Scrapie und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) sind stets tödlich verlaufende transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) bei kleinen Wiederkäuern und Rindern. Nach der „Prion-Theorie“ ist die pathologische Isoform eines zellulären Proteins, des Prion-Proteins, der Hauptbestandteil, wenn nicht sogar die einzige Komponente der TSE-Erreger. Gemäß dieser Theorie lagert sich die pathologische Isoform, PrPSc, an die zelluläre Form, PrPC, an und führt so zu einer Konformationsänderung von PrPC. Bisher lassen sich TSE-Erreger nur im Tierversuch sowie in wenigen überwiegend von Nagetieren stammenden Zelllinien vermehren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Identifikation und Charakterisierung neuer TSE-empfänglicher Zelllinien, wobei vor allem die Infektion oviner und boviner Zelllinien mit Scrapie- bzw. BSE-Feldisolaten im Vordergrund stand. Hierzu wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Kultur- und Infektionsbedingungen (Nährmedien, Umsetzraten, Temperatur, Herstellung der Inokulate, Inokulationsprotokoll) auf den Infektionserfolg studiert. Basierend auf den dabei gewonnenen Daten wurde ein Infektionsprotokoll erstellt, das im weiteren Verlauf für alle in dieser Studie untersuchten Zelllinien verwendet wurde. Durch die Zellbank des Friedrich-Loeffler-Instituts stand eine Vielzahl unterschiedlicher eukaryotischer Zelllinien zur Verfügung, von denen 53 aus geeigneten Organen und Geweben und größtenteils vom Wiederkäuer stammende Zelllinien ausgewählt wurden. Anschließend wurden diese Zelllinien kultiviert und wiederholt hinsichtlich ihrer PrPC-Expression analysiert. Dabei zeigte sich, dass das PrPC-Expressionniveau für jede Zelllinie sehr individuell und weder spezies- noch gewebespezifisch ist. 34 der 53 Zelllinien exprimierten PrPC in detektierbarer Menge und wurden in den weiteren Infektionsstudien verwendet. Dabei wurden sie mit verschiedenen TSE-Stämmen bzw. -Isolaten (bovines BSE-Material, ovines und caprines Scrapie-Material, mausadaptierte BSE- und Scrapie-Stämme) inokuliert. Der Großteil dieser Zelllinien (30 von 34) zeigte sich gegen alle eingesetzten Prion-Erreger resistent. Zwei Zelllinien konnten transient für 10 (MGbov900) bzw. 32 (Bov11) Passagen mit bovinem BSE-Material infiziert werden. Damit war die prinzipielle Möglichkeit einer BSE-Infektion dieser Zellen gezeigt. Aus bisher ungeklärten Gründen wurde die Prion-Infektion jedoch von beiden Zelllinien wieder verloren und erneute Infektionsversuche blieben erfolglos. Zwei weitere Zelllinien konnten persistent infiziert werden. Die Zelllinie N2a229, eine Sublinie der in der Prion-Forschung weit verbreiteten Neuroblastomzelllinie N2a, war für den mauspassagierten Scrapie-Stamm RML empfänglich. Des Weiteren wurde eine bovine Zelllinie (Bov5; 154PES) identifiziert, die für zwei ovine Scrapie-Feldisolate empfänglich war. Es handelt sich dabei um die erste nicht transgene Zelllinie, die mit einem Scrapie-Feldisolat infiziert werden konnte. Die beiden verwendeten Isolate (S71/04 und S95/04) stammten von Schafen aus einem klassischen Scrapie-Ausbruch aus dem Jahr 2004. In den infizierten Bov5Sc-Zellen steigerte sich die initial schwache PrPSc-Akkumulation über mehrere Passagen zu einem starken Signal, das durch verschiedene Prion-spezifische Antikörper im Dot-Blot, im Western-Blot und mit dem „Zell-ELISA“ nachgewiesen werden konnte. Die Infektion ist bereits seit über 200 Passagen stabil. Sie war mit den besagten Scrapie-Isolaten mehrfach wiederholbar und durch die Selektion von infizierten Einzelzellen konnten hochpositive Sublinien erhalten werden. Infizierte Bov5Sc-Zellen führten nach Inokulation in transgene Rinder- oder Schaf-PrPC überexprimierende Mäuse zu Scrapie-Erkrankungen und der Bildung von PrPSc im Gehirn der Mäuse. Die Infektion von Rinderzellen mit einem ovinen TSE-Isolat bedeutete die Überwindung einer Speziesbarriere. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Adaptation des Erregers an die Zellen stattgefunden hatte, welche sich z. B. in einem veränderten Glykosylierungs-profil darstellt. Verglichen mit zwei murinen TSE-infizierten Zelllinien zeigten die Bov5Sc-Zellen ähnliche Eigenschaften hinsichtlich ihrer Proteinase K-Resistenz, aber eine deutlich verlängerte Reaktionszeit gegenüber PrPSc inhibierenden Substanzen. Neben den Infektionsstudien an den „Zellbank-Zelllinien“ wurden transgene Zelllinien hergestellt, die auf der Basis von RK13-Zellen (Nierenzellen aus dem Kaninchen) und Hpl3-4-Zellen (neuronale Zelle aus PrP-defizienten-Mäusen) das PrPC von Maus, Schaf, Nerz, Hund sowie zwei chimären Konstrukten aus Maus/Rind/Maus bzw. Maus/Schaf/Maus exprimierten. Ein Großteil dieser transgenen Zelllinien war gegenüber einer Infektion und insbesondere einer Infektion mit TSE-Feldisolaten resistent. Durch Infektionsstudien mit dem mausadaptierten murinen Scrapie-Stamm RML konnten jedoch interessante Einblicke in die Hintergründe der zellulären TSE-Empfänglichkeit gewonnen werden. So zeigte sich, dass die Expression eines chimären PrP-Konstruktes aus Maus und Schaf (Mushp) nur in RK13-Zellen, nicht aber in Hpl3-4-Zellen zu einer für den Scrapie-Stamm RML empfänglichen Zelllinie führte. Dagegen konnten murines PrPC exprimierende Hpl3-4-Zellen erfolgreich mit RML, nicht aber mit dem Stamm Me7 infiziert werden. Diese Versuche unterstützen die Annahme, dass für eine Zellinfektion weitere zelluläre Komponenten eine Rolle spielen und zeigen, dass nur die richtige Kombination aus exprimiertem PrPC und zellulärem Hintergrund die Empfänglichkeit einer Zelllinie für einen speziellen TSE-Erreger bestimmen kann. Weitere Studien mit empfänglichen bzw. infizierten bovinen Zelllinien werden zu einem besseren Verständnis der zellulären Pathogenese bei BSE und Scrapie führen, woraus sich möglicherweise auch ein therapeutischer und diagnostischer Nutzen ziehen lässt.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-20080109-113520-6 |
| Date | 09 January 2008 |
| Creators | Oelschlegel, Anja Maria |
| Contributors | Universität Leipzig, |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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