As células pluripotentes (CPs), em teoria, são capazes de dar origem a todos os mais de 200 tipos de células do organismo. Na natureza, há três tipos de células pluripotentes: células-tronco embrionárias, células germinais embrionárias e células de carcinoma embrionário. As características das CPs têm permitido um importante avanço para a pesquisa básica e apontam uma grande aplicabilidade na medicina regenerativa. No núcleo das CPs existem fatores atuantes responsáveis pela manutenção da identidade pluripotente; dentre eles destacam-se OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 e MYC. Muito já se sabe sobre os mecanismos que estes fatores atuam para promover a manutenção da pluripotência celular. Baseados nestes estudos foi possível gerar células de pluripotência induzida (iPSCs). Porém, os mecanismos moleculares que direcionam a indução da pluripotência ainda não estão muito bem esclarecidos. Alguns estudos revelaram que componentes chaves da via NFB estão envolvidos na regulação da pluripotência, bem como na diferenciação e destino celular das células-tronco. Neste estudo, analisamos a participação de componentes da via canônica (RelA e NFB1) e não-canônica (RelB e NFB2) de NFB nos processos de diferenciação e destino celular ou manutenção da pluripotência. Para isto usamos técnicas de PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) investigando os papéis das vias canônica e não-canônica de NFB na manutenção da pluripotência e diferenciação de CPs, em um modelo de indução de diferenciação celular mediado por ácido trans-retinóico (atRA) em células de carcinoma embrionário NTera-2. Foram avaliadas as ligações dos fatores de transcrição RelA e RelB nas regiões promotoras dos genes OCT4, SOX2, MYC, KLF4 e GFAP e a regulação transcricional associada. Nossos resultados identificaram que as células não tratadas com atRA apresentaram níveis baixos na expressão dos componentes da via canônica de NFB, RelA e NFB1, e GFAP e quando induzidas à diferenciação por atRA durante 4 dias esses níveis se elevaram. Uma situação oposta foi vista nos componentes da via não-canônica de NFB, RelB e NFB2, e na expressão dos fatores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2 e KLF4, que apresentaram níveis de expressão elevados nas células não tratadas com atRA e sofreram redução com a indução da diferenciação celular. O ensaio de ChIP revelou que RelA liga-se nas regiões de regulação dos genes OCT4, SOX2, KLF4, MYC e GFAP apenas quando a célula está em processo de diferenciação, enquanto RelB se apresentou ligado às mesmas regiões tanto nas células indiferenciadas quanto naquelas induzidas à diferenciação por 4 dias. Com estes dados sugerimos que a via canônica de NFB pode estar relacionada com o processo de diferenciação e destino celular através da regulação negativa executada por RelA e NFB1 nos genes responsáveis pela identidade pluripotente das células aqui estudadas enquanto a via não-canônica de NFB, representada pela ativação de RelB e NFKB2, pode participar na manutenção da pluripotência através da regulação positiva destes mesmos fatores. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are able to give rise to all the 200 cell types of the adult organism. In nature, there are three types of hPSCs: embryonic stem cells, germ line stem cells and embryonal carcinoma cells. hPSCs characteristics have allowed a major advance in basic research, and are thought to have great applicability in regenerative medicine. In the nucleus of hPSCs there are transcription factors responsible for the maintenance of their pluripotent identity. OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 and MYC are considered the core pluripotency factors in hPSCs. A great deal of knowledge about the mechanisms that promote and maintain pluripotency has been generated. Based on these studies it was possible to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the molecular mechanisms that drive the induction of pluripotency are not fully understood. Some studies have recently indicated that key components of the NFkB may be involved in regulating pluripotency as well as cell differentiation and cell fate. In this study we analyzed the involvement of components of the canonical (RelA and NFB1) and the non-canonical NFB pathways (RelB and NFB2) in the maintenance of pluripotency, differentiation and cell fate processes. The techniques of quantitative real-time PCR (qPCR) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) were used to interrogate the roles of the canonical and non-canonical NFB pathways in maintenance of pluripotency and differentiation in a model of cell differentiation induced by all trans-retinoic acid (atRA) on embryonal carcinoma cells NTera-2. The transcription factors RelA and RelB occupancy in the promoter regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC and GFAP, and the transcriptional regulation associated were evaluated. Our results showed that undifferentiated cells exhibited low expression levels of canonical NFB pathway components, RelA and NFB1, while cells induced to differentiate for 4 days exhibited downregulated expression of these factors. In the other hand, the non-canonical NFB pathway components, RelB and NFB2, and the pluripotency factors OCT4, NANOG, SOX2 and KLF4 were expressed in higher levels in undifferentiated cells, and were downregulated upon the differentiation process. ChIP assay revealed that RelA binds to the regulatory regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC, and GFAP only when cells are induced to differentiate, while RelB was found bound to the same regions in both undifferentiated and differentiated cells. This data suggests that the canonical NFB pathway may be associated to differentiation and cell fate processes by downregulation of genes responsible for the pluripotent identity, and that the non-canonical NFB pathway may act in the maintenance of pluripotency through the upregulation of the same factors.

