While the healthy brain works through balanced synaptic communication between
glutamatergic and GABAergic neurons to coordinate excitation (E) and inhibition (I), disruption
of E/I balance interferes with synaptic communication, information processing, and ultimately
cognition. Multiple line of evidence indicates that E/I imbalance represents the
pathophysiological basis of a wide spectrum of mental disorders. Genetic screening
approaches have identified Cadherin-13 (CDH13). as a risk gene across neurodevelopmental
and mental disorders. CDH13 regulates several cellular and synaptic processes in brain
development and neuronal plasticity in adulthood. In addition to other functions, it is specifically
localized at inhibitory synapses of parvalbumin- and somatostatin-expressing GABAergic
neurons. In support of CDH13’s function in moderating E/I balance, electrophysiological
recordings of hippocampal slices in a CDH13-deficient mouse model revealed an increase in
basal inhibitory but not excitatory synaptic transmission. Moreover, the search for genetic
variants impacting functional expression of the CDH13 gene identified SNP (single nucleotide
polymorphism)) rs2199430 in intron 1 to be associated with differential mRNA concentrations
in human post-mortem brain across the three genotypes CDH13G/G, CDH13A/G and CDH13A/A
.
This work therefore aimed to further validate these findings in a complementary human model
by using induced pluripotent stem cells (iPSCs). The application of human iPSCs in research
has replaced the use of embryonic cells, resolving the ethical conflict of destructive usage of
human embryos. Investigating CDH13’s mode of action in inhibitory synapses was predicted
to facilitate mechanistic insight into the effects of CDH13 gene variants on E/I network activity,
which can then be targeted to reinstate balance.
Genome-wide association studies have identified rare copy number variants (CNVs) resulting
in a deletion (or duplication) of CDH13. To reduce genetic background variance, a set of
isogenic iPSC lines with a gene dose-dependent deficiency of CDH13 (CDH13-/- and CDH13+/-
) was generated by using the Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic
Repeats/CRISPR-associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system. These CRISPRed iPSCs
carrying a single or two allele(s) with CDH13 inactivation facilitate investigation of CDH13
function in cellular processes, at inhibitory synapses and in neuronal network activity. In
addition, iPSCs carrying allelic SNP rs2199430 variants were used to study the effects of
common genetic variation of CDH13. These cell lines were differentiated into pure
glutamatergic and GABAergic neurons and co-cultured to generate neuronal networks allowing
its activity to be measured and correlated with electrophysiological signatures of differential
CDH13 genotypes. The work towards assessment of neuronal network activity of the iPSC
lines was subdivided into three major steps: first, generating rtTA/Ngn2 and rtTA/Ascl1-positive
iPSCs via a lentivirus-mediated approach; second, differentiating pure glutamatergic and
GABAergic neurons from the genetically transduced iPSCs and co-culturing of pure
glutamatergic and GABAergic neurons in a pre-established ratio (65:35) by direct
differentiation upon supplementation with doxycycline and forskolin on a microelectrode array
(MEA) chip; and, finally, recording of neuronal network activity of iPSC lines after 49 days in
vitro, followed by extraction and analyses of multiple MEA parameters.
x
Based on the MEA parameters, it was confirmed that complete CDH13 knockout as well as
heterozygous deficiency influence E/I balance by increasing inhibition. It was further revealed
that common SNP variation alters the signature of neuronal network activity. Specifically,
CDH13 deficiency resulted in a significant reduction in network burst duration (NBD), reduced
number of detected spikes within a network burst and reduction in network burst rate (NBR)
compared to the control (CDH13G/G). CDH13A/G and CDH13A/A showed similarities with the
CRISPRed CDH13-deficient networks by showing a significant reduction in the NBD and a
reduced number of detected spikes within a network compared to CDH13G/G. Strikingly. there
was a significant increase in the NBR of the CDH13A/G and CDH13A/A compared to CDH13G/G
networks. CDH13A/G networks exhibited significant differences in both parameters. At the
cellular level, this indicates that signalling pathways which determine the length and frequency
of network bursts differ among allelic variants of SNP rs2199430, thus confirming functional
relevance of this intronic SNP.
