da redução do nitrato. A NR, no citossol, é ativada, principalmente, pela luz e reduz o nitrato a nitrito. Em seguida, este é reduzido a amônio. Trabalhos anteriores demonstraram que a isoforma citossólica da NR está presente nas folhas e raízes do abacaxizeiro; já as associadas à membrana plasmática (NRMP) ainda não se tem registro. Sabe-se, no entanto, que a NRMP apresenta modos diferentes de ativação, como já constatados para outras espécies. Dentre os fatores que afetam sua atividade pode-se citar a temperatura. Pesquisas realizadas no Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, acerca da influência do termoperíodo sobre os metabolismos nitrogenado e fotossintético de plantas de abacaxizeiro, aventaram a hipótese de que haveria uma nitrato redutase específica de membrana plasmática presente nas células radiculares, a qual seria regulada por termoperíodo, diferindo, portanto, da isoforma citossólica presente nas folhas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal demonstrar a existência de uma isoforma da NR associada à membrana plasmática, a qual seria responsável pelo incremento da atividade dessa enzima registrada nas raízes de Ananas comosus, quando plantas cultivadas in vitro são submetidas ao termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite). Para tanto, determinou-se o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo, necessário à indução da nitrato redutase radicular. Além disso, estudou-se a influência da idade das plantas na resposta ao tratamento com baixa temperatura noturna. Plantas cultivadas in vitro com 90 dias de idade ou com idades variadas foram transferidas para câmaras de crescimento com temperatura constante (28°C dia/noite controle experimental) ou com termoperíodo (28°C dia/ 15°C noite), fotoperíodo de 16 horas e intensidade luminosa de 55 moles m-2 s -1. Elas permaneceram nessas condições por 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 ou 60 dias. Após cada período, a atividade in vivo da NR foi analisada durante a fase de ausência de luz. Para que fosse possível identificar uma possível NRMP nas células radiculares de abacaxizeiro, um método de ensaio in vitro foi padronizado e a melhor técnica de isolamento de frações de membrana plasmática foi selecionada. Após as plantas com 60 dias de idade serem submetidas por 30 dias ao tratamento termoperiódico ou à temperatura constante, as frações de membrana plasmática das células radiculares foram isoladas e o ensaio in vitro da NR foi realizado, utilizando-se NADH, NADPH ou succinato como doadores de elétrons. Os resultados indicaram que o tempo mínimo de exposição das plantas de abacaxizeiro ao termoperíodo foi de 30 dias. O método de ensaio enzimático in vitro foi padronizado para as plantas de abacaxizeiro e a técnica de isolamento de frações de membrana plasmática que se mostrou mais adequada para essa bromélia foi a de fracionamento por sistema de duas fases com Dextran T-500 e PEG 3350. O grau de pureza das frações, avaliado pela detecção da atividade da enzima citoplasmática malato desidrogenase (MDH), foi em média de 95%, evidenciando a eficácia da pradronização do método. Os resultados obtidos para as frações de membranas plasmáticas, extraídas das raízes das plantas que estiveram sob o tratamento termoperiódico, mostraram que a baixa temperatura noturna influenciou positivamente a atividade da nitrato redutase. O aumento da atividade foi observado quando NADH, NADPH ou succinato foram utilizados como doadores de elétrons. Isso significa que, provavelmente, mais de uma isoforma da NRMP está presente nas raízes de abacaxizeiro. Além disso, há indícios de que a isoforma que está ligada externamente à membrana por uma âncora glicosídica (que utiliza succinato como doador de elétrons) está presente nas células radiculares do abacaxizeiro e respondeu positivamente ao estímulo da baixa temperatura noturna. Em contrapartida, nenhuma diferença pôde ser observada quando as atividades da NR foram medidas nas frações de citoplasma das plantas controle e daquelas que foram tratadas com termoperíodo. Não foi detectada atividade nas frações citossólicas quando succinato foi oferecido como poder redutor da NR. Concluiu-se, portanto, que o incremento na atividade da NR, verificado nas plantas que foram tratadas com termoperíodo, deveu-se à indução pela baixa temperatura noturna