No intuito de descrever a evolução do desenvolvimento do concepto bubalino entre 10 e 60 dias de gestação, esse estudo utilizou a metodologia de mensuração por Crow rump para revelar a idade estimada de 96 embriões e fetos coletados no Matadouro municipal de Macapá, no estado do Amapá entre os anos de 2006 a 2008. Os parâmetros utilizados consistiram em medidas de comprimento (crânio caudal) e peso utilizando-se balança eletrônica de precisão. Para visualização macroscópica foram feitas fotografias, e a microscopia eletrônica de varredura auxiliou na identificação de inúmeras estruturas externas dos embriões. Foram realizados cortes histológicos de 5µm os quais foram corados em HE e picrosirius, e submetidos a técnicas de imunohistoquimica para detecção de Oct4, PCNA e vimentina. Nossos resultados revelam que embriões de mamíferos até a 5° semana de gestação são muito semelhantes aos de outras espécies de mamíferos já estudados. Similaridades entre bovinos e bubalinos persistem com exceção dos estágios fetais onde aparentemente búfalos se desenvolvem mais rapidamente que bovinos. Em conclusão, o estudo indica características importantes que podem ser utilizadas para verificar a viabilidade de embriões de búfalos e auxiliar avaliações em exames complementares como os de ultrassonografia, e também indicam a presença de importantes sítios de células pluripotentes em regiões diferentes do embrião dependendo do estágio de desenvolvimento em que o mesmo se encontra. / The aim of this study was to describe the developmental changes in the bubaline conceptus from 10-60 days of gestation using the Crown rump methodology to diagnostic the estimated age of those 96 embryos and fetuses obtained at Matadouro Municipal de Macapá, on Amapá state, from 2006 until 2008. Parameters used were cranio-caudal length (CR) and weight. For macroscopic view photographies were done, Scanning electron microscopy helps to identify inumerous external structures of the embryos. Histotogic section of 5µm were done and stained using Hematoxilin-Eosin, picrosirius, and also subjected to immunohistochemistry for Oct4, PCNA and vimentin were evaluated. Transmission electron microscopy was used in fetal membranes to describe it better. The obtained results revealed that mammal embryos until 5th weeks of gestation has to much similar characteristics to others studied species. Similarities between bovine and bubaline persist; except on fetal stages that buffalos seems develop faster than bovine ones. In conclusion, the overall data indicated the important characteristics that can be evaluated to verify the viability of buffalo embryos and help the evaluations of ultrasonographic exams, also identify the presence of important regions with pluripotente cells that changes according to the stage of the embryo development.

