A produção de células-tronco induzidas (iPSC) a partir de fibroblasto fetal canino abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade para terapias alternativas na medicina veterinária. Neste contexto, este trabalho investigou metodologias adequadas avaliando a eficiência destas, para a produção de células-tronco pluripotentes no modelo canino in vitro (CTE-like), uma vez que a produção de células-tronco embrionárias verdadeiras, cultivadas a partir da MCI de blastocistos, ainda não foi completamente caracterizada em animais domésticos. Os experimentos visaram o aumento do conhecimento de fatores envolvidos no processo de reprogramação em cães, bem como a produção de tais linhagens e sua completa caracterização. No primeiro experimento, foi comparada a infecção retroviral, já padronizada por diversos grupos, com a reprogramação epissomal, inédita para a espécie, na tentativa de induzir células à pluripotência sem a integração viral, e ainda, estratégias para o aumento da eficiência de reprogramação, onde o plasmídeo epissomal foi somado a fatores de transcrição. A reprogramação epissomal gerou colônias quando acrescida do fator c-MYC, que provavelmente, aumentou a proliferação destas células produzindo colônias iPS com morfologia típica e positivas para o teste da fosfatase alcalina. Tais resultados, ainda preliminares pra conclusões, são essenciais para o processo de obtenção de linhagens sem a integração viral, aumentando a aplicabilidade na terapia celular. No segundo experimento objetivou-se avaliar os fatores OCT4 e SOX2 associados a proteínas repórteres. Os fibroblastos que receberam estes fatores, foram analisados por citometria de fluxo, permitindo a avaliação da influência de cada fator no processo de reprogramação, além de permitir a separação (sorting) das células que integraram o gene, aumentando a eficiência de reprogramação e o conhecimento biológico dos mecanismos de integração rastreados por uma proteína repórter. A análise por microscopia de fluorescência revelou que a distribuição de proteínas repórteres foi semelhante entre as duas diferentes construções proteicas e que não se restringe a uma região da célula em particular. OCT4 e SOX2 mostraram uma elevada expressão exógena de cada gene alvo, bem como células dupla positivas. No entanto, nenhuma interação foi observada pelo menos 6 dias após a transdução. O último capítulo experimental descreveu o mecanismo de reprogramação por integração lentiviral para indução da pluripotência em fibroblastos fetais de cão. As linhagens obtidas e completamente caracterizadas neste estudo foram independentes de LIF ou qualquer outra suplementação com inibidores, resistentes ao repique enzimático (Tryple Express), sendo apenas bFGF dependentes. Foram obtidas 66 linhagens clonais, das quais 10 (7 h+mOSKM e 3hOSKM) se mantiveram por 15 ou mais passagens e foram utilizadas para todos os testes de caracterização in vitro, com eficiência máxima de reprogramação de 0,001%. Todas as colônias foram positivas para o teste da fosfatase alcalina, bem como formaram corpos embrióides e se diferenciaram de forma espontânea, além de expressarem altos níveis dos fatores endógenos OCT4 e SOX2. In vivo, as colônias foram capazes de desenvolver tumor 120 dias após a inoculação (confirmado por análise histopatológica) comprovando sua origem predominantemente mesodérmica. A integridade cromossomal das linhagens foi avaliada por hidridização FISH, que não evidenciou qualquer tipo de anomalia. A completa caracterização de tais linhagens, bem como os experimentos não integrativos e com fatores associados a proteínas repórteres, aumentam o conhecimento da tecnologia de reprogramação, estabelecendo novas estratégias para indução da pluripotência de forma mais eficaz e segura para seu uso em testes clínicos e terapia celular / The production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from canine fetal fibroblast opens new ways for obtaining pluripotent cells and study its applicability for alternative therapies in veterinary medicine. In this context, this study investigated appropriate methods for producing pluripotent stem cells using a in vitro canine model (ESC-like), so far the production of true embryonic stem cells from ICM cultured blastocysts has not been fully characterized in domestic animals. The experiments aimed at increasing knowledge of the factors involved in reprogramming process in dogs, as well as the production of such strains and complete characterization. In the first experiment, a retroviral infection was compared to episomal reprogramming (never done for this specie) in an attempt to induce cells to pluripotency state without viral integration, also to observe the development of cells receiving separately the episomal plasmid plus transcription factors. The generation of colonies was possible only in the episomal plus c-MYC factor group, leading to increased cell proliferation producing iPS colonies with typical morphology and positive for the alkaline phosphatase detection. These results, so far as preliminary conclusions, are essential to obtaining strains without viral integration, increasing its applicability for clinical cell therapy. In the second experiment, we aimed to evaluate the OCT4 and SOX2 factors associated with fluorescent reporter proteins. These were analyzed by flow cytometry allowing the performance evaluation of each factor on the reprogramming process the fluorescence activated separation of cells containing the integrated gene, increasing the enriching the efficiency of reprogramming. Fluorescence microscopy analysis showed that the distribution of reporter protein was similar between the two different protein structures and not restricted to a particular cell region. OCT4 and SOX2 showed a high exogenous expression of each target gene, and double positive cells. However, no colony formation was observed at least 6 days after transduction. The last experimental chapter aimed to described the reprogramming mechanism of lentiviral integration to induce pluripotency in dog fetal fibroblasts. The lines obtained were fully characterized in this study, showing independency of LIF or any other supplemental inhibitors, resistance to enzymatic process (Tryple Express) and bFGF dependency only. A total of 66 clonal strains were obtained (hOSKM and h+mOSKM) while 10 (7 h+m and 3h) were maintained for 15 or more passages and used for in vitro characterization tests, with maximum efficiency of reprogramming 0.001% . All colonies were positive for the alkaline phosphatase detection, embryoid bodies formation, spontaneously differentiated and expressed high levels of endogenous OCT4 and SOX2. In vivo, the colonies were able to developed tumors 120 days after inoculation (confirmed via histopathology analysis), with predominantly mesodermal tissues. Chromosomal evaluations were made by FISH hybridization showing no chromosomal abnormality in iPSCs canine lines. The fully characterization of such lines as well as non-integrated experiments and factors associated via reporter proteins increases the knowledge of the iPSCs technology, establishing new strategies for more efficient and safe induction of pluripotency for potential use in cell therapy and clinical trials