da NRMP. Esta pesquisa trouxe contribuições importantes acerca da existência de uma nitrato redutase associada à membrana plasmática em abacaxizeiro, nunca antes detectada em uma bromélia e muito pouco estudada nos demais vegetais. As padronizações realizadas serão essenciais para aplicação em outras pesquisas do Laboratório de Fisiologia Vegetal do IBUSP, abrindo oportunidades para se aprofundar ainda mais o tema sobre o controle da ativação da NR. / The nitrate reductase (NR) acts together with the nitrite reductase (NiR) to catalyze the first step of the nitrate reduction. The NR localized in the cytosol is activated mainly by light and reduces nitrate to nitrite, followed by its reduction to ammonium. Previous work demonstrated that the cytosolic isoform of NR is present in leaves and roots of Ananas comosus, although the isoform associated with the plasma membrane (PM-NR) has not yet been registered in this species. The PM-NR has different modes of activation in comparison to the cytosolic NR, as already demonstrated in other species. Among the factors that affect its activity can be mentioned the temperature. Experiments developed in the Laboratory of Plant Physiology of IBUSP hypothesized that exists a specific plasma membrane NR in plant roots regulated by thermoperiod, differing from the cytosolic isoform present in leaves. The present work aimed to demonstrate the existence of this isoform of NR present in the plasma membrane, which would be responsible for the increase of its activity in Ananas comosus roots when plants were cultivated in vitro under thermoperiod of 28°C day/ 15°C night. Initially, it was important to determine the minimum time of exposure to thermoperiod necessary for the induction of nitrate reductase in roots of pineapple plants. Furthermore, it was analyzed the influence of age in the response of plants to low night temperature treatment. For this purpose, plants with different ages cultivated in vitro were transferred to growth chambers either with constant temperature (28°C day/night experimental control) or with thermoperiod (28°C day/ 15°C night). The plants were cultivated in these conditions during 1, 3, 5, 7, 15, 30, 40, 50 or 60 days and then the in vivo NR activity was analyzed in the shoot and root tissues during the dark period. In order to identify a probable PM-NR in the pineapple root cells, it was also necessary to develop a NR in vitro assay protocol specific for Ananas comosus and the appropriate technique for plasma membrane isolation (Dextran T-500 and PEG 3350). The purity of the fractions, determined by the activity of cytoplasmic enzyme malate dehydrogenase (MDH), was on average 95%, indicating the effectiveness of the method. The next step was to evaluate the NR activity in citoplasmic and plasma membrane fractions of root tissues of Ananas comosus. Using 60 daysold plants exposed either to 30 days under the thermoperiodic treatment or to constant temperature, the plasma membrane fractions of roots were isolated and the in vitro NR assay was performed using NADH, NADPH or succinate as electron donators. The results indicated that the minimum thermoperiod exposure time necessary to induce NR activity was 30 days. Furthermore, it was demonstrated that low temperatures during the dark period positively influenced the activity of nitrate reductase in plasma membrane fractions and that the increase in its activity was observed when NADH, NADPH or succinate were used as electron donors. On the other hand, no difference in NR activity was observed in the cytoplasmic fraction of control plants and those which were treated with thermoperiod. Moreover, no NR activity was detected in cytosolic fractions when succinate was provided as electron donor. All together, this results showed that probably diferents isoforms are presents in pineapple roots. The extracellular isoform that is attached to the plasma membrane by a lipophilic anchor (using succinate as electron donor) can be present in root cells of pineapple and responded positively to the low night temperature stimulus. This study has made important contributions to the knowledge of the metabolism and physiology of Ananas comosus. This is the first time that the existence of a nitrate reductase associated with the plasma membrane, a very little studied enzyme, is documented in Bromeliaceae.

