Der Glutamattransporter GLT1v, eine Spleißvariante von GLT1, kommt hauptsächlich im Zytoplasma von Neuronen vor. Es wurde gezeigt, dass GLT1v ein putatives PDZDomänen- Bindungsmotiv am C-Terminus enthält und mit PICK1, ein mit PKC interagierendes Protein, interagiert. Es ist daher denkbar, dass durch Interaktion zwischen GLT1v und PICK1 die GLT1v-Translokation über eine PKC-abhängigen Phosphorylierung reguliert wird. In der vorliegenden Untersuchung wurden kultivierte zerebelläre Körnerzellen aus der Maus benutzt, um mittels Immunzytochemie und Biotinilierung/Westernblot zu zeigen, ob eine GLT1v-Translokation über einen PKC-abhängigen Signalweg reguliert wird und sollte dies der Fall sein, ob diese Regulation vom elektrophysiologischen Status der zerebellären Körnerzellen abhängt. Vergleichstudien wurden mit EAAC1 durchgeführt. Die Körnerzellen wurden in einem Medium mit 27 mM KCl (chronisch depolarisierte Körnerzellen) und mit 5 mM KCl (ruhende Körnerzellen) kultiviert. Eine 30 minütige PKC-Aktivierung durch Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) ergab in ruhenden Körnerzellen eine 41 % bzw. 31 % (signifikante) Zunahme in der Zelloberflächenexposition von GLT1v bzw. EAAC1 im Vergleich zur Kontrolle. Vergleicht man Körnerzellen nach PMA- mit solchen nach 30 minütiger Staurosporinbehandlung (PKC-Inhibitor), so beträgt die Oberflächenzunahme nach der PMA-Behandlung bei GLT1v bzw. EAAC1 115% bzw. 69%. Zerebelläre Körnerzellen, die mit 27 mM KCl kultiviert wurden (chronische Depolarisation), ergaben demgegenüber keine signifikanten Änderungen in der Oberflächenexpression von GLT1v und EAAC1, beim Vergleich der verschiedenen experimentellen Bedingungen (PMA, Staurosporin). Die immunzytochemischen Untersuchungen ergaben, dass bei ruhenden Körnerzellen (5mM KCl) nach PKC-Aktivierung mittels PMA zahlreiche, große Varikositäten (präsynaptische Elemente der Neuriten) auftreten, die eine intensive Immunreaktivität für GLT1v und EAAC1 zeigen. Wir konnten auch nachweisen, dass beide Transporter in getrennten Vesikelpopulationen vorkommen. Die Immunelektronenmikroskopie am Kleinhirn der adulten Maus hat ergeben, dass GLT1v und EAAC1 in Varikositäten der Parallelfasern von Körnerzellen lokalisiert sind. Dieses in situ Ergebnis stimmt somit mit den kultivierten Körnerzellen überein. Insgesamt lassen die Untersuchungen den Schluss zu, dass die Oberflächenexpression von GLT1v und EAAC1 (1) ähnlich reguliert zu werden scheint, (2) in Varikositäten von glutamatergen Körnerzellen stattfindet, aus denen Glutamat freigesetzt wird, und (3) vom elektrophysiologischen Status der zerebellären Körnerzellen abhängt. / The glutamate transporter GLT1v, a splice variant of GLT1, is present mainly in the cytoplasm of neurons. It is shown that GLT1v contains a putative PDZ domain binding motif and interacts with PICK1, a protein kinase C (PKC) interacting protein. The interaction between GLT1v and PICK1 could regulate trafficking of GLT1v via PKC dependent phosphorylation. In the present study we used cultured cerebellar granule cells (CGCs) from mice to demonstrate, applying immunocytochemistry and biotinylation/ Western blotting, whether GLT1v trafficking is regulated by PKC and if so, whether this depends on the electrophysiologic state of CGCs. Comparative studies were performed with EAAC1. The CGCs were cultured in high-potassium medium (chronic depolarization of CGCs) and in low-potassium medium (resting CGCs). Stimulation of PKC by phorbolester resulted in resting CGCs in a 41% and 31% (significant) increase of cell surface localization of GLT1v and EAAC1, respectively, compared to controls, and a 115% and 69% increase, respectively, compared to staurosporine inhibition. No significant changes were observed in chronically depolarizing CGCs. In resting CGCs stimulation of PKC enhanced the formation of large varicosities in neurites showing intense immunoreactivity for GLT1v and EAAC1. We showed also that both transporters were contained in different vesicle populations, and were localized in situ in varicosities of CGC parallel fibres. These findings provide evidence that the surface exposition of GLT1v and EAAC1 (1) seems to be similarly regulated, (2) takes place in varicosities of glutamatergic CGCs, where glutamate is thought to be released, and (3) depends on the electrophysiologic state of CGCs.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:2050 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Karatas-Wulf, Emine Ufuk |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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