O estabelecimento de cultivo de células-tronco embrionárias (ESC) ainda não foi realizado com sucesso. Verificação de marcadores de pluripotência e diferenciação nos três folhetos germinativos são necessárias para validação de uma linhagem celular pluripotente. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar o cultivo de ESC suínas usando Matrigel e comparar a expressão dos marcadores de pluripotência Oct-4, CD9 e α6-integrina em embriões. Blastocistos in vitro ou in vivo foram submetidos à imunocirurgia para cultura da massa celular interna, fixados para imunocitoquímica ou extração de RNA total para RT-PCR. Nenhuma colônia de ESC foi obtida usando co-cultivo em fibroblastos embrionários murinos (MEF) ou em Matrigel. Expressão de Oct-4, CD9 e α6-integrina foi detectada por PCR. Os produtos de PCR de CD9 e α6-integrina tiveram suas sequências nucleotídicas determinadas e comparadas com bases de dados públicas. O produto de CD9 foi idêntico à seqüência do CD9 suíno e o produto de α66integrina foi similar à humana e eqüina. Reação de Imunocitoquímica revelou a presença de Oct-4 no citoplasma de células da massa celular interna e do trofoblasto. CD9 e α6-integrina foram observados preferencialmente em células do trofoblasto. Não foi possível comparar a expressão dos marcadores de pluripotência entre ESC e embriões em suínos. Porém, este estudo descreve pela primeira vez a expressão de CD9 e α6-integrina em blastocistos suínos, os quais podem não estar relacionados com células pluripotentes embrionárias suínas. / Establishment of embryonic stem cell (ESC) culture in pigs has not been achieved. Verification of pluripotency markers and differentiation in the three embryonic layers are necessary for validation of a pluripotent cell line. The objective of this study was to establish and characterize porcine ESC culture using Matrigel and compare the expression of pluripotency markers Oct-4, CD9 and α6-integrin with embryos. In vitro or in vivo porcine blastocysts were submitted to immunosurgery for culture of inner cell mass, fixation for immunocytochemistry or total RNA extraction for RT-PCR. No ESC colonies were obtained using co-culture on mouse embryonic fibroblasts (MEF) or on Matrigel. Expression of Oct-4, CD9 and α6-integrin was detected by PCR. CD9 and α6-integrin PCR products had their nucleotide sequence assessed and compared with public nucleotide database. CD9 product was identical to CD9 porcine sequences and α6-integrin product was similar to human and equine α6-integrin. Immunocytochemistry revealed Oct-4 expression in cytoplasm of the inner cell mass and trophoblast cells. CD9 and α6-integrin were observed preferentially on trophoblast cells. It was not possible to compare expression of pluripotency markers between porcine ESC and embryos. However, this study describes for the first time expression of CD9 and α6-integrin in porcine blastocysts, which may not be related to pluripotent porcine embryonic cells.

Submitted by LUCIANA DINIZ ROLA Rola (lanakauz@gmail.com) on 2017-02-20T21:28:43Z No. of bitstreams: 1 Tese_Rola, L.D..pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-02-23T14:55:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 rola_ld_dr_jabo.pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-23T14:55:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 rola_ld_dr_jabo.pdf: 3390186 bytes, checksum: 5d304c7641470e86a2977f340d4e7767 (MD5) Previous issue date: 2017-02-03 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Os cervídeos têm sofrido com a diminuição do seu habitat natural, segregação entre populações e diminuição da diversidade genética. Embora a criopreservação e estocagem de gametas e embriões seja usada como estratégia de preservação de populações selvagens, poucos estudos tem obtido sucesso devido a dificuldades na sua obtenção. Recentes estudos com células tronco de pluripotência induzida (“induced pluripotent stem cells” - iPSC) derivadas de células somáticas humanas e de camundongos conseguiram diferenciação em células germinativas, espermatozoides e oócitos. Deste modo, tem-se o objetivo a longo prazo de produzir gametas viáveis de cervídeos, a partir de células somáticas. Porém, como até a presente data células iPSC ainda não foram derivadas em cervídeos, o enfoque principal neste projeto foi estabelecer protocolos que propiciem a obtenção de linhagens iPSC estáveis. O processo de reprogramação de células somáticas em células iPSC é facilitado pelo uso de células-tronco adultas que possuam capacidade multipotente. Como pouco se conhece a respeito de células-tronco multipotentes em cervídeos, a primeira meta deste trabalho teve como objetivo obter biopsias de diversos tecidos com capacidade multipotente. Entre elas encontram-se as células-tronco do tecido adiposo, chifre e pele. Uma vez estabelecidas, as linhagens de cada tecido foram avaliadas quanto ao seu tempo de duplicação da população celular e foram induzidas à diferenciação em outros tipos de células (adipócitos, condrócitos e osteócitos) para avaliar sua plasticidade in vitro. Ainda, foi caracterizada a expressão de marcadores moleculares por meio da imunocitoquímica (OCT4, SOX2, Nanog, REX1) e RT-qPCR (OCT4, SOX2, Nanog, LIN28, REX1). A segunda meta teve como enfoque a derivação de células iPSC a partir das linhagens tronco multipotentes obtidas anteriormente. A derivação das linhagens iPSC foi testada pelo uso de integração gênica que exprimem quatro fatores de transcrição (c-Myc, Klf4, Oct4 e Sox2) pelos métodos de nucleofecção, lipofecção ou lentiviral. As colônias do tipo iPSC foram obtidas somente pelo método de nucleofecção e foram repicadas isoladamente. Porém, falharam em estabelecer linhagens clonais para posterior caracterização. A terceira meta deste trabalho visou estabelecer linhagens de células semelhantes as germinativas primordiais (“Primordial germ cell-like” PGCLs). Devido a falha em reprogramar as células-tronco adultas em iPSC, foram estabelecidas as linhagens de PGCLs por diferenciação de células de chifre, gordura e pele, passando pela fase de células semelhantes as epiblásticas (“epiblast-like cells” EpiLCs) e posteriormente sendo diferenciadas nas PGCLs. Após diferenciação, as PGCLs foram submetidas a testes de imunocitoquímica (DDX4 e DAZL) e RT-qPCR (DDX4, Stra8, Stella, Fragilis, OCT4). Ainda, foi testada a influência do ácido retinoico e do BMP4, bem como os sistemas de cultivo em adesão e em suspensão para a diferenciação das células multipotentes em PGCLs. / FAPESP: 13/13972-0

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa, progressiva de início tardio que afeta principalmente os neurônios motores (NM). As causas que levam os NM à morte são variadas e ainda sendo investigadas. A descoberta de alterações genéticas como uma possível causa de ELA deu início à uma nova era na investigação desta afecção. Atualmente existem mais de 30 genes associados com a doença, entre eles o FUS, um gene que frequentemente aparece mutado em casos familiais da doença. A proteína FUS normalmente se localiza predominantemente no núcleo, mas na maioria dos casos de mutações na FUS relacionadas à ELA, ela aparece retida no citoplasma. O presente estudo traz um paciente de ELA (P) portando a mutação p.R521H no gene FUS e três de seus irmãos (dos quais um é portador da mutação e não apresnta sinais clínicos de ELA, e os outros dois não apresentam mutações no FUS) dos quais foram obtidas amostras de sangue e biópsia de pele. O DNA extraído das amostras de sangue, foi submetido ao sequenciamento do tipo Sanger para verificar a presença, ou ausência, da mutação R521H na FUS. A partir dos fibroblastos dos participantes, foram derivadas linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (iPSC). As iPSC produzidas passaram por ensaios a fim de indicar o estado de pluripotência e de indiferenciação destas linhagens. Nós investigamos a posição da proteína FUS nas linhagens de iPSC e de fibroblastos e há evidências que, assim como descrito na literatura, a proteína FUS aparece retida no citoplasma das linhagens do paciente e de seu irmão portador da mutação. Desta forma, o presente estudo associa dois irmãos com quadros clínicos discordantes mas que apresentam a mesma mutação e sinais moleculares patológicos semelhantes. As linhagens de iPSC obtidas são um rico material para o uso em pesquisas futuras sobre a ELA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a late onset, progressive, neurodegenerative disease that primarily affects motor neurons (MNs). The causes behind motor neuron death are diverse and still under investigation. The discovery of genetic alterations as possible causes of ALS initiated a new era for ALS research. There are currently over 30 genes associated with the disease, among which is FUS, one of the most frequently mutated in familial cases. The FUS protein is predominantly located in the nucleus, but in most of the ALS-related FUS mutations this protein is dislocated to the cytoplasm. The present work investigates the molecular aspects of a specific FUS mutation, p.R521H. An ALS patient (P) harboring the mutation and three siblings (of which one is a non-affected carrier and two present no mutations in FUS) were analyzed using blood samples and skin biopsies. We extracted DNA from blood samples and submitted it to Sanger sequencing for confirmation of the presence, or absence, of the R521H FUS mutation. The fibroblasts obtained from these biopsies were used for iPSC derivation. Assays were performed to confirm the undifferentiated state and pluripotency for the four strains obtained. We investigated the FUS location in these strains, and there is evidence for FUS retention in the cytoplasm of cells harboring the mutation (as seen in recent literature). Thus, this work associates two siblings with the same pathogenic mutation, showing the same molecular pathological signal but with discording clinical phenotypes. The iPSC strains obtained here are a valuable resource for further ALS investigation