O nitrato é uma das principais fontes de nitrogênio disponível para as plantas, sendo a nitrato redutase (NR) a enzima responsável pela sua redução a nitrito. O nitrito é considerado tóxico em altas concentrações e, por esse motivo, a atividade da NR possui uma regulação complexa, principalmente em nível transcricional e pós-traducional. Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando plantas de abacaxizeiro cultivadas in vitro, demonstraram que, em condições de termoperíodo de 28ºC dia/15ºC noite, as raízes apresentaram um estímulo positivo de atividade da NR na ausência de luz quando comparado às plantas crescidas em temperatura constante de 28ºC, associado posteriormente à atividade da NR de membrana plasmática (NRPM). Baseado nesses resultados questionou-se qual seria a influência da aplicação do estímulo de frio associado ou não à presença de luz na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro. Este trabalho teve como objetivos investigar os efeitos do frio na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro em diferentes tempos de exposição, na presença ou ausência da luz e em diferentes fases do ciclo de 24 horas (claro/escuro). Buscou-se averiguar qual NR estaria envolvida nessas respostas: a NR citossólica (NRc) ou de membrana plasmática (NRPM), assim como verificar o envolvimento do NO na sinalização pela baixa temperatura. O ritmo diário de atividade da NR também foi avaliado, logo após a exposição ao frio, em diferentes fases do ciclo de claro/escuro. As plantas foram expostas a 1, 3, 6 ou 9 horas a 10ºC ou 25ºC (controle) na luz ou no escuro. A NR foi avaliada pelo método in vitro. O estímulo positivo na atividade da NR pelo frio ocorreu principalmente após 6 horas no claro, para as folhas, e após 6 horas no escuro, para as raízes. Novas plantas foram submetidas às mesmas condições para o fracionamento celular, mostrando que, tanto em folhas como em raízes, o incremento de atividade da NR observado a 10ºC foi associado à NR citossólica (NRc). Em ambos os casos, o estímulo ocorreu utilizando-se o NADPH como doador de elétrons, sugerindo o possível envolvimento de uma isoforma NAD(P)H biespecífica. A quantificação do NO foi realizada por leitura em espectrofluorímetro, apontando uma maior emissão induzida pelo frio para as folhas tanto na presença da luz (após 1 e 3 horas) como em sua ausência (1 e 9 horas) e em raízes apenas no escuro (9 horas), sugerindo o envolvimento do NO na sinalização da baixa temperatura. Para verificar a influência do frio em diferentes fases do dia, 4 horários foram selecionados (início da fase clara, meio da fase clara, início da fase escura, meio da fase escura) para início de cada experimento. A NR foi medida logo após a exposição ao frio (6 horas a 10ºC), pelo método in vitro e durante 24 horas em reaquecimento (25ºC), quantificada a cada 3 horas pelo método in vivo. As raízes apresentaram aumento da atividade da NR apenas quando o estímulo da baixa temperatura foi aplicado na fase escura, enquanto as folhas sofreram incremento da atividade da NR independente da condição luminosa. Em reaquecimento, a NR das folhas teve seu ritmo atrasado em todas as situações, com exceção quando o frio foi aplicado no início da fase escura, na qual houve perda quase completa de variação ao longo do dia. As raízes não mostraram grandes alterações no ritmo diário da NR. Este trabalho mostrou que a temperatura de 10ºC tem efeitos diferentes sobre folhas e raízes, sendo que as modificações na atividade da NR, em curto prazo, parecem ocorrer por alterações na NRc. O NO parece estar envolvido na sinalização do frio, mas não se determinou sua origem biossintética. As raízes tiveram um aumento da atividade da NR pela baixa temperatura, que foi dependente do escuro, enquanto as respostas das folhas dependeram da fase do ciclo na qual foram submetidas a 10ºC / Nitrate is the main nitrogen source available to plants, and nitrate reductase (NR) is the enzyme responsible for its reduction to nitrite. Because of its toxicity in high concentrations, nitrite production by NR has a complex regulation, especially at transcriptional and post-translational level. A previous work from our group, using pineapple plants cultivated in vitro, showed that, under thermoperiod of 28ºC day/15ºC night, NR activity increased in roots during absence of light compared to activity in plants grown under constant temperature of 28ºC. Based on these results it was questioned what would be the effect of cold stimulus application with or without light on NR activity in leaves and roots of pineapple plants. This study aimed to investigate the effects of low temperature on NR activity in leaves and