Células somáticas podem ser reprogramadas para um estádio pluripotente (iPS) adquirindo propriedades semelhantes às células-tronco embrionárias (CTE). O interesse nas células pluripotentes reside em sua capacidade de originar todos os tipos de células somáticas e germinativas, podendo ser aplicadas no tratamento de diversas doenças crônico-degenerativas. Desde sua primeira descrição, diferentes combinações de moléculas já foram utilizadas com sucesso para a geração de iPS. Entretanto, os mecanismos pelos quais a transdução de fatores específicos atuam na reprogramação celular não estão esclarecidos. Este trabalho teve como objetivo induzir a expressão do gene TCL1 em fibroblastos humanos e avaliar a ação deste gene no processo de reprogramação celular. Para tal, foram estabelecidas linhagens celulares de fibroblastos humanos com a expressão estável de TCL1 e essas células foram cultivadas em condições de pluripotência. Após a modificação, as células adquiriram morfologia sugestiva de colônias de células-tronco pluripotentes com marcação positiva para a proteína intracelular NANOG e com níveis de expressão gênica elevados de SOX2, MYC, NANOG, LIN28, TP53, CDH1 e reduzidos de SLUG, quando comparados com fibroblastos virgens. Com intuito de avaliar as alterações transcricionais decorrentes da inserção de TCL1 e do cultivo em condições favorecedoras da pluripotência, foram comparados os perfis de expressão gênica obtidos por microarray de diferentes bibliotecas, incluindo as células modificadas com TCL1, fibroblastos, CTE e iPS. A análise exploratória dos dados mostrou que a introdução de TCL1 modificou o perfil de expressão dos fibroblastos e as células resultantes adquiriram um perfil transcricional que se assemelhou mais com o perfil de células pluripotentes do que com o perfil das células somáticas de origem. A análise diferencial dos dados revelou que vias importantes para a reprogramação celular foram moduladas pela inserção de TCL1, como: Pluripotência de células-tronco embrionárias humanas, Sinalização Wnt/?-catenina e Regulação da transição epitelial-mesenquimal. Os resultados deste trabalho propõem que TCL1 interage com AKT1, aumentando sua atividade, que por sua vez ativa NANOG, acionando a maquinaria de pluripotência e, contribuindo assim, para a reprogramação celular / Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent stage (iPS) acquiring properties similar to embryonic stem cells (ESC). The interest in pluripotent stem cells lies in their ability to originate all types of somatic and germ cells, and in their possible application in the treatment of various chronic and degenerative diseases. Since its first description, different combinations of molecules have been successfully used for the generation of iPS. However, the mechanisms by which the transduction of specific factors act on cell reprogramming remain unclear. This study aimed to induce the TCL1 gene expression in human fibroblasts and to evaluate its effect on the cell reprogramming process. We established human fibroblast cell lines with stable expression of TCL1 and cultured these cells under pluripotency conditions. After modification, the cells acquired a pluripotent stem cells-like morphology, stained positive for intracellular protein NANOG, expressed high levels of SOX2, MYC, NANOG, LIN28, TP53, CDH1, and reduced levels of SLUG, as compared to nontransduced fibroblasts. In order to evaluate the transcriptional changes resulting from the insertion of TCL1 and from the culture conditions favoring the pluripotency, we compared the gene expression profiles obtained by microarray among different libraries, including the TCL1 modified cells, fibroblasts, ESC and iPS. Exploratory data analysis showed that the introduction of TCL1 gene modified the expression profile of cells and the resulting fibroblasts acquired a transcriptional profile that resembled more to the profile of pluripotent cells than with the profile of the somatic cells. Differential data analysis revealed that pathways important for cell reprogramming were modulated by TCL1 insertion such as: Human embryonic pluripotent stem cell pathway, Wnt / ?-catenin signaling pathway, and Regulation of epithelial-mesenchymal transition. The results of this study suggest that TCL1 interacts with AKT1, increasing its activity, which in turn activates NANOG, triggering the machinery of pluripotency and thus contribute to cellular reprogramming.

As mitocôndrias são organelas semiautonômicas, portadoras do próprio DNA, o mtDNA e responsáveis pela produção de energia celular na forma de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa. Atualmente, diferentes tipos de doenças, como distrofias musculares e diversos tipos de câncer, estão associadas à alteração nas moléculas de mtDNA. Na década de 70 um modelo a partir do cultivo celular com brometo de etídio (EtBr) foi desenvolvido com o objetivo de se criar uma linhagem celular depletada de cópias de mtDNA. Desde então os mais variados estudos foram realizados e diversos tipos celulares foram submetidos à depleção do mtDNA. Este projeto teve como objetivos criar um modelo de cultivo celular somático na espécie bovina com depleção de cópias de mtDNA para investigar a resposta da célula a esta condição; avaliar como as células depletadas se comportam na ausência de EtBr, além da utilização destas células no processo de reprogramação celular por indução gênica na tentativa de avaliar o efeito do numero de cópias de mtDNA na indução na espécie bovina. Para tanto foram desenvolvidos três experimentos; Experimento 1- Depleção de mtDNA a partir da utilização do brometo de etídeo; Experimento 2 Repleção do mtDNA; e Experimento 3 Utilização de células bovinas depletadas no sistema de reprogramação nuclear. Todos os experimentos foram avaliados quanto a quantidade de cópias de mtDNA e expressão gênica para os genes Bax, Bcl2 e Tfam. Ademais, os experimentos 1 e 2 foram avaliados quanto a viabilidade celular e apenas o experimento 1 foi avaliado quanto ao crescimento e morfologia celular. O experimento 1 foi avaliado durante o cultivo celular nos períodos D0, D4, D7, D10 e D13, com os grupos experimentais controle (EtBr-C) e tratado com 100 ng/mL de brometo de etídio (EtBr-T), quanto a núero de cópias do mtDNA, o grupo EtBr-T diferiu do grupo EtBr-C (P=0,0459), apresentando menor número de cópias de mtDNA; menor taxa crescimento celular (P<0,05), porém sem alteração na morfologia celular, e na expressão dos genes descritos acima. No experimento da repleção, não houve diferença no número de cópias de mtDNA, entre os grupos EtBr-T e EtBr-R, indicativo de que as células atingiram o estado rho 0 ou que necessitam de mais tempo para ativar a replicação do mtDNA; quanto a viabilidade celular, houve diferença entres os grupos, quanto a expressão gênica, com aumento do Bax e do Bcl-2 para o grupo EtBr-T; O grupo EtBr-R apresentou queda do Bcl-2; para o Tfam houve aumento para o grupo EtBr-T e uma queda para o grupo EtBr-R. Quanto ao experimento 3, não foi possível observar sinais de pluripotência, porém foi detectada uma queda na quantidade de mtDNA dos dois grupos tratados por EtBr (EtBr com e sem Stemcca) e o grupo controle com Stemcca. Para analise de expressão gênica, não houve diferenças entre os grupos em relação ao Tfam. Quanto ao Bax, os grupos controle com Stemcca, controle sem Stemcca e EtBr sem Stemcca não diferiram, e o ultimo também não apresentou diferença quando comparado ao grupo EtBr com Stemcca. Para o Bcl-2, os grupos controle sem Stemcca e EtBr com Stemcca não apresentaram diferenças entre si; o grupo controle sem Stemcca não apresentou diferença quando comparado aos grupos controle com Stemcca e EtBr sem Stemcca. Concluindo, este trabalho no nosso conhecimento, descreve pela primeira vez a produção de células bovinas Rho 0 e discute sobre a relação da função mitocondrial e o processo de reprogramação celular. / Mitochondria are semi autonomic organelles which present their own DNA (mtDNA); are in charge of cell energy production as ATP through oxidative phosphorylation. Currently, different types of diseases like muscular distrofy; different types of cancer are associated to alterations of mtDNA molecules. In the 70\'s a model based on cell culture with ethidium bromide (EtBr) was developed in order to create a cell line depleted of mtDNA. Since then, a variety of studies were realized; diverse cell types were submited to mtDNA depletion. This project had as objective creating a model of somatic cell culture in bovine species with depletion of mtDNA copies, in order to investigate cell response to this condition; to analyze depleted cell behavior in the absence of EtBr, besides using this depleteded cell in a reprogramming cell process by genic induction in order evaluate the effect of the number of mtDNA copies during induction in bovine species. Therefore three experiments were developed: Experiment-1 Depletion of mtDNA using ethidium bromide. Experiment-2 repletion of mtDNA; Experiment-3 usage of depleted bovine cells in reprogramming nuclear system. Cell experiments were analyzed according to the quantity of mtDNA copies; genic expression for Bax, BCl2; Tfam genes. Also, experiments 1; 2 were analyzed on cell viability; only experiment 1 was analyzed regarding cell morphology; growth. Experiment-1 was analyzed during cell culture on periods D0, D4, D7, D10, D13, with control experimental groups (EtBr-C),; treated with 100 ng/mL ethidium bromide (EtBr-T); relating to mtDNA quantification the EtBr-T group differed from EtBr-C (P=0,0459) presenting a smaller number of mtDNA copies; smaller growth rate (P<0,05); although there was no differences on cell morphology as there was also no difference related to genic expression of the previous stated genes. Repletion experiment showed no differences about the number of mtDNA copies between EtBr-T; EtBr-R groups, indicating this cells reached Rho0 state or that they need more time to activate mtDNA replication; about cell viability, there were no differences among the groups; relating to genic expression there was an increase of Bax; BCl-2 for EtBt-T group; EtBr-R group showed decrease of BCl-2; for Tfam there was an increase for EtBr-T group; a decrease for EtBr-R. Relating to Experiment-3 it was impossible to notice signs of pluripotency, but we could see a decrease in the amount of mtDNA in both groups treated with EtBr (EtBr with; without STEMCCA) as in control group with STEMCCA. Genic expression analysis didn\'t show differences related to Tfam. Regarding to BAX, both control groups (with; without STEMCCA); EtBr without STEMCCA didn\'t differ from each other,; the last one also didn\'t show any difference when compared to EtBt with STEMCCA group. For BCl-2, control group without STEMCCA; EtBr with STEMCCA didn\'t show differences among each other; control group without SEMCCA didn\'t show differences when compared to control group with STEMCCA; EtBr without STEMCCA. Concluding, this work, regarding our knowledge, describes for the first time, production of bovine Rho0 cells; debates about the relationship among mitochondrial function; the process of cell reprogramation.

Células somáticas podem ser reprogramadas para um estádio pluripotente (iPS) adquirindo propriedades semelhantes às células-tronco embrionárias (CTE). O interesse nas células pluripotentes reside em sua capacidade de originar todos os tipos de células somáticas e germinativas, podendo ser aplicadas no tratamento de diversas doenças crônico-degenerativas. Desde sua primeira descrição, diferentes combinações de moléculas já foram utilizadas com sucesso para a geração de iPS. Entretanto, os mecanismos pelos quais a transdução de fatores específicos atuam na reprogramação celular não estão esclarecidos. Este trabalho teve como objetivo induzir a expressão do gene TCL1 em fibroblastos humanos e avaliar a ação deste gene no processo de reprogramação celular. Para tal, foram estabelecidas linhagens celulares de fibroblastos humanos com a expressão estável de TCL1 e essas células foram cultivadas em condições de pluripotência. Após a modificação, as células adquiriram morfologia sugestiva de colônias de células-tronco pluripotentes com marcação positiva para a proteína intracelular NANOG e com níveis de expressão gênica elevados de SOX2, MYC, NANOG, LIN28, TP53, CDH1 e reduzidos de SLUG, quando comparados com fibroblastos virgens. Com intuito de avaliar as alterações transcricionais decorrentes da inserção de TCL1 e do cultivo em condições favorecedoras da pluripotência, foram comparados os perfis de expressão gênica obtidos por microarray de diferentes bibliotecas, incluindo as células modificadas com TCL1, fibroblastos, CTE e iPS. A análise exploratória dos dados mostrou que a introdução de TCL1 modificou o perfil de expressão dos fibroblastos e as células resultantes adquiriram um perfil transcricional que se assemelhou mais com o perfil de células pluripotentes do que com o perfil das células somáticas de origem. A análise diferencial dos dados revelou que vias importantes para a reprogramação celular foram moduladas pela inserção de TCL1, como: Pluripotência de células-tronco embrionárias humanas, Sinalização Wnt/?-catenina e Regulação da transição epitelial-mesenquimal. Os resultados deste trabalho propõem que TCL1 interage com AKT1, aumentando sua atividade, que por sua vez ativa NANOG, acionando a maquinaria de pluripotência e, contribuindo assim, para a reprogramação celular / Somatic cells can be reprogrammed into pluripotent stage (iPS) acquiring properties similar to embryonic stem cells (ESC). The interest in pluripotent stem cells lies in their ability to originate all types of somatic and germ cells, and in their possible application in the treatment of various chronic and degenerative diseases. Since its first description, different combinations of molecules have been successfully used for the generation of iPS. However, the mechanisms by which the transduction of specific factors act on cell reprogramming remain unclear. This study aimed to induce the TCL1 gene expression in human fibroblasts and to evaluate its effect on the cell reprogramming process. We established human fibroblast cell lines with stable expression of TCL1 and cultured these cells under pluripotency conditions. After modification, the cells acquired a pluripotent stem cells-like morphology, stained positive for intracellular protein NANOG, expressed high levels of SOX2, MYC, NANOG, LIN28, TP53, CDH1, and reduced levels of SLUG, as compared to nontransduced fibroblasts. In order to evaluate the transcriptional changes resulting from the insertion of TCL1 and from the culture conditions favoring the pluripotency, we compared the gene expression profiles obtained by microarray among different libraries, including the TCL1 modified cells, fibroblasts, ESC and iPS. Exploratory data analysis showed that the introduction of TCL1 gene modified the expression profile of cells and the resulting fibroblasts acquired a transcriptional profile that resembled more to the profile of pluripotent cells than with the profile of the somatic cells. Differential data analysis revealed that pathways important for cell reprogramming were modulated by TCL1 insertion such as: Human embryonic pluripotent stem cell pathway, Wnt / ?-catenin signaling pathway, and Regulation of epithelial-mesenchymal transition. The results of this study suggest that TCL1 interacts with AKT1, increasing its activity, which in turn activates NANOG, triggering the machinery of pluripotency and thus contribute to cellular reprogramming.