In summary, CDH13-deficient isogenic iPSC lines were generated using CRISPR/Cas9, iPSCs
were genetically transduced via a lentivirus approach, direct differentiation of
glutamatergic/GABAergic neurons derived from transduced iPSCs were used to establish a
scalable co-culture system, and network activity was recorded by MEA using pre-established
parameters to extract and analyze activity information. The results indicate that iPSC-derived
neuronal networks following CRISPR/Cas9-facilitated CDH13 inactivation, as well as networks
with allelic SNP variants of CDH13, moderate E/I balance, thus advancing understanding of
CDH13 function at inhibitory synapses and elucidating the effects of rare and common CDH13
gene variation. / Während das gesunde Gehirn auf der Basis einer ausgewogenen synaptischen
Kommunikation zwischen glutamatergen und GABAergen Neuronen arbeitet, um Exzitation
(E) und Inhibition (I) zu koordinieren, beeinträchtigt eine Störung des E/I-Gleichgewichts die
synaptische Kommunikation, die Informationsverarbeitung und letztlich die Kognition.
Zahlreiche Hinweise deuten darauf, dass ein eingeschränktes E/I-Gleichgewicht die
pathophysiologische Grundlage eines breiten Spektrums psychischer Erkrankungen darstellt.
Genetische Screening-Ansätze haben Cadherin-13 (CDH13) als Risikogen für
neuropsychiatrische Erkrankungen identifiziert. CDH13 reguliert mehrere zelluläre und
synaptische Prozesse bei der Gehirnentwicklung und der neuronalen Plastizität im
Erwachsenenalter. Neben anderen Funktionen ist es spezifisch an hemmenden Synapsen von
Parvalbumin- und Somatostatin-exprimierenden GABAergen Neuronen lokalisiert. Als Hinweis
für die Funktion von CDH13 bei der Regulierung des E/I-Gleichgewichts ergaben
elektrophysiologische Ableitungen von Hippocampusschnitten in einem CDH13-defizienten
Mausmodell einen Anstieg der basalen inhibitorischen, nicht aber der exzitatorischen
synaptischen Übertragung. Darüber hinaus wurde bei der Suche nach genetischen Varianten
die sich auf die funktionelle Expression des CDH13-Gens auswirken, der SNP (single
nucleotide polymorphism, Einzelbasenpolymorphismus) rs2199430 im Intron 1 identifiziert, der
mit den mRNA-Konzentrationen im menschlichen post-mortem Gehirn in einer vom Genotyp
CDH13G/G
- CDH13A/G- und CDH13A/A-abhängigen Weise assoziiert ist. Ziel dieser Arbeit war
es daher, diese Ergebnisse in einem komplementären menschlichen Modell unter
Verwendung induzierter pluripotenter Stammzellen (induced pluripotent stem cells, iPSCs) zu
bestätigen, und damit zu validieren. Die Anwendung menschlicher iPSCs in der Forschung hat
embryonale Zellen ersetzt und den ethischen Konflikt aufgelöst, der im Zusammenhang mit
der verbrauchenden Verwendung menschlicher Embryonen besteht. Die Untersuchung der
Wirkungsweise von CDH13 in inhibitorischen Synapsen sollte einen mechanistischen Einblick
in die Auswirkungen von CDH13-Genvarianten auf die Aktivität des E/I-Netzwerks
ermöglichen, die dann gezielt zur Wiederherstellung des Gleichgewichts eingesetzt werden
können.