roots of pineapple plants at different exposure times in the presence or absence of light and at different phases of a 24 hour cycle (light/darkness). We also investigated which NR was involved in these responses: cytosolic (cNR) or plasma membrane NR (PMNR), as well as verifying the role of nitric oxide (NO) signaling at low temperature. Furthermore, the NR daily rhythm activity was measured after cold exposure, in different phases of the light/dark cycle. Plants were exposed to 10ºC or 25ºC (control group) during 1, 3, 6 or 9 hours. NR was quantified by in vitro method. In the leaves, the increase of NR activity by low temperature (10ºC) occurred mainly after 6 hours in the presence of light, while in the roots the highest NR activity occurred after 6 hours at 10ºC in darkness. Based on these results, other groups of plants were subjected to the same conditions for cell partitioning, showing that in both leaves and roots the increase of NR activity by cold was associated with cytosolic NR (NRc). In both cases, the positive stimulation occurred with NADPH as the electron donor, suggesting the possible involvement of a NAD(P)H bispecific isoform. NO quantification, measured by spectrofluorimetry, indicated a greater emission induced by cold in the leaves both in the presence (after 1 and 3 hours) and absence (1 and 9 hours) of light and in roots only in darkness (9 hours), suggesting an involvement of NO in low temperature signaling. To evaluate the influence of cold at different day phases, we performed 4 experiments beginning at different times of the 24-hour cycle (beginning of light phase, middle of light phase, beginning of dark phase, middle of dark phase). NR activity was measured immediately after cold exposure (6 hours at 10°C) by in vitro method and after rewarming at 25°C during 24 hours, quantified by in vivo method every 3 hours. In roots, NR activity showed an increase only when the cold stimulus was applied at dark phase, while in leaves, NR was independent of the light condition. Upon rewarming, leaves presented a delay in NR daily behavior in all situations, except when low temperature was applied at the beginning of dark phase, showing almost no variation throughout the day. This study demonstrated that the temperature of 10ºC affected leaves and roots differently, and the changes in NR activity after short exposure time could be associated with NRc. NO seemed to be involved in cold signaling, but its biosynthetic origin has not been determined yet. Roots showed an increment of NR activity by low temperature dependent of the dark condition, while the responses of leaves depended on the phase of the 24-hour cycle in which they were subjected to 10ºC

No ambiente aquático a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrato que necessita sofrer uma redução para formação de compostos biologicamente aproveitáveis, tais como aminoácidos, bases nitrogenadas e compostos nitrogenados. A assimilação de nitrogênio é um processo que ocorre em duas etapas catalisadas seqüencialmente pelas enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR). A NR catalisa a redução do nitrato a nitrito (etapa considerada limitante na assimilação de nitrogênio), sendo este posteriormente reduzido a amônio pela NiR. NR está amplamente distribuída e encontrada em diferentes organismos, incluíndo bactérias, fungos, cianobactérias, plantas terrestres e algas. Neste trabalho estudamos a NR de Microcystis aeruginosa que é uma cianobactéria tóxica de água doce encontrada principalmente em reservatórios de água. A toxina microcistina quando liberada por esta microalga está associada com problemas de saúde em humanos e animais. Foi mostrado que a NR de M. aeruginosa pertence a classe das NRs biespecíficas para NADH e NADPH. Apresenta constante de Michaelis-Menten aparente (Km) de 1,5 e 1,6 mM para NADPH e NADH, respectivamente. Ainda, Km aparente para nitrato foi estimado em 0,6 mM. As condições ótimas de ensaio encontradas foram em pH 10,0 e temperatura em 40ºC. A exposição da M. aeruginosa ao herbicida oxifluorfeno (10 µg/L) promoveu a inibição de NiR, possibilitando a quantificação de •NO formado via NR, enzima que teve sua atividade 6 vezes maior durante a exposição a este agente. O estudo da enzima NR é de fundamental importância para a compreensão da regulação da expressão de enzimas assimiladoras de nitrogênio bem como dos mecanismos de nutrição e crescimento desta microalga. / Nitrate is the major source of nitrogen in the aquatic environment, which must be reduced before incorporation into biological compounds, such as amino acids, nitrogen bases and nitrogen compounds. The nitrogen assimilation process occurs in