As células-tronco embrionárias (CTEs), extraídas da massa celular interna do blastocisto, tem como características principais a capacidade de auto-renovação e a pluripotência. Durante o desenvolvimento, as células perdem seu potencial de diferenciação e adquirem um perfil de expressão gênica mais restrito, modulado por mecanismos epigenéticos, assim como por microRNAs. Membros da família miR-29 têm como transcritos alvos enzimas responsáveis pela metilação da citosina em 5mC (DNMT3a e 3b) e também da desmetilação (TET1, 2 e 3) do DNA, pela hidroxilação de 5mC em 5hmC. Recentes trabalhos sugerem que a modulação do miR-29 sobre estes alvos teria um papel no início da diferenciação em CTEs de camundongos e no aumento de eficiência da geração de iPS em células humanas. No presente trabalho, buscou-se compreender o papel regulatório do miR-29a em seus alvos epigenéticos no contexto da pluripotência e no início da diferenciação com atRA. Para tanto, duas linhagens celulares pluripotentes humanas (H1 e NTera- 2) foram submetidas a indução de diferenciação com atRA e ao ganho de função do miR-29a durante quatro dias de cultivo para análises de expressão gênica. Ademais, em NT2, realizamos ensaios funcionais por microscopia de imunofluorescência quantitativa para avaliar os efeitos do ganho e perda de função do miR-29a, DNMT3b e TET1, sobre a expressão nuclear de OCT4 e os perfis globais de 5mC e 5hmC após 96 horas de transfecção. Neste ensaio, também avaliamos o papel específico da regulação pós-transcricional de DNMT3b e TET1 pelo miR-29a, utilizando moléculas bloqueadoras dos sítios alvo (TSB) do miR-29a nestes transcritos. Observamos que sob a indução do atRA, os níveis de expressão do miR- 29a e de seus genes alvos (com exceção de DNMT3b), assim como dos marcadores de endoderme e ectoderme, aumentaram, seguido da diminuição dos marcadores de pluripotência em ambas as linhagens. A transfecção de moléculas mímicas do miR-29a, reduziu os níveis de seus transcritos alvos após dois e quatro dias em NT2 e H1, além de reduzir os níveis nucleares de DNMT3b em NT2. Ainda, ocorreu um aumento na expressão de genes da endoderme, mesoderme e ectoderme em H1 e a queda da expressão gênica e nuclear de OCT4 em NT2. Com o uso de siRNA específicos, demonstramos que o knockdown dos níveis nucleares de DNMT3b foi acompanhado de uma queda nos níveis globais de 5mC e um aumento de OCT4 e de 5hmC. Já o knockdown de TET1, elevou os níveis de 5mC, mas também os níveis de 5hmC e OCT4 nuclear. As avaliações com o uso de TSB contra os sítios de ligação do miR-29a em seus transcritos alvo, TET1 e DNMT3b, demonstraram que em células NT2, o bloqueio da ligação do miR endógeno aos seus alvos resultam no aumento dos níveis globais de 5hmC, indicando que a regulação póstranscricional destes alvos pelo miR-29 teria um importante papel na regulação epigenética de células pluripotentes. / Embryonic stem cells (CTEs), extracted from the internal cell mass of the blastocyst, are main characterized by the capacity for self-renewal and pluripotency. During development, the cells lose their differentiation potential and acquire a restricter gene expression profile, modulated by epigenetic mechanisms, as microRNAs. Members of the miR-29 family have as target transcripts enzymes for cytosine methylation in 5mC (DNMT3a and 3b) and for DNA demethylation (TET1, 2 and 3), by hydroxylation of 5mC in 5hmC. Recent studies suggest that the modulation of miR-29 on these targets plays a role in early differentiation of mouse CTEs and in increasing human iPS cell generation efficiency. In the present study, we sought to understand the regulatory role of miR-29a in its epigenetic targets in the context of pluripotency and in early differentiation with atRA. For this, two human pluripotent cell lines (H1 and NTera-2) were submitted to differentiation induction with atRA and function gain of miR-29a during four days of culture for gene expression analysis. Furthermore, in NT2, we performed functional assays by quantitative immunofluorescence microscopy to evaluate the gain- and loss-of-function of miR-29a, DNMT3b and TET1 in the OCT4 nuclear expression and global profiles of 5mC and 5hC, 96 hours posttransfection. In this assay, we also evaluated the specific role of post-transcriptional regulation of DNMT3b and TET1 by miR-29a, using target site blocking molecules (TSB) of miR-29a. We observed that under the induction of atRA, the miR-29a expression levels and its target genes (except of DNMT3b), further the markers of endoderm and ectoderm, increased, followed by decreased pluripotency markers in both cell lines. Transfection of mimic molecules of miR-29a reduced the levels of their target transcripts after two and four days in NT2 and H1, and reduced nuclear levels of DNMT3b in NT2. In addition, the expression of endoderm, mesoderm and ectoderm genes increased in H1 and gene and nuclear expression of OCT4 decreased in NT2. With the use of specific siRNA, we demonstrated that the knockdown of nuclear levels of DNMT3b was accompanied by a drop in global 5mC levels and an increase of OCT4 and 5hmC. While, the knockdown of TET1 increased the levels of 5mC, 5hmC and nuclear OCT4. Evaluations using TSB against the miR- 29a binding sites in their target transcripts, TET1 and DNMT3b, show that in NT2 cells blocking the binding of endogenous miR to their targets results in an increase in global 5hmC levels, indicating that the post-transcriptional regulation of these targets by miR-29 would play an important role in the epigenetic regulation of pluripotent cells.