No intuito de descrever a evolução do desenvolvimento do concepto bubalino entre 10 e 60 dias de gestação, esse estudo utilizou a metodologia de mensuração por Crow rump para revelar a idade estimada de 96 embriões e fetos coletados no Matadouro municipal de Macapá, no estado do Amapá entre os anos de 2006 a 2008. Os parâmetros utilizados consistiram em medidas de comprimento (crânio caudal) e peso utilizando-se balança eletrônica de precisão. Para visualização macroscópica foram feitas fotografias, e a microscopia eletrônica de varredura auxiliou na identificação de inúmeras estruturas externas dos embriões. Foram realizados cortes histológicos de 5µm os quais foram corados em HE e picrosirius, e submetidos a técnicas de imunohistoquimica para detecção de Oct4, PCNA e vimentina. Nossos resultados revelam que embriões de mamíferos até a 5° semana de gestação são muito semelhantes aos de outras espécies de mamíferos já estudados. Similaridades entre bovinos e bubalinos persistem com exceção dos estágios fetais onde aparentemente búfalos se desenvolvem mais rapidamente que bovinos. Em conclusão, o estudo indica características importantes que podem ser utilizadas para verificar a viabilidade de embriões de búfalos e auxiliar avaliações em exames complementares como os de ultrassonografia, e também indicam a presença de importantes sítios de células pluripotentes em regiões diferentes do embrião dependendo do estágio de desenvolvimento em que o mesmo se encontra. / The aim of this study was to describe the developmental changes in the bubaline conceptus from 10-60 days of gestation using the Crown rump methodology to diagnostic the estimated age of those 96 embryos and fetuses obtained at Matadouro Municipal de Macapá, on Amapá state, from 2006 until 2008. Parameters used were cranio-caudal length (CR) and weight. For macroscopic view photographies were done, Scanning electron microscopy helps to identify inumerous external structures of the embryos. Histotogic section of 5µm were done and stained using Hematoxilin-Eosin, picrosirius, and also subjected to immunohistochemistry for Oct4, PCNA and vimentin were evaluated. Transmission electron microscopy was used in fetal membranes to describe it better. The obtained results revealed that mammal embryos until 5th weeks of gestation has to much similar characteristics to others studied species. Similarities between bovine and bubaline persist; except on fetal stages that buffalos seems develop faster than bovine ones. In conclusion, the overall data indicated the important characteristics that can be evaluated to verify the viability of buffalo embryos and help the evaluations of ultrasonographic exams, also identify the presence of important regions with pluripotente cells that changes according to the stage of the embryo development.

As células pluripotentes (CPs), em teoria, são capazes de dar origem a todos os mais de 200 tipos de células do organismo. Na natureza, há três tipos de células pluripotentes: células-tronco embrionárias, células germinais embrionárias e células de carcinoma embrionário. As características das CPs têm permitido um importante avanço para a pesquisa básica e apontam uma grande aplicabilidade na medicina regenerativa. No núcleo das CPs existem fatores atuantes responsáveis pela manutenção da identidade pluripotente; dentre eles destacam-se OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 e MYC. Muito já se sabe sobre os mecanismos que estes fatores atuam para promover a manutenção da pluripotência celular. Baseados nestes estudos foi possível gerar células de pluripotência induzida (iPSCs). Porém, os mecanismos moleculares que direcionam a indução da pluripotência ainda não estão muito bem esclarecidos. Alguns estudos revelaram que componentes chaves da via NFB estão envolvidos na regulação da pluripotência, bem como na diferenciação e destino celular das células-tronco. Neste estudo, analisamos a participação de componentes da via canônica (RelA e NFB1) e não-canônica (RelB e NFB2) de NFB nos processos de diferenciação e destino celular ou manutenção da pluripotência. Para isto usamos técnicas de PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) investigando os papéis das vias canônica e não-canônica de NFB na manutenção da pluripotência e diferenciação de CPs, em um modelo de indução de diferenciação celular mediado por ácido trans-retinóico (atRA) em células de carcinoma embrionário NTera-2. Foram avaliadas as ligações dos fatores de transcrição RelA e RelB nas regiões promotoras dos genes OCT4, SOX2, MYC, KLF4 e GFAP e a regulação transcricional associada. Nossos resultados identificaram que as células não tratadas com atRA apresentaram níveis baixos na expressão dos componentes da via canônica de NFB, RelA e NFB1, e GFAP e quando induzidas à diferenciação por atRA durante 4 dias esses níveis se