a two-step reaction catalyzed by 2 enzymes working sequentially, nitrate reductase (NR) and nitrite reductase (NiR). The NR catalyzes the reduction of nitrate to nitrite (is considered the limiting step in the nitrogen assimilation) being this later reduced to ammonium by NiR. NR is widely distributed and found in different organisms, including bacterium, fungus, cyanobacterium, plants and algae. In this work we study the NR of Microcystis aeruginosa, a toxic microalga, mainly found in water reservoirs. The microcystin toxin released by M. aeruginosa is associated with problems of health in humans and animals. We report that NR of M. aeruginosa belongs to a biespecific group of NRs for NADH and NADPH. It presents Michaelis-Menten\'s constant (Km) as 1.5 and 1.6 mM for NADPH and NADH, respectively. The apparent Km for nitrate was estimated as 0.6 mM. The optimum conditions of assay found were at pH 10.0 and temperature of 40ºC. The exposition of M. aeruginosa to the herbicide oxyfluorfen (10 µg/L) promotes the inhibition of NiR, and it makes possible to quantify the •NO produced by NR, whose has it activity 6 hold higher during the agent exposition. In order to understand the regulation of nitrogen assimilation enzymes, as well as, the mechanisms of nutrition and growth of this algae, the study of the NR enzyme is of crucial importance.

No ambiente aquático a maior fonte de nitrogênio encontra-se na forma de nitrato que necessita sofrer uma redução para formação de compostos biologicamente aproveitáveis, tais como aminoácidos, bases nitrogenadas e compostos nitrogenados. A assimilação de nitrogênio é um processo que ocorre em duas etapas catalisadas seqüencialmente pelas enzimas nitrato redutase (NR) e nitrito redutase (NiR). A NR catalisa a redução do nitrato a nitrito (etapa considerada limitante na assimilação de nitrogênio), sendo este posteriormente reduzido a amônio pela NiR. NR está amplamente distribuída e encontrada em diferentes organismos, incluíndo bactérias, fungos, cianobactérias, plantas terrestres e algas. Neste trabalho estudamos a NR de Microcystis aeruginosa que é uma cianobactéria tóxica de água doce encontrada principalmente em reservatórios de água. A toxina microcistina quando liberada por esta microalga está associada com problemas de saúde em humanos e animais. Foi mostrado que a NR de M. aeruginosa pertence a classe das NRs biespecíficas para NADH e NADPH. Apresenta constante de Michaelis-Menten aparente (Km) de 1,5 e 1,6 mM para NADPH e NADH, respectivamente. Ainda, Km aparente para nitrato foi estimado em 0,6 mM. As condições ótimas de ensaio encontradas foram em pH 10,0 e temperatura em 40ºC. A exposição da M. aeruginosa ao herbicida oxifluorfeno (10 µg/L) promoveu a inibição de NiR, possibilitando a quantificação de •NO formado via NR, enzima que teve sua atividade 6 vezes maior durante a exposição a este agente. O estudo da enzima NR é de fundamental importância para a compreensão da regulação da expressão de enzimas assimiladoras de nitrogênio bem como dos mecanismos de nutrição e crescimento desta microalga. / Nitrate is the major source of nitrogen in the aquatic environment, which must be reduced before incorporation into biological compounds, such as amino acids, nitrogen bases and nitrogen compounds. The nitrogen assimilation process occurs in a two-step reaction catalyzed by 2 enzymes working sequentially, nitrate reductase (NR) and nitrite reductase (NiR). The NR catalyzes the reduction of nitrate to nitrite (is considered the limiting step in the nitrogen assimilation) being this later reduced to ammonium by NiR. NR is widely distributed and found in different organisms, including bacterium, fungus, cyanobacterium, plants and algae. In this work we study the NR of Microcystis aeruginosa, a toxic microalga, mainly found in water reservoirs. The microcystin toxin released by M. aeruginosa is associated with problems of health in humans and animals. We report that NR of M. aeruginosa belongs to a biespecific group of NRs for NADH and NADPH. It presents Michaelis-Menten\'s constant (Km) as 1.5 and 1.6 mM for NADPH and NADH, respectively. The apparent Km for nitrate was estimated as 0.6 mM. The optimum conditions of assay found were at pH 10.0 and temperature of 40ºC. The exposition of M. aeruginosa to the herbicide oxyfluorfen (10 µg/L) promotes the inhibition of NiR, and it makes possible to quantify the •NO produced by NR, whose has it activity 6 hold higher during the agent exposition. In order to understand the regulation of nitrogen assimilation enzymes, as well as, the mechanisms of nutrition and growth of this algae, the study of the NR enzyme is of crucial importance.