Submitted by Midyan Daroz Guastali null (midyandaroz@yahoo.com.br) on 2017-01-03T01:56:59Z No. of bitstreams: 1 Tese Midyan Daroz Guastali.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) / Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2017-01-05T17:01:08Z (GMT) No. of bitstreams: 1 gustali_md_dr_bot.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-05T17:01:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 gustali_md_dr_bot.pdf: 2861555 bytes, checksum: c216487663d3f87a9c02daf9609ce263 (MD5) Previous issue date: 2016-12-01 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / As pesquisas envolvendo a biologia das células-tronco abordam um amplo espectro de fenômenos, que vão desde o nível tecidual e celular, até o seu uso em terapias celulares. Esta crescente atenção sugere que é necessário estudar conceitos básicos da biologia das células-tronco para compreender completamente os processos de diferenciação funcional. Desta forma, o instrumento da reprogramação celular por meio da manipulação gênica fornece subsídios para melhor compreender os processos de renovação e diferenciação que constituem as características fundamentais das células-tronco. A obtenção dessas células em medicina veterinária visa validar diversos modelos experimentais domésticos, como o equino, na busca de novos fármacos e terapias alternativas para reabilitação. Uma série de estudos, porém, ainda são necessários para que tais aplicações sejam viáveis, uma vez que os mecanismos fundamentais das técnicas empregadas ainda não estão totalmente elucidados. Embora a reprogramação celular por meio de vetores virais tenha sido relatada com sucesso em diversas espécies animais, outras técnicas também podem ser empregadas, como o uso de transposons, sequências de DNAs capazes de se movimentar de uma região para outra no genoma de uma célula. Não se tem conhecimento de qual o melhor tipo celular a ser utilizado, e nem tão pouco qual a metodologia de reprogramação mais eficiente. Sabe-se que o cordão umbilical possui uma reserva rica em células-tronco mesenquimais, as quais por serem multipotentes podem melhorar a eficiência de obtenção de células de pluripotência induzida (iPS) em comparação ao uso de fibroblastos, pouco eficientes ao serem reprogramados. O objetivo deste trabalho foi obter iPS por meio de mecanismo viral e não-viral de fibroblastos adultos e células do cordão umbilical equino, visando observar qual o tipo de infecção e qual o tipo de célula é mais eficiente para reprogramação celular. Ambos os tipos celulares foram infectados com vetores virais e transposons contendo os genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, KLF-4; as células transformadas foram avaliadas quanto a morfologia, imunocitoquímica e citometria de fluxo com os marcadores típicos de células-tronco pluripotentes e também quanto as alterações causadas no perfil de expressão gênica das células pelo método de PCR em tempo real; por fim as células reprogramadas foram induzidas a se diferenciarem em tecidos dos 3 folhetos germinativos. Os resultados demostraram que tanto os fibroblastos quanto as células do cordão umbilical submetidos à infecção viral apresentaram características de células pluripotentes como morfologia característica, marcação positiva para fatores de pluripotência e expressão gênica específica. Os corpos embrióides formados também apresentaram marcação imunocitoquimica para ectoderme, mesoderme e endoderme. Apesar do tempo para inicio da formação das colônias serem parecidos (7 dias para os fibroblastos e 6 dias para as células do cordão umbilical), a expansão das colônias dos fibroblastos reprogramados foi lenta, com a 1ª passagem realizada 30 dias após a infecção em comparação com as colônias de cordão umbilical, nas quais a 1ª passagem foi realizada após 15 dias. Não foi verificada reprogramação efetiva as infecções com transposons em nenhum dos dois tipos celulares. Conclui-se que o método de infecção por vetor viral em células do cordão umbilical é mais eficiente do que em fibroblastos e que em ambos os tipos celulares, o mecanismo de transposons não resultou em células reprogramadas. / Researches on the biology of stem cells cover a broad spectrum of phenomena, ranging from tissue and cellular level, to their use in cell therapy. This growing attention suggests that is necessary to study basic concepts of stem cells organization in order to fully understand the functional differentiation processes. Thus, the cell reprogramming through gene manipulation provides grants to better understand the processes of renewal and differentiation which are the essential characteristics of stem cells. Obtaining these cells in veterinary medicine aims to validate various household experimental models, such as horses, on the search for new drugs and alternative therapies for rehabilitation. However, a number of studies is still necessary for such applications to be feasible, since the fundamental mechanisms of techniques employed are not fully elucidated yet. Although cell reprogramming using viral plasmid has been reported with success in several animal species, other techniques may also be employed, such use transposons, this is, DNAs sequences capable of moving from one region to another in the cell genome. The unawereness of what the best cell type to be used, and nor what is the most efficient reprogramming methodology. It is known that the cord has rich reserves mesenchymal stem cells, which are multipotent and can improve the efficiency of obtaining the induced Pluripotent Stem Cells (iPS) compared to the use of fibroblast, inefficient to be reprogrammed. The aim of this study was to obtain iPS through viral transfection and non-viral adult fibroblasts and equine cord cells, aiming to observe which transfection and cell type is more efficient for cell reprogramming. Both cell types was infected with