As células-tronco embrionárias (CTEs), extraídas da massa celular interna do blastocisto, tem como características principais a capacidade de auto-renovação e a pluripotência. Durante o desenvolvimento, as células perdem seu potencial de diferenciação e adquirem um perfil de expressão gênica mais restrito, modulado por mecanismos epigenéticos, assim como por microRNAs. Membros da família miR-29 têm como transcritos alvos enzimas responsáveis pela metilação da citosina em 5mC (DNMT3a e 3b) e também da desmetilação (TET1, 2 e 3) do DNA, pela hidroxilação de 5mC em 5hmC. Recentes trabalhos sugerem que a modulação do miR-29 sobre estes alvos teria um papel no início da diferenciação em CTEs de camundongos e no aumento de eficiência da geração de iPS em células humanas. No presente trabalho, buscou-se compreender o papel regulatório do miR-29a em seus alvos epigenéticos no contexto da pluripotência e no início da diferenciação com atRA. Para tanto, duas linhagens celulares pluripotentes humanas (H1 e NTera- 2) foram submetidas a indução de diferenciação com atRA e ao ganho de função do miR-29a durante quatro dias de cultivo para análises de expressão gênica. Ademais, em NT2, realizamos ensaios funcionais por microscopia de imunofluorescência quantitativa para avaliar os efeitos do ganho e perda de função do miR-29a, DNMT3b e TET1, sobre a expressão nuclear de OCT4 e os perfis globais de 5mC e 5hmC após 96 horas de transfecção. Neste ensaio, também avaliamos o papel específico da regulação pós-transcricional de DNMT3b e TET1 pelo miR-29a, utilizando moléculas bloqueadoras dos sítios alvo (TSB) do miR-29a nestes transcritos. Observamos que sob a indução do atRA, os níveis de expressão do miR- 29a e de seus genes alvos (com exceção de DNMT3b), assim como dos marcadores de endoderme e ectoderme, aumentaram, seguido da diminuição dos marcadores de pluripotência em ambas as linhagens. A transfecção de moléculas mímicas do miR-29a, reduziu os níveis de seus transcritos alvos após dois e quatro dias em NT2 e H1, além de reduzir os níveis nucleares de DNMT3b em NT2. Ainda, ocorreu um aumento na expressão de genes da endoderme, mesoderme e ectoderme em H1 e a queda da expressão gênica e nuclear de OCT4 em NT2. Com o uso de siRNA específicos, demonstramos que o knockdown dos níveis nucleares de DNMT3b foi acompanhado de uma queda nos níveis globais de 5mC e um aumento de OCT4 e de 5hmC. Já o knockdown de TET1, elevou os níveis de 5mC, mas também os níveis de 5hmC e OCT4 nuclear. As avaliações com o uso de TSB contra os sítios de ligação do miR-29a em seus transcritos alvo, TET1 e DNMT3b, demonstraram que em células NT2, o bloqueio da ligação do miR endógeno aos seus alvos resultam no aumento dos níveis globais de 5hmC, indicando que a regulação póstranscricional destes alvos pelo miR-29 teria um importante papel na regulação epigenética de células pluripotentes. / Embryonic stem cells (CTEs), extracted from the internal cell mass of the blastocyst, are main characterized by the capacity for self-renewal and pluripotency. During development, the cells lose their differentiation potential and acquire a restricter gene expression profile, modulated by epigenetic mechanisms, as microRNAs. Members of the miR-29 family have as target transcripts enzymes for cytosine methylation in 5mC (DNMT3a and 3b) and for DNA demethylation (TET1, 2 and 3), by hydroxylation of 5mC in 5hmC. Recent studies suggest that the modulation of miR-29 on these targets plays a role in early differentiation of mouse CTEs and in increasing human iPS cell generation efficiency. In the present study, we sought to understand the regulatory role of miR-29a in its epigenetic targets in the context of pluripotency and in early differentiation with atRA. For this, two human pluripotent cell lines (H1 and NTera-2) were submitted to differentiation induction with atRA and function gain of miR-29a during four days of culture for gene expression analysis. Furthermore, in NT2, we performed functional assays by quantitative immunofluorescence microscopy to evaluate the gain- and loss-of-function of miR-29a, DNMT3b and TET1 in the OCT4 nuclear expression and global profiles of 5mC and 5hC, 96 hours posttransfection. In this assay, we also evaluated the specific role of post-transcriptional regulation of DNMT3b and TET1 by miR-29a, using target site blocking molecules (TSB) of miR-29a. We observed that under the induction of atRA, the miR-29a expression levels and its target genes (except of DNMT3b), further the markers of endoderm and ectoderm, increased, followed by decreased pluripotency markers in both cell lines. Transfection of mimic molecules of miR-29a reduced the levels of their target transcripts after two and four days in NT2 and H1, and reduced nuclear levels of DNMT3b in NT2. In addition, the expression of endoderm, mesoderm and ectoderm genes increased in H1 and gene and nuclear expression of OCT4 decreased in NT2. With the use of specific siRNA, we demonstrated that the knockdown of nuclear levels of DNMT3b was accompanied by a drop in global 5mC levels and an increase of OCT4 and 5hmC. While, the knockdown of TET1 increased the levels of 5mC, 5hmC and nuclear OCT4. Evaluations using TSB against the miR- 29a binding sites in their target transcripts, TET1 and DNMT3b, show that in NT2 cells blocking the binding of endogenous miR to their targets results in an increase in global 5hmC levels, indicating that the post-transcriptional regulation of these targets by miR-29 would play an important role in the epigenetic regulation of pluripotent cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-26042018-113121 |
| Date | 31 August 2017 |
| Creators | Sarah Blima Paulino Leite |
| Contributors | Rodrigo Alexandre Panepucci, Flavio Vieira Meirelles |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Genética), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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