elevaram. Uma situação oposta foi vista nos componentes da via não-canônica de NFB, RelB e NFB2, e na expressão dos fatores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2 e KLF4, que apresentaram níveis de expressão elevados nas células não tratadas com atRA e sofreram redução com a indução da diferenciação celular. O ensaio de ChIP revelou que RelA liga-se nas regiões de regulação dos genes OCT4, SOX2, KLF4, MYC e GFAP apenas quando a célula está em processo de diferenciação, enquanto RelB se apresentou ligado às mesmas regiões tanto nas células indiferenciadas quanto naquelas induzidas à diferenciação por 4 dias. Com estes dados sugerimos que a via canônica de NFB pode estar relacionada com o processo de diferenciação e destino celular através da regulação negativa executada por RelA e NFB1 nos genes responsáveis pela identidade pluripotente das células aqui estudadas enquanto a via não-canônica de NFB, representada pela ativação de RelB e NFKB2, pode participar na manutenção da pluripotência através da regulação positiva destes mesmos fatores. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are able to give rise to all the 200 cell types of the adult organism. In nature, there are three types of hPSCs: embryonic stem cells, germ line stem cells and embryonal carcinoma cells. hPSCs characteristics have allowed a major advance in basic research, and are thought to have great applicability in regenerative medicine. In the nucleus of hPSCs there are transcription factors responsible for the maintenance of their pluripotent identity. OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 and MYC are considered the core pluripotency factors in hPSCs. A great deal of knowledge about the mechanisms that promote and maintain pluripotency has been generated. Based on these studies it was possible to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the molecular mechanisms that drive the induction of pluripotency are not fully understood. Some studies have recently indicated that key components of the NFkB may be involved in regulating pluripotency as well as cell differentiation and cell fate. In this study we analyzed the involvement of components of the canonical (RelA and NFB1) and the non-canonical NFB pathways (RelB and NFB2) in the maintenance of pluripotency, differentiation and cell fate processes. The techniques of quantitative real-time PCR (qPCR) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) were used to interrogate the roles of the canonical and non-canonical NFB pathways in maintenance of pluripotency and differentiation in a model of cell differentiation induced by all trans-retinoic acid (atRA) on embryonal carcinoma cells NTera-2. The transcription factors RelA and RelB occupancy in the promoter regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC and GFAP, and the transcriptional regulation associated were evaluated. Our results showed that undifferentiated cells exhibited low expression levels of canonical NFB pathway components, RelA and NFB1, while cells induced to differentiate for 4 days exhibited downregulated expression of these factors. In the other hand, the non-canonical NFB pathway components, RelB and NFB2, and the pluripotency factors OCT4, NANOG, SOX2 and KLF4 were expressed in higher levels in undifferentiated cells, and were downregulated upon the differentiation process. ChIP assay revealed that RelA binds to the regulatory regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC, and GFAP only when cells are induced to differentiate, while RelB was found bound to the same regions in both undifferentiated and differentiated cells. This data suggests that the canonical NFB pathway may be associated to differentiation and cell fate processes by downregulation of genes responsible for the pluripotent identity, and that the non-canonical NFB pathway may act in the maintenance of pluripotency through the upregulation of the same factors.

Em 2006, Takahashi e colaboradores demonstraram ser possível a obtenção de células-tronco pluripotentes por indução gênica (induced pluripotent stem cells ou iPSCs). Desde o surgimento desta tecnologia diversos modelos animais foram gerados, ampliando as possibilidades de seu uso na pesquisa, como por exemplo, na criação de modelos para doenças genéticas humanas como esclerose lateral amiotrófica, autismo, esquizofrenia, doença de Parkinson e Alzheimer, além do aprimoramento de características relevantes para produção animal. O modelo suíno é considerado vantajoso sobre os outros modelos animais principalmente pela criação já bem estabelecida e similaridades fisiológicas com os humanos. O intuito deste projeto foi reprogramar fibroblastos embrionários suínos através do sistema integrativo à iPSCs, para então diferenciá-las em células progenitoras neurais (neural progenitor cells, NPCs). Para isso, os fibroblastos