Células pluripotentes são aquelas que possuem a capacidade de dar origem às células dos três folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma e endoderma), bem como também às células germinativas. As células-tronco embrionárias (CTE) são as células pluripotentes mais conhecidas, as quais apresentam uma elevada capacidade de diferenciação celular e autorenovação. Estas propriedades tornam as CTE potenciais ferramentas para a medicina regenerativa, porém seu uso na prática clínica enfrenta várias barreiras. Neste sentido, o acúmulo de conhecimento a respeito dos mecanismos envolvidos na manutenção da pluripotência, levou ao desenvolvimento de técnicas capazes de induzir a pluripotência em células somáticas adultas. Na maioria das abordagens, isto se dá pela expressão ectópica de fatores de transcrição envolvidos na pluripotência (como Oct4 e Nanog). Com isto em vista, torna-se evidente que estudos que levem a um melhor entendimento destas propriedades biológicas, podem levar ao desenvolvimento desta importante área. Apesar destas inovações, os mecanismos responsáveis pela manutenção ou indução da pluripotência e da autorenovação, continuam largamente inexplorados. Neste sentido, o conjunto de técnicas referidas como High Content Screening (HCS) apresenta características fundamentais que permitiriam a interrogação sistemática e em larga-escala de fatores que possam estar influenciando nestes processos. A técnica de HCS se baseia no uso de microscopia de fluorescência em placas de 96 ou mais poços, permitindo a aquisição e a análise automatizada das imagens, de forma a quantificar alterações fenotípicas nas células. O presente trabalho teve como objetivo estabelecer um modelo experimental para a avaliação funcional e em larga escala de fatores que possam influenciar a diferenciação celular. Tendo em vista a facilidade de cultivo e manuseio, a linhagem humana de células pluripotentes de carcinoma embrionário (CCE) NTera-2, foi utilizada. Para a padronização do modelo, o processo de diferenciação foi avaliado ao longo do tempo (em 2, 4 e 8 dias) na presença ou ausência de ácido transretinóico (atRA), utilizado como indutor de diferenciação celular. Para isso, os níveis transcricionais de Oct4, Nanog (marcadores da pluripotência) e de N-Caderina foram avaliados por PCR em tempo real. Finalmente, a expressão e a distribuição celular de Oct4, Nanog e da alfa-actina foi avaliada por meio de microscopia de fluorescência automatizada, com o uso de anticorpos ou faloidina marcada, utilizando um sistema de HCS (Operetta, Perkin Elmer) para a análise dos resultados. A proliferação celular das células submetidas à diferenciação foi avaliada pelo ensaio do XTT. O atRA inibiu a proliferação e induziu a diferenciação; como demonstrado, respectivamente, pelos resultados do ensaio do XTT, decaimento dos níveis de Oct4 e Nanog e, concomitante aumento de N-Caderina, ao longo do tempo. Também foi observada a diferenciação espontânea da linhagem, na ausência de atRA, porém, de forma reduzida. Finalmente, as avaliações de HCS evidenciaram que, durante o processo de diferenciação, a perda da expressão nuclear de Oct4 e Nanog está associada à alteração do fenótipo celular, com a redistribuição da actina cortical e a formação das stress fibers, caracterizando o processo de transição epitélio-mesenquima (EMT), um importante mecanismo envolvido na diferenciação celular. Os resultados obtidos neste trabalho demonstram a viabilidade do uso da linhagem NTera-2 como modelo para estudos futuros de HCS visando a identificação de moléculas que atuem na modulação de propriedades fundamentais das células tronco pluripotentes. / Pluripotent stem cells are those that possess the ability to generate cells from the three germ layers (ectoderm, mesoderm and endoderm), as well as the germ cells. The embryonic stem cells (ESC) are the best known pluripotent cells that present a high capacity of cell differentiation and self renewal. These properties of the ESC make them potential tools for the regenerative medicine, but their use in clinical practice faces several barriers. In this sense, the accumulation of knowledge about the mechanisms involved in the maintenance of pluripotency led to the development of techniques capable of inducing pluripotency in adult somatic cells. In most approaches, this is achieved by the ectopic expression of transcription factors involved in pluripotency (such as Oct4 and Nanog). With this in mind, it becomes clear that studies that provide a better understanding of these biological properties can lead to the development of this important area. Despite these innovations, the mechanisms responsible for the maintenance or induction of pluripotency and self-renewal remain largely unexplored. In this sense, the set of techniques such as High Content Screening (HCS) has fundamental characteristics that allow systematic and large-scale interrogation of factors that may be influencing these processes. The HCS technique is based on the use of fluorescence microscopy in 96-well or larger plates, allowing the automated acquisition and analysis of images, so as to measure phenotypic changes in the cells. This study aimed to establish an experimental model for functional and large-scale assessment of factors that may influence cellular differentiation. Due its simple cultivation and handling characteristics, a human lineage of pluripotent embryonal carcinoma cell (ECC) NTERA-2 was used. To standardize the model, the process of differentiation was evaluated over time (at 2, 4 and 8 days) in the presence or absence of all-trans retinoic acid (atRA), used as an inducer of cellular differentiation. The transcriptional levels of Oct4, Nanog (pluripotency markers) and Ncadherin were assessed by real time PCR. Finally, the expression and cellular distribution of Oct4, Nanog and alpha-actin was assessed by fluorescence microscopy, using antibodies or labelled phalloidin, using a HCS platform (Operetta, Perkin Elmer) for the analysis of the results. The proliferation of cells undergoing differentiation was assessed by XTT assay. atRA inhibited proliferation and induced differentiation, as shown by the XTT assay results, and the decay of Oct4 and Nanog, and concomitant increase of N-cadherin levels over time, respectively. It was also observed spontaneous differentiation in the absence of atRA although in less extent. Finally, the HCS results showed that during the differentiation process, the loss of nuclear expression of Oct4 and Nanog is associated with alteration of cell phenotype, with redistribution of cortical actin and formation of stress fibers, characterizing the epithelialmesenchymal transition (EMT), an important mechanism involved in cell differentiation. The results of this study therefore demonstrate the feasibility of using the NTERA-2 cell line as a model for future HCS studies aiming identification of molecules that act in the modulation of fundamental properties of pluripotent stem cells.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-29082013-155854 |
| Date | 07 June 2013 |
| Creators | Ildercílio Mota de Souza Lima |
| Contributors | Rodrigo Alexandre Panepucci, Vitor Marcel Faça, Flavio Vieira Meirelles |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Biológicas (Genética), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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