viral vectors and transposons containing the genes OCT-4, SOX-2, c-MYC, and KLF-4; transformed cells were evaluated for morphology, immunocytochemistry and flow cytometry with the typical pluripotent stem cells markers and also for the changes caused in the gene expression profile of the cells by the PCR real time method; finally reprogrammed cells were induced to reprogram to differentiate into three germ layers tissues. The results showed that fibroblasts and cord cells subjected to viral infection presented pluripotent cell characteristics such as morphology, positive staining for antibodies and specific gene expression, immunocytochemistry of the formed embryoid bodies also showed labeling for ectoderm, mesoderm and endoderm. Despite the time to start colonies formation is very similar (7 days for fibroblasts and 6 days for cord cells), the expansion of reprogrammed fibroblasts colonies was slow, with the 1st performed 30 days post-infection in comparison with umbilical cord colonies, in which the 1st pass on cord colonies after 15 days. No effective reprogramming of transposon infections was observed in either cell type. It is concluded that the method of viral vector infection in umbilical cord cells is more efficient than in fibroblasts and that in both cell types, the mechanism of transposons did not result in reprogrammed cells. / FAPESP: 2012/18735-4

O estabelecimento de cultivo de células-tronco embrionárias (ESC) ainda não foi realizado com sucesso. Verificação de marcadores de pluripotência e diferenciação nos três folhetos germinativos são necessárias para validação de uma linhagem celular pluripotente. O objetivo deste estudo foi estabelecer e caracterizar o cultivo de ESC suínas usando Matrigel e comparar a expressão dos marcadores de pluripotência Oct-4, CD9 e α6-integrina em embriões. Blastocistos in vitro ou in vivo foram submetidos à imunocirurgia para cultura da massa celular interna, fixados para imunocitoquímica ou extração de RNA total para RT-PCR. Nenhuma colônia de ESC foi obtida usando co-cultivo em fibroblastos embrionários murinos (MEF) ou em Matrigel. Expressão de Oct-4, CD9 e α6-integrina foi detectada por PCR. Os produtos de PCR de CD9 e α6-integrina tiveram suas sequências nucleotídicas determinadas e comparadas com bases de dados públicas. O produto de CD9 foi idêntico à seqüência do CD9 suíno e o produto de α66integrina foi similar à humana e eqüina. Reação de Imunocitoquímica revelou a presença de Oct-4 no citoplasma de células da massa celular interna e do trofoblasto. CD9 e α6-integrina foram observados preferencialmente em células do trofoblasto. Não foi possível comparar a expressão dos marcadores de pluripotência entre ESC e embriões em suínos. Porém, este estudo descreve pela primeira vez a expressão de CD9 e α6-integrina em blastocistos suínos, os quais podem não estar relacionados com células pluripotentes embrionárias suínas. / Establishment of embryonic stem cell (ESC) culture in pigs has not been achieved. Verification of pluripotency markers and differentiation in the three embryonic layers are necessary for validation of a pluripotent cell line. The objective of this study was to establish and characterize porcine ESC culture using Matrigel and compare the expression of pluripotency markers Oct-4, CD9 and α6-integrin with embryos. In vitro or in vivo porcine blastocysts were submitted to immunosurgery for culture of inner cell mass, fixation for immunocytochemistry or total RNA extraction for RT-PCR. No ESC colonies were obtained using co-culture on mouse embryonic fibroblasts (MEF) or on Matrigel. Expression of Oct-4, CD9 and α6-integrin was detected by PCR. CD9 and α6-integrin PCR products had their nucleotide sequence assessed and compared with public nucleotide database. CD9 product was identical to CD9 porcine sequences and α6-integrin product was similar to human and equine α6-integrin. Immunocytochemistry revealed Oct-4 expression in cytoplasm of the inner cell mass and trophoblast cells. CD9 and α6-integrin were observed preferentially on trophoblast cells. It was not possible to compare expression of pluripotency markers between porcine ESC and embryos. However, this study describes for the first time expression of CD9 and α6-integrin in porcine blastocysts, which may not be related to pluripotent porcine embryonic cells.

A família Bromeliaceae apresenta importância ecológica e econômica, desta forma, o desenvolvimento de protocolos para a micropropagação de espécies dessa família, faz-se necessário, a fim de suprir sua demanda comercial e mesmo ecológica. A escolha do meio de cultura e do explante utilizado durante a micropropagação são fundamentais para um protocolo eficaz. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi avaliar as diferenças quantitativas e qualitativas no desenvolvimento de explantes de Neoregelia sp em meios de cultura e monitorar as vias morfogênicas dos propágulos obtidos em explantes foliares. Para tanto, brotos de microcepas e explantes foliares procedentes de um micro jardim clonal, foram transferidos para os meios de cultura de multiplicação MS, ½ MS e WPM, todos suplementados com 0,050 mg.L-1 ANA e 0,50 mg.L-1 de BAP, onde foram mantidos por 120 dias e submetidos a diversas análises morfofisiológicas. Paralelamente, explantes foliares foram mantidos em meio de cultura MS de multiplicação para o monitoramento das vias morfogênicas durante os processos regenerativos. Para os experimentos com brotos de microcepas verificou-se que o meio de cultura MS proporcionou a melhor taxa de multiplicação, maior crescimento dos brotos, obtendo os valores mais elevados de peso de matéria fresca e seca, além disso, apresentaram maior acúmulo de nitrogênio total e proteico. No entanto, os meios de cultura ½ MS e WPM promoveram uma taxa de multiplicação semelhante a do MS, mas com brotos menores e menos