foram transduzidos com vetores contendo sequencias humanas ou murinas dos genes OCT4, SOX2, c-Myc e KLF4 (hOSKM ou mOSKM) para formação das iPSCs. Estas foram caracterizadas quanto a morfologia, presença de fosfatase alcalina, a expressão dos genes exógenos e endógenos (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) através de imunofluorescência e RT-qPCR e formação de corpos embrióides. Então foram submetidas durante 14 dias ao meio de indução neural sob matriz extracelular comercial, gerando células potencialmente similares às NPCs. Estas foram caracterizadas morfologicamente, por imunofluorescência das proteínas NESTINA, BETA TUBULINA III e VIMENTINA, além da expressão de NESTINA e GFAP por RT-qPCR. Foram produzidas com sucesso 3 linhagens de iPSC em diferentes estágios de reprogramação e células positivas para todos os marcadores neurais testados. Os resultados apresentados deverão contribuir para a utilização do modelo suíno em futuros estudos voltados à medicina regenerativa e translacional. / In 2006, Takahashi and collaborators reported the induction into pluripotency of somatic cells (induced pluripotent stem cells, iPSCs). Since then, this technique has much been developed; many animal models have been created opening a new series of opportunities in research. They enable the creation of models for human genetic diseases, for example, amyotrophic lateral sclerosis, autism, schizophrenia, Parkinson´s disease, Alzheimer´s disease and the enhancement of relevant characteristics in agriculture. The swine model is considered to present many advantages over others, including the well-known production and maintenance and physiological similarities to humans. The aim of this project was to reprogram porcine embryonic fibroblasts (pEF) into iPSCs using the lentiviral integrative system, followed by its differentiation into neural progenitor cells (NPCs). The cells were reprogrammed using vector containing either the human sequences (hOSKM) or the mouse sequences (mOSKM) for the OCT4, SOX2, c-Myc and KLF4 genes to form the iPSCs. They were characterized regarding the presence of the Alkaline Phosphatase enzyme, expression of exogenous and endogenous genes (OSKM, HS OCT4, OCT4, NANOG) through immunofluorescence and RT-qPCR, and embryoid body formation. Then, the cells were cultured with neural induction media for 14 days in commercial extracellular matrix, generating cells potentially like NPCs. Those were characterized regarding their morphology, immunofluorescence for NESTINA, BETA TUBULIN III and VIMENTINA and gene expression of NESTINA and GFAP. iPSCs were successfully reprogramed, generating 3 cell lines at different stages of reprograming and cells positive for all the neural markers tested were produced. The results shown will contribute to the use of the porcine model in future regenerative and translational medicine research.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa. / Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

Estratégias como a transferência nuclear e a reprogramação induzida vêm sendo empregadas com o objetivo de induzir células somáticas a um estado pluripotente similar ao embrionário. O processo de reprogramação nuclear e extremamente desejável e possui importantes contribuições tanto no estudo da ciência básica como aplicada, como por exemplo, no aumento da eficiência das biotécnicas de produção animal ou na medicina, com a possibilidade de terapia celular autóloga. Uma série de estudos, porem, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Esta proposta teve como objetivo gerar células bovinas pluripotentes através da reprogramação direta e utilizá-las na transferência de núcleo para a produção animal visando o aumento da eficiência da reprogramação celular. Para tal, foi analisada a capacidade de indução e manutenção da pluripotência em células somáticas bovinas comparando-as com células humanas e equinas (células pluripotentes induzidas - iPSC), assim como a capacidade de desenvolvimento de embriões produzidos através da combinação das técnicas em bovinos. As células iPS derivadas neste estudo foram produzidas mediante transdução lentiviral de fatores de transcrição (OSKM) murinos, caracterizadas e utilizadas como doadoras de núcleo na clonagem. Resumidamente, oócitos bovinos obtidos de ovários provenientes de abatedouros foram maturados in vitro por 18h, enucleados e reconstruídos com células iPS (n=203 ou fibroblastos fetais bovinos (bFF, n=153), em cinco repetições. Após reconstrução os embriões foram ativados com ionomicina e 6-DMAP e cultivados in vitro até o estágio de blastocisto. Foram avaliadas as taxas de fusão, clivagem (48h após ativação) e desenvolvimento a blastocisto (192h após ativação) e os resultados foram submetidos ao teste de Qui-quadrado a 5% de significância. Foi possível a produção de embriões a partir de