As mitocôndrias são organelas semiautonômicas, portadoras do próprio DNA, o mtDNA e responsáveis pela produção de energia celular na forma de ATP, através do processo de fosforilação oxidativa. Atualmente, diferentes tipos de doenças, como distrofias musculares e diversos tipos de câncer, estão associadas à alteração nas moléculas de mtDNA. Na década de 70 um modelo a partir do cultivo celular com brometo de etídio (EtBr) foi desenvolvido com o objetivo de se criar uma linhagem celular depletada de cópias de mtDNA. Desde então os mais variados estudos foram realizados e diversos tipos celulares foram submetidos à depleção do mtDNA. Este projeto teve como objetivos criar um modelo de cultivo celular somático na espécie bovina com depleção de cópias de mtDNA para investigar a resposta da célula a esta condição; avaliar como as células depletadas se comportam na ausência de EtBr, além da utilização destas células no processo de reprogramação celular por indução gênica na tentativa de avaliar o efeito do numero de cópias de mtDNA na indução na espécie bovina. Para tanto foram desenvolvidos três experimentos; Experimento 1- Depleção de mtDNA a partir da utilização do brometo de etídeo; Experimento 2 Repleção do mtDNA; e Experimento 3 Utilização de células bovinas depletadas no sistema de reprogramação nuclear. Todos os experimentos foram avaliados quanto a quantidade de cópias de mtDNA e expressão gênica para os genes Bax, Bcl2 e Tfam. Ademais, os experimentos 1 e 2 foram avaliados quanto a viabilidade celular e apenas o experimento 1 foi avaliado quanto ao crescimento e morfologia celular. O experimento 1 foi avaliado durante o cultivo celular nos períodos D0, D4, D7, D10 e D13, com os grupos experimentais controle (EtBr-C) e tratado com 100 ng/mL de brometo de etídio (EtBr-T), quanto a núero de cópias do mtDNA, o grupo EtBr-T diferiu do grupo EtBr-C (P=0,0459), apresentando menor número de cópias de mtDNA; menor taxa crescimento celular (P<0,05), porém sem alteração na morfologia celular, e na expressão dos genes descritos acima. No experimento da repleção, não houve diferença no número de cópias de mtDNA, entre os grupos EtBr-T e EtBr-R, indicativo de que as células atingiram o estado rho 0 ou que necessitam de mais tempo para ativar a replicação do mtDNA; quanto a viabilidade celular, houve diferença entres os grupos, quanto a expressão gênica, com aumento do Bax e do Bcl-2 para o grupo EtBr-T; O grupo EtBr-R apresentou queda do Bcl-2; para o Tfam houve aumento para o grupo EtBr-T e uma queda para o grupo EtBr-R. Quanto ao experimento 3, não foi possível observar sinais de pluripotência, porém foi detectada uma queda na quantidade de mtDNA dos dois grupos tratados por EtBr (EtBr com e sem Stemcca) e o grupo controle com Stemcca. Para analise de expressão gênica, não houve diferenças entre os grupos em relação ao Tfam. Quanto ao Bax, os grupos controle com Stemcca, controle sem Stemcca e EtBr sem Stemcca não diferiram, e o ultimo também não apresentou diferença quando comparado ao grupo EtBr com Stemcca. Para o Bcl-2, os grupos controle sem Stemcca e EtBr com Stemcca não apresentaram diferenças entre si; o grupo controle sem Stemcca não apresentou diferença quando comparado aos grupos controle com Stemcca e EtBr sem Stemcca. Concluindo, este trabalho no nosso conhecimento, descreve pela primeira vez a produção de células bovinas Rho 0 e discute sobre a relação da função mitocondrial e o processo de reprogramação celular. / Mitochondria are semi autonomic organelles which present their own DNA (mtDNA); are in charge of cell energy production as ATP through oxidative phosphorylation. Currently, different types of diseases like muscular distrofy; different types of cancer are associated to alterations of mtDNA molecules. In the 70\'s a model based on cell culture with ethidium bromide (EtBr) was developed in order to create a cell line depleted of mtDNA. Since then, a variety of studies were realized; diverse cell types were submited to mtDNA depletion. This project had as objective creating a model of somatic cell culture in bovine species with depletion of mtDNA copies, in order to investigate cell response to this condition; to analyze depleted cell behavior in the absence of EtBr, besides using this depleteded cell in a reprogramming cell process by genic induction in order evaluate the effect of the number of mtDNA copies during induction in bovine species. Therefore three experiments were developed: Experiment-1 Depletion of mtDNA using ethidium bromide. Experiment-2 repletion of mtDNA; Experiment-3 usage of depleted bovine cells in reprogramming nuclear system. Cell experiments were analyzed according to the quantity of mtDNA copies; genic expression for Bax, BCl2; Tfam genes. Also, experiments 1; 2 were analyzed on cell viability; only experiment 1 was analyzed regarding cell morphology; growth. Experiment-1 was analyzed during cell culture on periods D0, D4, D7, D10, D13, with control experimental groups (EtBr-C),; treated with 100 ng/mL ethidium bromide (EtBr-T); relating to mtDNA quantification the EtBr-T group differed from EtBr-C (P=0,0459) presenting a smaller number of mtDNA copies; smaller growth rate (P<0,05); although there was no differences on cell morphology as there was also no difference related to genic expression of the previous stated genes. Repletion experiment showed no differences about the number of mtDNA copies between EtBr-T; EtBr-R groups, indicating this cells reached Rho0 state or that they need more time to activate mtDNA replication; about cell viability, there were no differences among the groups; relating to genic expression there was an increase of Bax; BCl-2 for EtBt-T group; EtBr-R group showed decrease of BCl-2; for Tfam there was an increase for EtBr-T group; a decrease for EtBr-R. Relating to Experiment-3 it was impossible to notice signs of pluripotency, but we could see a decrease in the amount of mtDNA in both groups treated with EtBr (EtBr with; without STEMCCA) as in control group with STEMCCA. Genic expression analysis didn\'t show differences related to Tfam. Regarding to BAX, both control groups (with; without STEMCCA); EtBr without STEMCCA didn\'t differ from each other,; the last one also didn\'t show any difference when compared to EtBt with STEMCCA group. For BCl-2, control group without STEMCCA; EtBr with STEMCCA didn\'t show differences among each other; control group without SEMCCA didn\'t show differences when compared to control group with STEMCCA; EtBr without STEMCCA. Concluding, this work, regarding our knowledge, describes for the first time, production of bovine Rho0 cells; debates about the relationship among mitochondrial function; the process of cell reprogramation.