O nitrato é uma das principais fontes de nitrogênio disponível para as plantas, sendo a nitrato redutase (NR) a enzima responsável pela sua redução a nitrito. O nitrito é considerado tóxico em altas concentrações e, por esse motivo, a atividade da NR possui uma regulação complexa, principalmente em nível transcricional e pós-traducional. Trabalhos anteriores do nosso grupo, utilizando plantas de abacaxizeiro cultivadas in vitro, demonstraram que, em condições de termoperíodo de 28ºC dia/15ºC noite, as raízes apresentaram um estímulo positivo de atividade da NR na ausência de luz quando comparado às plantas crescidas em temperatura constante de 28ºC, associado posteriormente à atividade da NR de membrana plasmática (NRPM). Baseado nesses resultados questionou-se qual seria a influência da aplicação do estímulo de frio associado ou não à presença de luz na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro. Este trabalho teve como objetivos investigar os efeitos do frio na atividade da NR em folhas e raízes de abacaxizeiro em diferentes tempos de exposição, na presença ou ausência da luz e em diferentes fases do ciclo de 24 horas (claro/escuro). Buscou-se averiguar qual NR estaria envolvida nessas respostas: a NR citossólica (NRc) ou de membrana plasmática (NRPM), assim como verificar o envolvimento do NO na sinalização pela baixa temperatura. O ritmo diário de atividade da NR também foi avaliado, logo após a exposição ao frio, em diferentes fases do ciclo de claro/escuro. As plantas foram expostas a 1, 3, 6 ou 9 horas a 10ºC ou 25ºC (controle) na luz ou no escuro. A NR foi avaliada pelo método in vitro. O estímulo positivo na atividade da NR pelo frio ocorreu principalmente após 6 horas no claro, para as folhas, e após 6 horas no escuro, para as raízes. Novas plantas foram submetidas às mesmas condições para o fracionamento celular, mostrando que, tanto em folhas como em raízes, o incremento de atividade da NR observado a 10ºC foi associado à NR citossólica (NRc). Em ambos os casos, o estímulo ocorreu utilizando-se o NADPH como doador de elétrons, sugerindo o possível envolvimento de uma isoforma NAD(P)H biespecífica. A quantificação do NO foi realizada por leitura em espectrofluorímetro, apontando uma maior emissão induzida pelo frio para as folhas tanto na presença da luz (após 1 e 3 horas) como em sua ausência (1 e 9 horas) e em raízes apenas no escuro (9 horas), sugerindo o envolvimento do NO na sinalização da baixa temperatura. Para verificar a influência do frio em diferentes fases do dia, 4 horários foram selecionados (início da fase clara, meio da fase clara, início da fase escura, meio da fase escura) para início de cada experimento. A NR foi medida logo após a exposição ao frio (6 horas a 10ºC), pelo método in vitro e durante 24 horas em reaquecimento (25ºC), quantificada a cada 3 horas pelo método in vivo. As raízes apresentaram aumento da atividade da NR apenas quando o estímulo da baixa temperatura foi aplicado na fase escura, enquanto as folhas sofreram incremento da atividade da NR independente da condição luminosa. Em reaquecimento, a NR das folhas teve seu ritmo atrasado em todas as situações, com exceção quando o frio foi aplicado no início da fase escura, na qual houve perda quase completa de variação ao longo do dia. As raízes não mostraram grandes alterações no ritmo diário da NR. Este trabalho mostrou que a temperatura de 10ºC tem efeitos diferentes sobre folhas e raízes, sendo que as modificações na atividade da NR, em curto prazo, parecem ocorrer por alterações na NRc. O NO parece estar envolvido na sinalização do frio, mas não se determinou sua origem biossintética. As raízes tiveram um aumento da