biPS, entretanto, este estudo evidenciou a necessidade de otimização da sincronização do ciclo celular em células iPS. Não foram encontradas diferenças entre os grupos quanto à capacidade de produção a blastocisto ou clivagem, porém o grupo reconstruído com células iPS apresentou uma menor taxa de fusão. Com a finalidade de entender a influência de fatores de transcrição específicos na reprogramação nuclear, bFF expressando OCT4 humano (hOCT4) e hSOX2 combinados com as proteínas repórteres fluorescentes vexGFP e mCitrine, respectivamente, foram submetidas à separação celular por citometria de fluxo e utilizados como doadores de núcleo. Foram utilizados bFF expressando OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicata), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicata) ou células controle (não transduzidas, n=178 e n=149, em quadruplicata para grupos OCT4 e SOX2, respectivamente). Não foram encontradas diferenças entre os grupos nas características de capacidade de desenvolvimento in vitro estudadas. Em conclusão, este estudo relata a possibilidade de produção de células bovinas reprogramadas, além de também mostrar que a transferência de núcleo utilizando células expressando hSOX2 ou hOCT4, ou já reprogramadas, resulta em taxas similares de produção embrionária quando comparadas à utilização de células controle. O conhecimento da contribuição de cada fator utilizado na reprogramação induzida, aliado a estudos de comparação com a capacidade de desenvolvimento in vitro de organismos derivados de células reprogramadas deverá contribuir para o aumento da eficiência da clonagem e produção animal in vitro como para a medicina regenerativa. / Nuclear transfer and induced reprogramming are technologies usually used for the induction of somatic cells into an embryonic-like pluripotent status. The knowledgment of nuclear reprogramming process is highly desirable, leading to important contributions for both basic and applied sciences; for example, resulting in the increase in the efficiency of several animal biotechnologies, or else enabling autologous cellular therapy for medical purposes. However, basic studies are still needed in order to enable such applications, once the mechanisms controlling in vitro reprogramming are yet to be unraveled. This study aims to generate induced pluripotent bovine stem cells through direct reprogramming and its use in nuclear transfer in order to enhance the cellular reprogramming efficiency, For that, the potential of pluripotency induction and maintenance was analyzed in bovine somatic cells, comparing those with human and equine cells, as well as the potential of embryonic development after combining direct and nuclear reprogramming. iPS cells derived in this study were produced trought lentivirus transduction of mouse transcription factors (OSKM), further characterized and used as nuclei donors for cloning. In summary, bovine oocytes were obtained from slaughterhouse ovaries, in vitro matured for 18h, enucleated and reconstructed with iPS cells (n=203) or fetal fibroblasts (bFF, n=153), in five replicates. Embryos were reconstructed, chemically activated with ionomycin and 6-DMAP and cultured in vitro until blastocyst stage. Fusion, cleavage (48h post activation) and blastocyst developmental rates (192h post activation) were analyzed and result submitted to Chi-square test at 5% significance. biPS enabled embryo production, however further optimization on cell cycle synchronization still needs to be accomplished. No difference was observed between groups regarding cleavage or blastocyst developmental rates, however iPS group presented a reduced fusion rate when compared to control. For a better understanding on how reprogramming associated transcription factors could influence on nuclear reprogramming, bFF expressing human OCT4 (hOCT4) or hSOX2 combined with the fluorescent protein reporters vexGFP and mCitrine, respectively, were submitted to flow citometry cell sorting and used as nuclei donors. bFF expressing OCT4-vexGFP (n=182, quadruplicate), SOX2-mCitrine (n=203, quadruplicate) or control cells (non transduced, n=178 and n=149, in quadruplicate for OCT4 and SOX2, respectively) were used. No difference was observed between groups regarding the in vitro developmental potential rates. In conclusion, the present study reports the generation of reprogrammed bovine cells, and its use the nuclear transfer. Donor cells expressing hOCT4, hSOX2 or reprogrammed cells resulted in similar developmental in vitro rates when compared to controls. The knowledge of each reprogramming factor influence on in vitro reprogramming, together with comparison studies on in vitro developmental potential of organisms derived from reprogrammed cells should help enhancing not only the cloning efficiency and in vitro animal production, but also the regenerative medicine.