A produção de células-tronco induzidas (iPSC) a partir de fibroblasto fetal canino abre caminhos para a obtenção de células pluripotentes e o estudo de sua aplicabilidade para terapias alternativas na medicina veterinária. Neste contexto, este trabalho investigou metodologias adequadas avaliando a eficiência destas, para a produção de células-tronco pluripotentes no modelo canino in vitro (CTE-like), uma vez que a produção de células-tronco embrionárias verdadeiras, cultivadas a partir da MCI de blastocistos, ainda não foi completamente caracterizada em animais domésticos. Os experimentos visaram o aumento do conhecimento de fatores envolvidos no processo de reprogramação em cães, bem como a produção de tais linhagens e sua completa caracterização. No primeiro experimento, foi comparada a infecção retroviral, já padronizada por diversos grupos, com a reprogramação epissomal, inédita para a espécie, na tentativa de induzir células à pluripotência sem a integração viral, e ainda, estratégias para o aumento da eficiência de reprogramação, onde o plasmídeo epissomal foi somado a fatores de transcrição. A reprogramação epissomal gerou colônias quando acrescida do fator c-MYC, que provavelmente, aumentou a proliferação destas células produzindo colônias iPS com morfologia típica e positivas para o teste da fosfatase alcalina. Tais resultados, ainda preliminares pra conclusões, são essenciais para o processo de obtenção de linhagens sem a integração viral, aumentando a aplicabilidade na terapia celular. No segundo experimento objetivou-se avaliar os fatores OCT4 e SOX2 associados a proteínas repórteres. Os fibroblastos que receberam estes fatores, foram analisados por citometria de fluxo, permitindo a avaliação da influência de cada fator no processo de reprogramação, além de permitir a separação (sorting) das células que integraram o gene, aumentando a eficiência de reprogramação e o conhecimento biológico dos mecanismos de integração rastreados por uma proteína repórter. A análise por microscopia de fluorescência revelou que a distribuição de proteínas repórteres foi semelhante entre as duas diferentes construções proteicas e que não se restringe a uma região da célula em particular. OCT4 e SOX2 mostraram uma elevada expressão exógena de cada gene alvo, bem como células dupla positivas. No entanto, nenhuma interação foi observada pelo menos 6 dias após a transdução. O último capítulo experimental descreveu o mecanismo de reprogramação por integração lentiviral para indução da pluripotência em fibroblastos fetais de cão. As linhagens obtidas e completamente caracterizadas neste estudo foram independentes de LIF ou qualquer outra suplementação com inibidores, resistentes ao repique enzimático (Tryple Express), sendo apenas bFGF dependentes. Foram obtidas 66 linhagens clonais, das quais 10 (7 h+mOSKM e 3hOSKM) se mantiveram por 15 ou mais passagens e foram utilizadas para todos os testes de caracterização in vitro, com eficiência máxima de reprogramação de 0,001%. Todas as colônias foram positivas para o teste da fosfatase alcalina, bem como formaram corpos embrióides e se diferenciaram de forma espontânea, além de expressarem altos níveis dos fatores endógenos OCT4 e SOX2. In vivo, as colônias foram capazes de desenvolver tumor 120 dias após a inoculação (confirmado por análise histopatológica) comprovando sua origem predominantemente mesodérmica. A integridade cromossomal das linhagens foi avaliada por hidridização FISH, que não evidenciou qualquer tipo de anomalia. A completa caracterização de tais linhagens, bem como os experimentos não integrativos e com fatores associados a proteínas repórteres, aumentam o conhecimento da tecnologia de reprogramação, estabelecendo novas estratégias para indução da pluripotência de forma mais eficaz e segura para seu uso em testes clínicos e terapia celular / The production of induced pluripotent stem cells (iPSC) from canine fetal fibroblast opens new ways for obtaining pluripotent cells and study its applicability for alternative therapies in veterinary medicine. In this context, this study investigated appropriate methods for producing pluripotent stem cells using a in vitro canine model (ESC-like), so far the production of true embryonic stem cells from ICM cultured blastocysts has not been fully characterized in domestic animals. The experiments aimed at increasing knowledge of the factors involved in reprogramming process in dogs, as well as the production of such strains and complete characterization. In the first experiment, a retroviral infection was compared to episomal reprogramming (never done for this specie) in an attempt to induce cells to pluripotency state without viral integration, also to observe the development of cells receiving separately the episomal plasmid plus transcription factors. The generation of colonies was possible only in the episomal plus c-MYC factor group, leading to increased cell proliferation producing iPS colonies with typical morphology and positive for the alkaline phosphatase detection. These results, so far as preliminary conclusions, are essential to obtaining strains without viral integration, increasing its applicability for clinical cell therapy. In the second experiment, we aimed to evaluate the OCT4 and SOX2 factors associated with fluorescent reporter proteins. These were analyzed by flow cytometry allowing the performance evaluation of each factor on the reprogramming process the fluorescence activated separation of cells containing the integrated gene, increasing the enriching the