vigorosos, porém, mais homogêneos, com isso, na dependência do objetivo do cultivo in vitro, não deve ser desconsiderada a possibilidade de utilização dos meios de cultura ½ MS e WPM. Os explantes foliares não se desenvolveram bem no meio de cultura WPM, não havendo diferença entre os meios MS e ½ MS, visto que ambos apresentaram resultados satisfatórios. As análises histológicas e histoquímicas identificaram células parenquimáticas, que atuam como células-tronco, manifestando capacidade morfogênica para toti ou pluripotência, dando origem respectivamente a embriões somáticos e gemas adventícias, em resposta aos estímulos in vitro. / The Bromeliaceae family has an ecological and economic importance, therefore, the protocols development for micropropagation of species of this family becomes necessary in order to meet its business and even its ecological demand. The choice of culture medium and the explant used during micropropagation are essential for an effective protocol. Thus, the aim of this study was to evaluate the quantitative and qualitative differences in the explants development of Neoregelia sp in the culture media and monitor the morphogenetic pathways of obtained propagules from leaf explants. Consequently, shoots and leaf explants coming from microcloning garden were transferred to the MS, ½ MS and WPM multiplication culture media, all supplemented with 0.050 mg.L-1 NAA and 0.50 mg.L-1 BAP, where they were held for 120 days and submitted to morphological and physiological analysis. Therefore, leaf explants were kept on MS-medium multiplication for monitoring morphogenetic pathways during the regenerative processes. Furthermore, MS medium showed the best multiplication rate for the sprouts of the microstumps, increased growth of shoots, obtaining the highest values of fresh and dry matter weight, and also showed higher accumulation of total nitrogen and protein. However, the ½ MS and WPM culture media promoted a similar multiplication rate to the MS medium, with the development of the smaller and less vigorous shoots, but with greater homogeneity. This way, depending on the purpose of in vitro culture, their use in the micropropagation for this species should not be disregarded. The leaf explants are not well developed in WPM medium, and don\'t had significant difference between the MS and ½ MS culture medium, as both showed satisfactory results. The histological and histochemical analysis identified the presence of the parenchymatic cells, which act as stem cells, expressing morphogenic ability for toti or pluripotency, leading respectively to somatic embryogenesis or adventitious organogenesis in response to in vitro stimuli.

A esclerose lateral amiotrófica (ELA) é uma doença neurodegenerativa, progressiva de início tardio que afeta principalmente os neurônios motores (NM). As causas que levam os NM à morte são variadas e ainda sendo investigadas. A descoberta de alterações genéticas como uma possível causa de ELA deu início à uma nova era na investigação desta afecção. Atualmente existem mais de 30 genes associados com a doença, entre eles o FUS, um gene que frequentemente aparece mutado em casos familiais da doença. A proteína FUS normalmente se localiza predominantemente no núcleo, mas na maioria dos casos de mutações na FUS relacionadas à ELA, ela aparece retida no citoplasma. O presente estudo traz um paciente de ELA (P) portando a mutação p.R521H no gene FUS e três de seus irmãos (dos quais um é portador da mutação e não apresnta sinais clínicos de ELA, e os outros dois não apresentam mutações no FUS) dos quais foram obtidas amostras de sangue e biópsia de pele. O DNA extraído das amostras de sangue, foi submetido ao sequenciamento do tipo Sanger para verificar a presença, ou ausência, da mutação R521H na FUS. A partir dos fibroblastos dos participantes, foram derivadas linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (iPSC). As iPSC produzidas passaram por ensaios a fim de indicar o estado de pluripotência e de indiferenciação destas linhagens. Nós investigamos a posição da proteína FUS nas linhagens de iPSC e de fibroblastos e há evidências que, assim como descrito na literatura, a proteína FUS aparece retida no citoplasma das linhagens do paciente e de seu irmão portador da mutação. Desta forma, o presente estudo associa dois irmãos com quadros clínicos discordantes mas que apresentam a mesma mutação e sinais moleculares patológicos semelhantes. As linhagens de iPSC obtidas são um rico material para o uso em pesquisas futuras sobre a ELA / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a late onset, progressive, neurodegenerative disease that primarily affects motor neurons (MNs). The causes behind motor neuron death are diverse and still under investigation. The discovery of genetic alterations as possible causes of ALS initiated a new era for ALS research. There are currently over 30 genes associated with the disease, among which is FUS, one of the most frequently mutated in familial cases. The FUS protein is predominantly located in the nucleus, but in most of the ALS-related FUS mutations this protein is dislocated to the cytoplasm. The present work investigates the molecular aspects of a specific FUS mutation, p.R521H. An ALS patient (P) harboring the mutation and three siblings (of which one is a non-affected carrier and two present no mutations in FUS) were analyzed using blood samples and skin biopsies. We extracted DNA from blood samples and submitted it to Sanger sequencing for confirmation of the presence, or absence, of the R521H FUS mutation. The fibroblasts obtained from these biopsies were used for iPSC derivation. Assays were performed to confirm the undifferentiated state and pluripotency for the four strains obtained. We investigated the FUS location in these strains, and there is evidence for FUS retention in the cytoplasm of cells harboring the mutation (as seen in recent literature). Thus, this work associates two siblings with the same pathogenic mutation, showing the same molecular pathological signal but with discording clinical phenotypes. The iPSC strains obtained here are a valuable resource for further ALS investigation