A tranferência nuclear de células somáticas (TNCS) está sendo utilizada para produzir cavalos de elite. No entanto, durante este procedimento pode ocorrer a perfuração da zona pelúcida, levando, ocasionalmente, à secção da massa celular interna, e conseqüente derivação de gêmeos monozigóticos. Além de serem relatadas alterações no processo de imprinting genômico, que conduzem ao desenvolvimento de doenças. Com a descoberta da possibilidade de reprogramar as células somáticas a um estado de pluripotência (iPSCs), estas células passaram a ser muito utilizadas em pesquisas de neurociência. Contudo, também ocorrem modificações epigenéticas durante esta reprogramação celular. Portanto, nossas hipóteses são que os gêmeos eqüinos gerados pela TNCS podem levar às irregularidades no desenvolvimento do sistema nervoso. O padrão de metilação do SNRPN nas estruturas dos fetos muares clonados, e as células iPSCs são diferentes dos padrões encontrados nos muares analisados. A expressão dos genes SNRPN, Necdin e UBE3A são maiores no cérebro, enquanto a expressão do H19 é maior nas membranas extra-embrionárias. Em nosso estudo, obtivemos duas gestações gemelares equinas derivadas da TNCS, que foram interrompidas com 40 e 60 dias de gestação, e comparados com gestações eqüinas únicas de idade similar. Diferenças no comprimento entre os embriões gêmeos foram observadas aos 40 (2.0 e 2.2 cm 10%) e aos 60 (6,5 e 8,5 cm 24%) dias de gestação. Somente o plexo coróide do quarto ventrículo apresentou-se mais desenvolvido nos fetos com maior comprimento. Ao analisarmos fetos muares clonados em diferentes idades gestacionais e compará-los com muares, nos períodos embrionário, fetal e adulto, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, na décima passagem das células iPSC o padrão de metilação alterou, em relação aos muares estudados e ao padrão observado nos fibroblastos. Ao analisarmos os fetos clonados nas diferentes idades gestacionais observou-se no cérebro menor expressão dos gene H19 e UBE3A, e maior expressão do gene SNRPN. Contudo, a expressão do gene Necdin variou entre as estruturas estudadas. Em conclusão, apesar dos gêmeos eqüinos provenientes de TNCS diferirem quanto ao tamanho, morfologicamente são iguais. Dentre as estruturas cerebrais o plexo coróide se apresentou mais desenvolvido nos fetos de maior comprimento. Os fetos muares clonados não apresentaram diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, as iPSCs apresentaram alteração no padrão de metilação deste gene na décima passagem. Embora os genes SNRPN, Necdin e UBE3A sejam expressos no cérebro, o SNRPN apresentou-se prevalente nessa estrutura / The nuclear transfer of somatic cells (SCNT) is being used to produce elite horses. However, during this procedure can occur drilling of the zona pellucida, leading occasionally to the section of the inner cell mass, and subsequent derivation of monozygotic twins. Besides being related changes in genomic imprinting process, leading to the development of diseases. With the discovery of the possibility to reprogram somatic cells to a pluripotent state (iPSCs), these cells have become widely used in neuroscience research. However, also occur epigenetic changes during this cellular reprogramming. Therefore, our hypothesis is that equine twins caused by equine ART could lead to developmental irregularities of the nervous system. The patterns of SNRPN methylation in the structures of cloned mule fetuses and in iPSCs are different from the patterns found in the analyzed mules. And the expression of SNRPN, Necdin and UBE3A genes are higher in the brain, while the higher expression of H19 gene occurs in the extraembryonic membranes. In our study we derived two equine twin SCNT pregnancies that were interrupted at 40 and 60 days of gestation and compared to singleton fetuses of similar age. Differences in lengths between twin embryos were observed at both 40 (2.0 and 2.2 cm 10%) and 60 (6.5 and 8.5 cm 24%) days of gestation. Only the choroid plexus in the fourth ventricle more developed in the twins with the greatest length. Analyzing mules cloned fetuses at different gestational ages, and compare them with mules at embryonic, fetal and adult period; there was no difference in the pattern of methylation in SNRPN gene. However, in the tenth passage of the iPSCs the methylation pattern was altered in relation to the studied mules and the pattern observed in fibroblasts. When the cloned fetuses at different gestational ages were analyzed, the brain presented lower expression of H19 and UBE3A genes, and higher expression of SNRPN gene. However, the expression of Necdin gene varied among the structures studied. In conclusion, despite the twin horses from SCNT differ in size, they are morphologically identical. Among the brain structures the choroid plexus performed more developed in the fetuses of greater length. Cloned mules fetuses showed no difference in the pattern of methylation SNRPN gene. However, iPSCs have changes in the pattern of methylation of this gene in the tenth passage. Although SNRPN, Necdin and Ube3A genes are expressed in the brain, SNRPN is prevalent in this structure