atividade da NR pela baixa temperatura, que foi dependente do escuro, enquanto as respostas das folhas dependeram da fase do ciclo na qual foram submetidas a 10ºC / Nitrate is the main nitrogen source available to plants, and nitrate reductase (NR) is the enzyme responsible for its reduction to nitrite. Because of its toxicity in high concentrations, nitrite production by NR has a complex regulation, especially at transcriptional and post-translational level. A previous work from our group, using pineapple plants cultivated in vitro, showed that, under thermoperiod of 28ºC day/15ºC night, NR activity increased in roots during absence of light compared to activity in plants grown under constant temperature of 28ºC. Based on these results it was questioned what would be the effect of cold stimulus application with or without light on NR activity in leaves and roots of pineapple plants. This study aimed to investigate the effects of low temperature on NR activity in leaves and roots of pineapple plants at different exposure times in the presence or absence of light and at different phases of a 24 hour cycle (light/darkness). We also investigated which NR was involved in these responses: cytosolic (cNR) or plasma membrane NR (PMNR), as well as verifying the role of nitric oxide (NO) signaling at low temperature. Furthermore, the NR daily rhythm activity was measured after cold exposure, in different phases of the light/dark cycle. Plants were exposed to 10ºC or 25ºC (control group) during 1, 3, 6 or 9 hours. NR was quantified by in vitro method. In the leaves, the increase of NR activity by low temperature (10ºC) occurred mainly after 6 hours in the presence of light, while in the roots the highest NR activity occurred after 6 hours at 10ºC in darkness. Based on these results, other groups of plants were subjected to the same conditions for cell partitioning, showing that in both leaves and roots the increase of NR activity by cold was associated with cytosolic NR (NRc). In both cases, the positive stimulation occurred with NADPH as the electron donor, suggesting the possible involvement of a NAD(P)H bispecific isoform. NO quantification, measured by spectrofluorimetry, indicated a greater emission induced by cold in the leaves both in the presence (after 1 and 3 hours) and absence (1 and 9 hours) of light and in roots only in darkness (9 hours), suggesting an involvement of NO in low temperature signaling. To evaluate the influence of cold at different day phases, we performed 4 experiments beginning at different times of the 24-hour cycle (beginning of light phase, middle of light phase, beginning of dark phase, middle of dark phase). NR activity was measured immediately after cold exposure (6 hours at 10°C) by in vitro method and after rewarming at 25°C during 24 hours, quantified by in vivo method every 3 hours. In roots, NR activity showed an increase only when the cold stimulus was applied at dark phase, while in leaves, NR was independent of the light condition. Upon rewarming, leaves presented a delay in NR daily behavior in all situations, except when low temperature was applied at the beginning of dark phase, showing almost no variation throughout the day. This study demonstrated that the temperature of 10ºC affected leaves and roots differently, and the changes in NR activity after short exposure time could be associated with NRc. NO seemed to be involved in cold signaling, but its biosynthetic origin has not been determined yet. Roots showed an increment of NR activity by low temperature dependent of the dark condition, while the responses of leaves depended on the phase of the 24-hour cycle in which they were subjected to 10ºC