As células-tronco embrionárias (CTEs), extraídas da massa celular interna do blastocisto, tem como características principais a capacidade de auto-renovação e a pluripotência. Durante o desenvolvimento, as células perdem seu potencial de diferenciação e adquirem um perfil de expressão gênica mais restrito, modulado por mecanismos epigenéticos, assim como por microRNAs. Membros da família miR-29 têm como transcritos alvos enzimas responsáveis pela metilação da citosina em 5mC (DNMT3a e 3b) e também da desmetilação (TET1, 2 e 3) do DNA, pela hidroxilação de 5mC em 5hmC. Recentes trabalhos sugerem que a modulação do miR-29 sobre estes alvos teria um papel no início da diferenciação em CTEs de camundongos e no aumento de eficiência da geração de iPS em células humanas. No presente trabalho, buscou-se compreender o papel regulatório do miR-29a em seus alvos epigenéticos no contexto da pluripotência e no início da diferenciação com atRA. Para tanto, duas linhagens celulares pluripotentes humanas (H1 e NTera- 2) foram submetidas a indução de diferenciação com atRA e ao ganho de função do miR-29a durante quatro dias de cultivo para análises de expressão gênica. Ademais, em NT2, realizamos ensaios funcionais por microscopia de imunofluorescência quantitativa para avaliar os efeitos do ganho e perda de função do miR-29a, DNMT3b e TET1, sobre a expressão nuclear de OCT4 e os perfis globais de 5mC e 5hmC após 96 horas de transfecção. Neste ensaio, também avaliamos o papel específico da regulação pós-transcricional de DNMT3b e TET1 pelo miR-29a, utilizando moléculas bloqueadoras dos sítios alvo (TSB) do miR-29a nestes transcritos. Observamos que sob a indução do atRA, os níveis de expressão do miR- 29a e de seus genes alvos (com exceção de DNMT3b), assim como dos marcadores de endoderme e ectoderme, aumentaram, seguido da diminuição dos marcadores de pluripotência em ambas as linhagens. A transfecção de moléculas mímicas do miR-29a, reduziu os níveis de seus transcritos alvos após dois e quatro dias em NT2 e H1, além de reduzir os níveis nucleares de DNMT3b em NT2. Ainda, ocorreu um aumento na expressão de genes da endoderme, mesoderme e ectoderme em H1 e a queda da expressão gênica e nuclear de OCT4 em NT2. Com o uso de siRNA específicos, demonstramos que o knockdown dos níveis nucleares de DNMT3b foi acompanhado de uma queda nos níveis globais de 5mC e um aumento de OCT4 e de 5hmC. Já o knockdown de TET1, elevou os níveis de 5mC, mas também os níveis de 5hmC e OCT4 nuclear. As avaliações com o uso de TSB contra os sítios de ligação do miR-29a em seus transcritos alvo, TET1 e DNMT3b, demonstraram que em células NT2, o bloqueio da ligação do miR endógeno aos seus alvos resultam no aumento dos níveis globais de 5hmC, indicando que a regulação póstranscricional destes alvos pelo miR-29 teria um importante papel na regulação epigenética de células pluripotentes. / Embryonic stem cells (CTEs), extracted from the internal cell mass of the blastocyst, are main characterized by the capacity for self-renewal and pluripotency. During development, the cells lose their differentiation potential and acquire a restricter gene expression profile, modulated by epigenetic mechanisms, as microRNAs. Members of the miR-29 family have as target transcripts enzymes for cytosine methylation in 5mC (DNMT3a and 3b) and for DNA demethylation (TET1, 2 and 3), by hydroxylation of 5mC in 5hmC. Recent studies suggest that the modulation of miR-29 on these targets plays a role in early differentiation of mouse CTEs and in increasing human iPS cell generation efficiency. In the present study, we sought to understand the regulatory role of miR-29a in its epigenetic targets in the context of pluripotency and in early differentiation with atRA. For this, two human pluripotent cell lines (H1 and NTera-2) were submitted to differentiation induction with atRA and function gain of miR-29a during four days of culture for gene expression analysis. Furthermore, in NT2, we performed functional assays by quantitative immunofluorescence microscopy to evaluate the gain- and loss-of-function of miR-29a, DNMT3b and TET1 in the OCT4 nuclear expression and global profiles of 5mC and 5hC, 96 hours posttransfection. In this assay, we also evaluated the specific role of post-transcriptional regulation of DNMT3b and TET1 by miR-29a, using target site blocking molecules (TSB) of miR-29a. We observed that under the induction of atRA, the miR-29a expression levels and its target genes (except of DNMT3b), further the markers of endoderm and ectoderm, increased, followed by decreased pluripotency markers in both cell lines. Transfection of mimic molecules of miR-29a reduced the levels of their target transcripts after two and four days in NT2 and H1, and reduced nuclear levels of DNMT3b in NT2. In addition, the expression of endoderm, mesoderm and ectoderm genes increased in H1 and gene and nuclear expression of OCT4 decreased in NT2. With the use of specific siRNA, we demonstrated that the knockdown of nuclear levels of DNMT3b was accompanied by a drop in global 5mC levels and an increase of OCT4 and 5hmC. While, the knockdown of TET1 increased the levels of 5mC, 5hmC and nuclear OCT4. Evaluations using TSB against the miR- 29a binding sites in their target transcripts, TET1 and DNMT3b, show that in NT2 cells blocking the binding of endogenous miR to their targets results in an increase in global 5hmC levels, indicating that the post-transcriptional regulation of these targets by miR-29 would play an important role in the epigenetic regulation of pluripotent cells.