A tranferência nuclear de células somáticas (TNCS) está sendo utilizada para produzir cavalos de elite. No entanto, durante este procedimento pode ocorrer a perfuração da zona pelúcida, levando, ocasionalmente, à secção da massa celular interna, e conseqüente derivação de gêmeos monozigóticos. Além de serem relatadas alterações no processo de imprinting genômico, que conduzem ao desenvolvimento de doenças. Com a descoberta da possibilidade de reprogramar as células somáticas a um estado de pluripotência (iPSCs), estas células passaram a ser muito utilizadas em pesquisas de neurociência. Contudo, também ocorrem modificações epigenéticas durante esta reprogramação celular. Portanto, nossas hipóteses são que os gêmeos eqüinos gerados pela TNCS podem levar às irregularidades no desenvolvimento do sistema nervoso. O padrão de metilação do SNRPN nas estruturas dos fetos muares clonados, e as células iPSCs são diferentes dos padrões encontrados nos muares analisados. A expressão dos genes SNRPN, Necdin e UBE3A são maiores no cérebro, enquanto a expressão do H19 é maior nas membranas extra-embrionárias. Em nosso estudo, obtivemos duas gestações gemelares equinas derivadas da TNCS, que foram interrompidas com 40 e 60 dias de gestação, e comparados com gestações eqüinas únicas de idade similar. Diferenças no comprimento entre os embriões gêmeos foram observadas aos 40 (2.0 e 2.2 cm 10%) e aos 60 (6,5 e 8,5 cm 24%) dias de gestação. Somente o plexo coróide do quarto ventrículo apresentou-se mais desenvolvido nos fetos com maior comprimento. Ao analisarmos fetos muares clonados em diferentes idades gestacionais e compará-los com muares, nos períodos embrionário, fetal e adulto, não foi observada diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, na décima passagem das células iPSC o padrão de metilação alterou, em relação aos muares estudados e ao padrão observado nos fibroblastos. Ao analisarmos os fetos clonados nas diferentes idades gestacionais observou-se no cérebro menor expressão dos gene H19 e UBE3A, e maior expressão do gene SNRPN. Contudo, a expressão do gene Necdin variou entre as estruturas estudadas. Em conclusão, apesar dos gêmeos eqüinos provenientes de TNCS diferirem quanto ao tamanho, morfologicamente são iguais. Dentre as estruturas cerebrais o plexo coróide se apresentou mais desenvolvido nos fetos de maior comprimento. Os fetos muares clonados não apresentaram diferença no padrão de metilação do gene SNRPN. No entanto, as iPSCs apresentaram alteração no padrão de metilação deste gene na décima passagem. Embora os genes SNRPN, Necdin e UBE3A sejam expressos no cérebro, o SNRPN apresentou-se prevalente nessa estrutura / The nuclear transfer of somatic cells (SCNT) is being used to produce elite horses. However, during this procedure can occur drilling of the zona pellucida, leading occasionally to the section of the inner cell mass, and subsequent derivation of monozygotic twins. Besides being related changes in genomic imprinting process, leading to the development of diseases. With the discovery of the possibility to reprogram somatic cells to a pluripotent state (iPSCs), these cells have become widely used in neuroscience research. However, also occur epigenetic changes during this cellular reprogramming. Therefore, our hypothesis is that equine twins caused by equine ART could lead to developmental irregularities of the nervous system. The patterns of SNRPN methylation in the structures of cloned mule fetuses and in iPSCs are different from the patterns found in the analyzed mules. And the expression of SNRPN, Necdin and UBE3A genes are higher in the brain, while the higher expression of H19 gene occurs in the extraembryonic membranes. In our study we derived two equine twin SCNT pregnancies that were interrupted at 40 and 60 days of gestation and compared to singleton fetuses of similar age. Differences in lengths between twin embryos were observed at both 40 (2.0 and 2.2 cm 10%) and 60 (6.5 and 8.5 cm 24%) days of gestation. Only the choroid plexus in the fourth ventricle more developed in the twins with the greatest length. Analyzing mules cloned fetuses at different gestational ages, and compare them with mules at embryonic, fetal and adult period; there was no difference in the pattern of methylation in SNRPN gene. However, in the tenth passage of the iPSCs the methylation pattern was altered in relation to the studied mules and the pattern observed in fibroblasts. When the cloned fetuses at different gestational ages were analyzed, the brain presented lower expression of H19 and UBE3A genes, and higher expression of SNRPN gene. However, the expression of Necdin gene varied among the structures studied. In conclusion, despite the twin horses from SCNT differ in size, they are morphologically identical. Among the brain structures the choroid plexus performed more developed in the fetuses of greater length. Cloned mules fetuses showed no difference in the pattern of methylation SNRPN gene. However, iPSCs have changes in the pattern of methylation of this gene in the tenth passage. Although SNRPN, Necdin and Ube3A genes are expressed in the brain, SNRPN is prevalent in this structure