efficiency of reprogramming. Fluorescence microscopy analysis showed that the distribution of reporter protein was similar between the two different protein structures and not restricted to a particular cell region. OCT4 and SOX2 showed a high exogenous expression of each target gene, and double positive cells. However, no colony formation was observed at least 6 days after transduction. The last experimental chapter aimed to described the reprogramming mechanism of lentiviral integration to induce pluripotency in dog fetal fibroblasts. The lines obtained were fully characterized in this study, showing independency of LIF or any other supplemental inhibitors, resistance to enzymatic process (Tryple Express) and bFGF dependency only. A total of 66 clonal strains were obtained (hOSKM and h+mOSKM) while 10 (7 h+m and 3h) were maintained for 15 or more passages and used for in vitro characterization tests, with maximum efficiency of reprogramming 0.001% . All colonies were positive for the alkaline phosphatase detection, embryoid bodies formation, spontaneously differentiated and expressed high levels of endogenous OCT4 and SOX2. In vivo, the colonies were able to developed tumors 120 days after inoculation (confirmed via histopathology analysis), with predominantly mesodermal tissues. Chromosomal evaluations were made by FISH hybridization showing no chromosomal abnormality in iPSCs canine lines. The fully characterization of such lines as well as non-integrated experiments and factors associated via reporter proteins increases the knowledge of the iPSCs technology, establishing new strategies for more efficient and safe induction of pluripotency for potential use in cell therapy and clinical trials

O transplante de células-tronco hematopoéticas (CTHs) é o tipo de terapia celular mais usada atualmente. As células-tronco da medula óssea humana, do sangue periférico mobilizado e do sangue do cordão umbilical (SCU) são as únicas fontes de células utilizadas clinicamente para a recuperação hematopoética, mas elas têm uma disponibilidade limitada e apenas um terço dos pacientes apresentam um doador compatível. Uma fonte alternativa para suprir esta demanda seriam as células hematopoéticas derivadas a partir de células-tronco pluripotentes. Célulastronco embrionárias (CTE) são um tipo de células pulripotentes caracterizadas por sua capacidade ilimitada de autorrenovação e diferenciação em todas as células especializadas do indivíduo adulto. A alta capacidade de diferenciação dessas células em linhagens específicas por métodos de indução in vitro faz delas grandes promessas para o desenvolvimento de novas tecnologias aplicáveis à medicina regenerativa e terapia celular. Entretanto, ainda é necessário determinar se células-tronco hematopoéticas (CTH) geradas a partir de células pluripotentes são funcionais in vivo. Assim, o objetivo desse estudo consistiu no desenvolvimento de um modelo animal para o transplante de células hematopoéticas humanas provenientes de células pluripotentes e utilizamos CTH de sangue de cordão umbilical como controle. Para tanto, realizamos a padronização da dose de irradiação subletal nos camundongos NOD / SCID IL2R ? null (NSG) e utilizamos duas concentrações de células, 1x106 e 0,75x106 de células hematopoéticas diferenciadas a partir de CTE e células do cordão umbilical. Os animais que receberam as células do SCU apresentaram uma taxa mais elevada de enxertia em comparação aos que receberam ás células diferenciadas a partir de CTE humanas. Foi confirmado que após quinze dias do transplante, a hematopoese é restabelecida e que células CD45+ humanas estavam presentes, porém em baixas quantidades. Sobretudo, os resultados aqui apresentados enfatizaram o descrito na literatura, porém não ultrapassando a 1,5% de enxertia na medula óssea. Estes dados indicaram que os camundongos NSG proporcionaram um microambiente hematopoético favorável para as CTE humanas porém, essas células precisam ser investigadas no que tange aos fatores que aumentem de sua duração in vivo, otimizando a enxertia. / Hematopoietic stem cell transplantation (HSC) is the most widely used type of cell therapy nowadays. Human bone marrow, mobilized peripheral blood, and stem cells in the umbilical cord (UC) are the only sources of cells used clinically for hematopoietic recovery, but they have limited availability and only a third of patients have a matching donor. An alternative source to supply this demand would be hematopoietic cells derived from pluripotent stem cells. Embryonic stem cells (ESC) are a type of pulp-like cells characterized by their unlimited capacity for self-renewal and differentiation in all specialized cells of the adult individual. The high differentiation capacity of these cells in specific strains by in vitro induction methods makes great promises for the development of new technologies applicable to regenerative medicine and cell therapy. However, it remains to be determined whether hematopoietic stem cells (HTC) generated from pluripotent cells are functional in vivo. Thus, the objective of this study was to develop an animal model for the transplantation of human hematopoietic cells from pluripotent cells and to use HTC in the umbilical cord blood as a control. To do so, we performed standardization of the sublethal irradiation dose on the NOD / SCID IL2R ? null (NSG) mice and used two concentrations of cells, 1x106 and 0.75x106 hematopoietic cells differentiated from ESC and umbilical cord cells. The animals that received UC cells had a higher rate of grafting compared to those that received the differentiated cells from the human ESC. It was confirmed that after fifteen days of transplantation, hematopoiesis restored and that human CD45+ cells were present, but in low amounts. Above all, the results presented here emphasize the described in the literature, but not exceeding 1.5% of grafting in bone marrow. These data indicated that the NSG mice provided a hematopoietic microenvironment favorable to the human ESC, however, these cells need to be investigated with regard to factors that increase their duration in vivo, optimizing grafting.