Genomweite Assoziationsstudien identifizierten seltene Kopienzahlvarianten (copy number
variants, CNVs), die zu einer Deletion (oder Duplikation) des CDH13-Gens führen. Um die
genetische Hintergrundsvarianz zu verringern, wurde mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems
(Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats/CRISPR-associated protein 9)
eine Reihe isogener iPSC-Linien mit einem dosisabhängigen Mangel an CDH13-Gen (CDH13-
/- und CDH13+/-) erzeugt. Die CRISPR-modifizierten iPSCs, bei denen CDH13 auf einem
einzelnen oder zwei Allel(en) inaktiviert wurde, ermöglichen die Untersuchung der CDH13-
Funktion in zellulären Prozessen, an hemmenden Synapsen und in der Aktivität neuronaler
Netzwerke. Darüber hinaus wurden iPSCs, die die allelischen Varianten des SNP rs2199430
tragen, verwendet, um die Auswirkungen der häufigen genetischen Variation des CDH13-
Gens zu untersuchen. Diese Zelllinien wurden zu reinen glutamatergen und GABAergen
Neuronen differenziert und ko-kultiviert, um neuronale Netzwerke zu erzeugen, deren Aktivität
gemessen und mit elektrophysiologischen Signaturen unterschiedlicher CDH13-Genotypen
korreliert wurde. Die Arbeiten zur Bestimmung der neuronalen Netzwerkaktivität der iPSC� Linien wurden in drei Hauptschritte unterteilt: erstens die Erzeugung von rtTA/Ngn2- und
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rtTA/Ascl1-positiven iPSCs über einen Lentivirus-vermittelten Ansatz; zweitens die
Differenzierung reiner glutamaterger und GABAerger Neuronen aus den genetisch
transduzierten iPSCs und die Ko-Kultur reiner glutamaterger und GABAerger Neuronen in
einem vorher festgelegtem Verhältnis (65: 35) durch direkte Differenzierung unter Zugabe von
Doxycyclin und Forskolin auf einem Mikroelektroden-Array (MEA)-Chip; und schließlich die
Aufzeichnung der neuronalen Netzwerkaktivität der iPSC-Linien nach 49 Tagen in vitro, gefolgt
von der Extraktion und Analyse verschiedener MEA-Parameter.
Anhand der MEA-Parameter wurde bestätigt, dass sowohl kompletter CDH13-Knockout als
auch heterozygote Defizienz das E/I-Gleichgewicht durch verstärkte Inhibition beeinflussen.
Darüber hinaus zeigte sich, dass häufige SNP-Variation die Signatur der neuronalen
Netzwerkaktivität verändert. Insbesondere führte CDH13-Defizienz zu einer signifikanten
Verringerung der Dauer der Netzwerk-Bursts (NBD), einer geringeren Anzahl von erkannten
Spikes innerhalb eines Netzwerk-Bursts und einer signifikanten Verringerung der Netzwerk� Burst-Rate (NBR) im Vergleich zur Kontrolle (CDH13G/G). CDH13A/G und CDH13A/A wiesen
Ähnlichkeiten mit den CRISPR-modifizierten CDH13-defizienten Netzwerken auf, indem sie im
Vergleich zu CDH13G/G eine signifikante Verringerung der NBD und eine geringere Anzahl von
erkannten Spikes innerhalb eines Netzwerks aufwiesen. Auffallend war eine signifikante
Zunahme der NBR in den CDH13A/G- und CDH13A/A-Netzwerken im Vergleich zu den
CDH13G/G-Netzwerken. CDH13A/G-Netzwerke wiesen bei beiden Parametern signifikante
Unterschiede auf. Auf zellulärer Ebene deutet dies darauf hin, dass sich die Signalwege, die
die Länge und Häufigkeit von Netzwerk-Bursts bestimmen, zwischen den allelischen Varianten
des SNP rs2199430 unterscheiden, was die funktionelle Bedeutung dieses intronischen SNP
bestätigt.
Zusammenfassend wurden CDH13-defiziente isogene iPSC-Linien mit CRISPR/Cas9
erzeugt, iPSCs wurden mit Hilfe eines Lentivirus-Ansatzes genetisch transduziert, direkte
Differenzierung von glutamatergen/ GABAergen Neuronen, die von transduzierten iPSCs
abgeleitet wurden, wurden verwendet, um ein skalierbares Ko-Kultursystem zu etablieren. Die
Netzwerkaktivität wurde mit MEA aufgezeichnet, wobei zuvor festgelegte Parameter
verwendet wurden, um Aktivitätsinformationen zu extrahieren. Die Ergebnisse zeigen, dass
iPSC-abgeleitete neuronale Netzwerke nach CRISPR/Cas9-vermittelten CDH13-Inaktivierung
sowie Netzwerke mit allelischen SNP-Varianten von CDH13 das E/I-Gleichgewicht
beeinflussen, was das Verständnis der CDH13-Funktion an hemmenden Synapsen fördert und
die Auswirkungen seltener und häufiger CDH13-Genvariationen aufklärt.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:28789 |
| Date | January 2023 |
| Creators | Vitale, Maria Rosaria |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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