Cette thèse traite de la biodégradation par les bactéries d'une catégorie de polluants appelés hydrocarbures aromatiques polycycliques ou HAP. La bactérie Mycobacterium sp. 6PY1 a été isolée d'un sol pollué pour sa capacité à utiliser un HAP à 4 cycles, le pyrène, comme seule source de carbone et d'énergie. Pour comprendre comment le pyrène est métabolisé, l'identification des enzymes impliquées a été entreprise par une approche protéomique. Cette approche a notamment mis en évidence dans la souche 6PY1 deux arène dioxygénases, enzymes susceptibles de catalyser l'attaque initiale du pyrène. L'objectif de cette étude consistait à cloner les gènes de structure des arène dioxygénases identifiées chez Mycobacterium 6PY1, à surexprimer ces gènes en système hétérologue pour faciliter la purification des enzymes correspondantes, et à déterminer les propriétés biochimiques et catalytiques de ces enzymes. Les gènes pdoA1B1 codant la composante terminale d'une dioxygénase ont été clonés et surexprimés chez E. coli. Les propriétés catalytiques de cette enzyme, appelée Pdo1, ont été déterminées in vivo en dosant les produits d'oxydation de HAP composés de 2 à 4 cycles par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CPG/SM). L'analyse de la sélectivité de l'enzyme, déterminée de cette façon montre que Pdo1 oxyde préférentiellement des HAP à 3 ou 4 cycles, comme le phénanthrène et le pyrène, mais n'attaque pas les di-aromatiques comme le naphtalène et le biphényle. La protéine Pdo1 s'est révélée instable et n'a été purifiée que sous forme inactive. Les gènes de structure d'une seconde composante dioxygénase ont été repérés dans un locus comportant deux autres gènes cataboliques. Les gènes pdoA2B2 codent pour une enzyme, appelée Pdo2, montrant une spécificité étroite vis-à-vis des HAP à 2 ou 3 cycles aromatiques et une nette préférence pour le phénanthrène. La protéine Pdo2 purifiée est un hexamère de type α3β3, possédant des centres [2Fe-2S] de type Rieske qui lui confèrent un spectre d'absorbance caractéristique. Des gènes susceptibles de coder pour une troisième dioxygénase ont été découverts dans le génome de Mycobacterium sp. 6PY1. Ces gènes sont très proches en séquence de ceux codant pour Pdo1, suggérant que la bactérie synthétise deux iso-enzymes capables d'oxyder le pyrène. Le fonctionnement des arène dioxygénases requiert deux protéines transporteurs d'électrons de type ferrédoxine et réductase. Celles qui sont associées aux enzymes Pdo1 et Pdo2 n'ont pas été identifiées. Cependant, l'activité des deux dioxygénases de la souche 6PY1 a été stimulée in vivo en co-exprimant dans E. coli des gènes accessoires recrutés d'autres bactéries. Enfin, des expériences d'immunodétection à l'aide d'anticorps spécifiques ont montré que les enzymes Pdo1 et Pdo2 sont co-induites en présence de HAP mais ne sont pas régulées de la même manière en fonction des conditions de croissance.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:CCSD/oai:tel.archives-ouvertes.fr:tel-00009997 |
| Date | 20 June 2005 |
| Creators | KUONY, Sylvain |
| Source Sets | CCSD theses-EN-ligne, France |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | PhD thesis |
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