As células pluripotentes (CPs), em teoria, são capazes de dar origem a todos os mais de 200 tipos de células do organismo. Na natureza, há três tipos de células pluripotentes: células-tronco embrionárias, células germinais embrionárias e células de carcinoma embrionário. As características das CPs têm permitido um importante avanço para a pesquisa básica e apontam uma grande aplicabilidade na medicina regenerativa. No núcleo das CPs existem fatores atuantes responsáveis pela manutenção da identidade pluripotente; dentre eles destacam-se OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 e MYC. Muito já se sabe sobre os mecanismos que estes fatores atuam para promover a manutenção da pluripotência celular. Baseados nestes estudos foi possível gerar células de pluripotência induzida (iPSCs). Porém, os mecanismos moleculares que direcionam a indução da pluripotência ainda não estão muito bem esclarecidos. Alguns estudos revelaram que componentes chaves da via NFB estão envolvidos na regulação da pluripotência, bem como na diferenciação e destino celular das células-tronco. Neste estudo, analisamos a participação de componentes da via canônica (RelA e NFB1) e não-canônica (RelB e NFB2) de NFB nos processos de diferenciação e destino celular ou manutenção da pluripotência. Para isto usamos técnicas de PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) investigando os papéis das vias canônica e não-canônica de NFB na manutenção da pluripotência e diferenciação de CPs, em um modelo de indução de diferenciação celular mediado por ácido trans-retinóico (atRA) em células de carcinoma embrionário NTera-2. Foram avaliadas as ligações dos fatores de transcrição RelA e RelB nas regiões promotoras dos genes OCT4, SOX2, MYC, KLF4 e GFAP e a regulação transcricional associada. Nossos resultados identificaram que as células não tratadas com atRA apresentaram níveis baixos na expressão dos componentes da via canônica de NFB, RelA e NFB1, e GFAP e quando induzidas à diferenciação por atRA durante 4 dias esses níveis se elevaram. Uma situação oposta foi vista nos componentes da via não-canônica de NFB, RelB e NFB2, e na expressão dos fatores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2 e KLF4, que apresentaram níveis de expressão elevados nas células não tratadas com atRA e sofreram redução com a indução da diferenciação celular. O ensaio de ChIP revelou que RelA liga-se nas regiões de regulação dos genes OCT4, SOX2, KLF4, MYC e GFAP apenas quando a célula está em processo de diferenciação, enquanto RelB se apresentou ligado às mesmas regiões tanto nas células indiferenciadas quanto naquelas induzidas à diferenciação por 4 dias. Com estes dados sugerimos que a via canônica de NFB pode estar relacionada com o processo de diferenciação e destino celular através da regulação negativa executada por RelA e NFB1 nos genes responsáveis pela identidade pluripotente das células aqui estudadas enquanto a via não-canônica de NFB, representada pela ativação de RelB e NFKB2, pode participar na manutenção da pluripotência através da regulação positiva destes mesmos fatores. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are able to give rise to all the 200 cell types of the adult organism. In nature, there are three types of hPSCs: embryonic stem cells, germ line stem cells and embryonal carcinoma cells. hPSCs characteristics have allowed a major advance in basic research, and are thought to have great applicability in regenerative medicine. In the nucleus of hPSCs there are transcription factors responsible for the maintenance of their pluripotent identity. OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 and MYC are considered the core pluripotency factors in hPSCs. A great deal of knowledge about the mechanisms that promote and maintain pluripotency has been generated. Based on these studies it was possible to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the molecular mechanisms that drive the induction of pluripotency are not fully understood. Some studies have recently indicated that key components of the NFkB may be involved in regulating pluripotency as well as cell differentiation and cell fate. In this study we analyzed the involvement of components of the canonical (RelA and NFB1) and the non-canonical NFB pathways (RelB and NFB2) in the maintenance of pluripotency, differentiation and cell fate processes. The techniques of quantitative real-time PCR (qPCR) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) were used to interrogate the roles of the canonical and non-canonical NFB pathways in maintenance of pluripotency and differentiation in a model of cell differentiation induced by all trans-retinoic acid (atRA) on embryonal carcinoma cells NTera-2. The transcription factors RelA and RelB occupancy in the promoter regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC and GFAP, and the transcriptional regulation associated were evaluated. Our results showed that undifferentiated cells exhibited low expression levels of canonical NFB pathway components, RelA and NFB1, while cells induced to differentiate for 4 days exhibited downregulated expression of these factors. In the other hand, the non-canonical NFB pathway components, RelB and NFB2, and the pluripotency factors OCT4, NANOG, SOX2 and KLF4 were expressed in higher levels in undifferentiated cells, and were downregulated upon the differentiation process. ChIP assay revealed that RelA binds to the regulatory regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC, and GFAP only when cells are induced to differentiate, while RelB was found bound to the same regions in both undifferentiated and differentiated cells. This data suggests that the canonical NFB pathway may be associated to differentiation and cell fate processes by downregulation of genes responsible for the pluripotent identity, and that the non-canonical NFB pathway may act in the maintenance of pluripotency through the upregulation of the same factors.