As células pluripotentes (CPs), em teoria, são capazes de dar origem a todos os mais de 200 tipos de células do organismo. Na natureza, há três tipos de células pluripotentes: células-tronco embrionárias, células germinais embrionárias e células de carcinoma embrionário. As características das CPs têm permitido um importante avanço para a pesquisa básica e apontam uma grande aplicabilidade na medicina regenerativa. No núcleo das CPs existem fatores atuantes responsáveis pela manutenção da identidade pluripotente; dentre eles destacam-se OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 e MYC. Muito já se sabe sobre os mecanismos que estes fatores atuam para promover a manutenção da pluripotência celular. Baseados nestes estudos foi possível gerar células de pluripotência induzida (iPSCs). Porém, os mecanismos moleculares que direcionam a indução da pluripotência ainda não estão muito bem esclarecidos. Alguns estudos revelaram que componentes chaves da via NFB estão envolvidos na regulação da pluripotência, bem como na diferenciação e destino celular das células-tronco. Neste estudo, analisamos a participação de componentes da via canônica (RelA e NFB1) e não-canônica (RelB e NFB2) de NFB nos processos de diferenciação e destino celular ou manutenção da pluripotência. Para isto usamos técnicas de PCR quantitativa em Tempo Real (qPCR) e Imunoprecipitação de Cromatina (ChIP) investigando os papéis das vias canônica e não-canônica de NFB na manutenção da pluripotência e diferenciação de CPs, em um modelo de indução de diferenciação celular mediado por ácido trans-retinóico (atRA) em células de carcinoma embrionário NTera-2. Foram avaliadas as ligações dos fatores de transcrição RelA e RelB nas regiões promotoras dos genes OCT4, SOX2, MYC, KLF4 e GFAP e a regulação transcricional associada. Nossos resultados identificaram que as células não tratadas com atRA apresentaram níveis baixos na expressão dos componentes da via canônica de NFB, RelA e NFB1, e GFAP e quando induzidas à diferenciação por atRA durante 4 dias esses níveis se elevaram. Uma situação oposta foi vista nos componentes da via não-canônica de NFB, RelB e NFB2, e na expressão dos fatores de pluripotência OCT4, NANOG, SOX2 e KLF4, que apresentaram níveis de expressão elevados nas células não tratadas com atRA e sofreram redução com a indução da diferenciação celular. O ensaio de ChIP revelou que RelA liga-se nas regiões de regulação dos genes OCT4, SOX2, KLF4, MYC e GFAP apenas quando a célula está em processo de diferenciação, enquanto RelB se apresentou ligado às mesmas regiões tanto nas células indiferenciadas quanto naquelas induzidas à diferenciação por 4 dias. Com estes dados sugerimos que a via canônica de NFB pode estar relacionada com o processo de diferenciação e destino celular através da regulação negativa executada por RelA e NFB1 nos genes responsáveis pela identidade pluripotente das células aqui estudadas enquanto a via não-canônica de NFB, representada pela ativação de RelB e NFKB2, pode participar na manutenção da pluripotência através da regulação positiva destes mesmos fatores. / Human pluripotent stem cells (hPSCs) are able to give rise to all the 200 cell types of the adult organism. In nature, there are three types of hPSCs: embryonic stem cells, germ line stem cells and embryonal carcinoma cells. hPSCs characteristics have allowed a major advance in basic research, and are thought to have great applicability in regenerative medicine. In the nucleus of hPSCs there are transcription factors responsible for the maintenance of their pluripotent identity. OCT4, NANOG, SOX2, KLF4 and MYC are considered the core pluripotency factors in hPSCs. A great deal of knowledge about the mechanisms that promote and maintain pluripotency has been generated. Based on these studies it was possible to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs). However, the molecular mechanisms that drive the induction of pluripotency are not fully understood. Some studies have recently indicated that key components of the NFkB may be involved in regulating pluripotency as well as cell differentiation and cell fate. In this study we analyzed the involvement of components of the canonical (RelA and NFB1) and the non-canonical NFB pathways (RelB and NFB2) in the maintenance of pluripotency, differentiation and cell fate processes. The techniques of quantitative real-time PCR (qPCR) and chromatin immunoprecipitation (ChIP) were used to interrogate the roles of the canonical and non-canonical NFB pathways in maintenance of pluripotency and differentiation in a model of cell differentiation induced by all trans-retinoic acid (atRA) on embryonal carcinoma cells NTera-2. The transcription factors RelA and RelB occupancy in the promoter regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC and GFAP, and the transcriptional regulation associated were evaluated. Our results showed that undifferentiated cells exhibited low expression levels of canonical NFB pathway components, RelA and NFB1, while cells induced to differentiate for 4 days exhibited downregulated expression of these factors. In the other hand, the non-canonical NFB pathway components, RelB and NFB2, and the pluripotency factors OCT4, NANOG, SOX2 and KLF4 were expressed in higher levels in undifferentiated cells, and were downregulated upon the differentiation process. ChIP assay revealed that RelA binds to the regulatory regions of OCT4, SOX2, KLF4, MYC, and GFAP only when cells are induced to differentiate, while RelB was found bound to the same regions in both undifferentiated and differentiated cells. This data suggests that the canonical NFB pathway may be associated to differentiation and cell fate processes by downregulation of genes responsible for the pluripotent identity, and that the non-canonical NFB pathway may act in the maintenance of pluripotency through the upregulation of the same factors.