A família Bromeliaceae apresenta importância ecológica e econômica, desta forma, o desenvolvimento de protocolos para a micropropagação de espécies dessa família, faz-se necessário, a fim de suprir sua demanda comercial e mesmo ecológica. A escolha do meio de cultura e do explante utilizado durante a micropropagação são fundamentais para um protocolo eficaz. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças quantitativas e qualitativas no desenvolvimento de explantes de Neoregelia sp em meios de cultura e monitorar as vias morfogênicas dos propágulos obtidos em explantes foliares. Para tanto, brotos de microcepas e explantes foliares procedentes de um micro jardim clonal, foram transferidos para os meios de cultura de multiplicação MS, ½ MS e WPM, todos suplementados com 0,050 mg.L-1 ANA e 0,50 mg.L-1 de BAP, onde foram mantidos por 120 dias e submetidos a diversas análises morfofisiológicas. Paralelamente, explantes foliares foram mantidos em meio de cultura MS de multiplicação para o monitoramento das vias morfogênicas durante os processos regenerativos. Para os experimentos com brotos de microcepas verificou-se que o meio de cultura MS proporcionou a melhor taxa de multiplicação, maior crescimento dos brotos, obtendo os valores mais elevados de peso de matéria fresca e seca, além disso, apresentaram maior acúmulo de nitrogênio total e proteico. No entanto, os meios de cultura ½ MS e WPM promoveram uma taxa de multiplicação semelhante a do MS, mas com brotos menores e menos vigorosos, porém, mais homogêneos, com isso, na dependência do objetivo do cultivo in vitro, não deve ser desconsiderada a possibilidade de utilização dos meios de cultura ½ MS e WPM. Os explantes foliares não se desenvolveram bem no meio de cultura WPM, não havendo diferença entre os meios MS e ½ MS, visto que ambos apresentaram resultados satisfatórios. As análises histológicas e histoquímicas identificaram células parenquimáticas, que atuam como células-tronco, manifestando capacidade morfogênica para toti ou pluripotência, dando origem respectivamente a embriões somáticos e gemas adventícias, em resposta aos estímulos in vitro. / The Bromeliaceae family has an ecological and economic importance, therefore, the protocols development for micropropagation of species of this family becomes necessary in order to meet its business and even its ecological demand. The choice of culture medium and the explant used during micropropagation are essential for an effective protocol. Thus, the aim of this study was to evaluate the quantitative and qualitative differences in the explants development of Neoregelia sp in the culture media and monitor the morphogenetic pathways of obtained propagules from leaf explants. Consequently, shoots and leaf explants coming from microcloning garden were transferred to the MS, ½ MS and WPM multiplication culture media, all supplemented with 0.050 mg.L-1 NAA and 0.50 mg.L-1 BAP, where they were held for 120 days and submitted to morphological and physiological analysis. Therefore, leaf explants were kept on MS-medium multiplication for monitoring morphogenetic pathways during the regenerative processes. Furthermore, MS medium showed the best multiplication rate for the sprouts of the microstumps, increased growth of shoots, obtaining the highest values of fresh and dry matter weight, and also showed higher accumulation of total nitrogen and protein. However, the ½ MS and WPM culture media promoted a similar multiplication rate to the MS medium, with the development of the smaller and less vigorous shoots, but with greater homogeneity. This way, depending on the purpose of in vitro culture, their use in the micropropagation for this species should not be disregarded. The leaf explants are not well developed in WPM medium, and don\'t had significant difference between the MS and ½ MS culture medium, as both showed satisfactory results. The histological and histochemical analysis identified the presence of the parenchymatic cells, which act as stem cells, expressing morphogenic ability for toti or pluripotency, leading respectively to somatic embryogenesis or adventitious organogenesis in response to in vitro stimuli.

A geração de células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) a partir de células somáticas demonstrou que células adultas de mamíferos podem ser reprogramadas a um estágio de pluripotência através da inserção de fatores de transcrição embrionários. Esta descoberta tem levantado questões fundamentais sobre os mecanismos, que através destes fatores de transcrição, influenciam epigeneticamente as células e seus potenciais de diferenciação após a reprogramação e um normal desenvolvimento. Componentes lipídicos e lipoprotéicos afetam vários aspectos no comportamento celular durante sua manutenção e diferenciação, podendo afetar diretamente fatores essenciais em processos de reprogramação celular, manutenção da pluripotência e perfil epigenético das células. Nesse sentido, esta tese propôs o estudo da composição lipídica com diferentes abordagens entre células iPS, células-tronco embrionárias (H1) e células fibroblastos (BJ). Foram produzidas três linhagens de células pluripotentes induzidas no modelo humano que foram caracterizadas quanto 1a sua pluripotência e utilizadas, juntamente às linhagens H1 e BJ como modelos para o estudo da composição lipídica proposto. Foram identificadas e estudadas um total de 44 espécies lipídicas das classes PC, PE, PI, SM e PS, e discutidas frente a reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Foi identificado um padrão de composição fosfolipídica distinta entre células pluripotentes e não pluripotentes, e especulamos que a presença dessas espécies parecem ter um envolvimento fundamental para a manutenção da pluripotência. Este padrão, mostrou pela análise de componente principal, que durante o processo de reprogramação, alterações na composição lipídica ocorrem de forma com que a pluripotência surge durante a reprogramação, evidenciando alterações lipídicas particulares do estádio da pluripotência, sugerindo uma ligação entre estas alterações na composição lipídica com as alterações metabólicas da própria reprogramação celular. O estudo da quantificação de fosfolipídios entre linhagens celulares pluripotentes e não pluripotentes evidenciaram que existe uma diferença fosfolipídica entre estas linhagens, observamos que as linhagens iPS e H1, do ponto de vista das classes observadas e os fosfolipídios quantificados, são similares entre si e diferentes de células não pluripotentes. É evidente que estas moléculas lipídicas, individualmente, não são capazes de modular processos como a reprogramação celular, entretanto, é de extrema importância o entendimento das mesmas dentro da reprogramação celular e manutenção da pluripotência. Nossos dados sugerem que a composição lipídica de células pluripotentes tem importante papel para o desenvolvimento e evolução do processo de reprogramação celular e o entendimento da manutenção da pluripotência / The generation of induced pluripotent stem cells (iPS) from adult somatic cells has shown that mammalian cells can be reprogrammed to a pluripotent state by the insertion of embryonic transcription factors. This finding has raised questions about the fundamental mechanisms through which these transcription factors epigenetically influence cells, their potential of differentiation after reprogramming and normal development. Lipid and lipoprotein components affect numerous aspects of cell behavior during its maintenance and differentiation, which can directly affect main factors in cell reprogramming processes, maintenance of pluripotency and epigenetic profile of the cells. Thus, this thesis proposed to study, with different approaches, the lipid composition of iPS cells, embryonic stem cells (H1) and fibroblast cells (BJ). Three induced pluripotent cell lines were produced in the human model. They were characterized regarding their pluripotency and used along with H1 and BJ cell lines, as models for the proposed lipid composition study. A total of 44 species of lipid from the classes PC, PE, PI, PS and SM have been identified, studied and discussed regarding cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. A different phospholipid composition pattern was observed between pluripotent and non-pluripotent cells, and it is speculated that the presence of these species appears to have a major involvement on the maintenance of pluripotency. This array showed, by the principal component analysis, that during the reprogramming process changes in the lipid composition occur, so that pluripotency takes place during reprogramming, highlighting lipid changes particular of the pluripotency state, suggesting a connection between these changes in lipid composition and the metabolic changes of cell reprogramming. The study of the quantitation of phospholipids from pluripotent and non-pluripotent cell lines indicated a phospholipid difference between these cell lines when considering the observed classes and quantified phospholipid. It was eminent that iPS lines and H1 are similar and differ from non-pluripotent cells. It is clear that these lipid molecules are not individually capable of modulating processes such as cell reprogramming, however, it is extremely important to understand them within cellular reprogramming and maintenance of pluripotency. Our data suggests that the lipid composition of pluripotent cells has important role in the development and evolution of cellular reprogramming process and the understanding the maintenance of pluripotency