Scrapie und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) sind stets tödlich verlaufende transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) bei kleinen Wiederkäuern und Rindern. Nach der „Prion-Theorie“ ist die pathologische Isoform eines zellulären Proteins, des Prion-Proteins, der Hauptbestandteil, wenn nicht sogar die einzige Komponente der TSE-Erreger. Gemäß dieser Theorie lagert sich die pathologische Isoform, PrPSc, an die zelluläre Form, PrPC, an und führt so zu einer Konformationsänderung von PrPC. Bisher lassen sich TSE-Erreger nur im Tierversuch sowie in wenigen überwiegend von Nagetieren stammenden Zelllinien vermehren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Identifikation und Charakterisierung neuer TSE-empfänglicher Zelllinien, wobei vor allem die Infektion oviner und boviner Zelllinien mit Scrapie- bzw. BSE-Feldisolaten im Vordergrund stand. Hierzu wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Kultur- und Infektionsbedingungen (Nährmedien, Umsetzraten, Temperatur, Herstellung der Inokulate, Inokulationsprotokoll) auf den Infektionserfolg studiert. Basierend auf den dabei gewonnenen Daten wurde ein Infektionsprotokoll erstellt, das im weiteren Verlauf für alle in dieser Studie untersuchten Zelllinien verwendet wurde. Durch die Zellbank des Friedrich-Loeffler-Instituts stand eine Vielzahl unterschiedlicher eukaryotischer Zelllinien zur Verfügung, von denen 53 aus geeigneten Organen und Geweben und größtenteils vom Wiederkäuer stammende Zelllinien ausgewählt wurden. Anschließend wurden diese Zelllinien kultiviert und wiederholt hinsichtlich ihrer PrPC-Expression analysiert. Dabei zeigte sich, dass das PrPC-Expressionniveau für jede Zelllinie sehr individuell und weder spezies- noch gewebespezifisch ist. 34 der 53 Zelllinien exprimierten PrPC in detektierbarer Menge und wurden in den weiteren Infektionsstudien verwendet. Dabei wurden sie mit verschiedenen TSE-Stämmen bzw. -Isolaten (bovines BSE-Material, ovines und caprines Scrapie-Material, mausadaptierte BSE- und Scrapie-Stämme) inokuliert. Der Großteil dieser Zelllinien (30 von 34) zeigte sich gegen alle eingesetzten Prion-Erreger resistent. Zwei Zelllinien konnten transient für 10 (MGbov900) bzw. 32 (Bov11) Passagen mit bovinem BSE-Material infiziert werden. Damit war die prinzipielle Möglichkeit einer BSE-Infektion dieser Zellen gezeigt. Aus bisher ungeklärten Gründen wurde die Prion-Infektion jedoch von beiden Zelllinien wieder verloren und erneute Infektionsversuche blieben erfolglos. Zwei weitere Zelllinien konnten persistent infiziert werden. Die Zelllinie N2a229, eine Sublinie der in der Prion-Forschung weit verbreiteten Neuroblastomzelllinie N2a, war für den mauspassagierten Scrapie-Stamm RML empfänglich. Des Weiteren wurde eine bovine Zelllinie (Bov5; 154PES) identifiziert, die für zwei ovine Scrapie-Feldisolate empfänglich war. Es handelt sich dabei um die erste nicht transgene Zelllinie, die mit einem Scrapie-Feldisolat infiziert werden konnte. Die beiden verwendeten Isolate (S71/04 und S95/04) stammten von Schafen aus einem klassischen Scrapie-Ausbruch aus dem Jahr 2004. In den infizierten Bov5Sc-Zellen steigerte sich die initial schwache PrPSc-Akkumulation über mehrere Passagen zu einem starken Signal, das durch verschiedene Prion-spezifische Antikörper im Dot-Blot, im Western-Blot und mit dem „Zell-ELISA“ nachgewiesen werden konnte. Die Infektion ist bereits seit über 200 Passagen stabil. Sie war mit den besagten Scrapie-Isolaten mehrfach wiederholbar und durch die Selektion von infizierten Einzelzellen konnten hochpositive Sublinien erhalten werden. Infizierte Bov5Sc-Zellen führten nach Inokulation in transgene Rinder- oder Schaf-PrPC überexprimierende Mäuse zu Scrapie-Erkrankungen und der Bildung von PrPSc im Gehirn der Mäuse. Die Infektion von Rinderzellen mit einem ovinen TSE-Isolat bedeutete die Überwindung einer Speziesbarriere. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Adaptation des Erregers an die Zellen stattgefunden hatte, welche sich z. B. in einem veränderten Glykosylierungs-profil darstellt. Verglichen mit zwei murinen TSE-infizierten Zelllinien zeigten die Bov5Sc-Zellen ähnliche Eigenschaften hinsichtlich ihrer Proteinase K-Resistenz, aber eine deutlich verlängerte Reaktionszeit gegenüber PrPSc inhibierenden Substanzen. Neben den Infektionsstudien an den „Zellbank-Zelllinien“ wurden transgene Zelllinien hergestellt, die auf der Basis von RK13-Zellen (Nierenzellen aus dem Kaninchen) und Hpl3-4-Zellen (neuronale Zelle aus PrP-defizienten-Mäusen) das PrPC von Maus, Schaf, Nerz, Hund sowie zwei chimären Konstrukten aus Maus/Rind/Maus bzw. Maus/Schaf/Maus exprimierten. Ein Großteil dieser transgenen Zelllinien war gegenüber einer Infektion und insbesondere einer Infektion mit TSE-Feldisolaten resistent. Durch Infektionsstudien mit dem mausadaptierten murinen Scrapie-Stamm RML konnten jedoch interessante Einblicke in die Hintergründe der zellulären TSE-Empfänglichkeit gewonnen werden. So zeigte sich, dass die Expression eines chimären PrP-Konstruktes aus Maus und Schaf (Mushp) nur in RK13-Zellen, nicht aber in Hpl3-4-Zellen zu einer für den Scrapie-Stamm RML empfänglichen Zelllinie führte. Dagegen konnten murines PrPC exprimierende Hpl3-4-Zellen erfolgreich mit RML, nicht aber mit dem Stamm Me7 infiziert werden. Diese Versuche unterstützen die Annahme, dass für eine Zellinfektion weitere zelluläre Komponenten eine Rolle spielen und zeigen, dass nur die richtige Kombination aus exprimiertem PrPC und zellulärem Hintergrund die Empfänglichkeit einer Zelllinie für einen speziellen TSE-Erreger bestimmen kann. Weitere Studien mit empfänglichen bzw. infizierten bovinen Zelllinien werden zu einem besseren Verständnis der zellulären Pathogenese bei BSE und Scrapie führen, woraus sich möglicherweise auch ein therapeutischer und diagnostischer Nutzen ziehen lässt.

Scrapie und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) sind stets tödlich verlaufende transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE) bei kleinen Wiederkäuern und Rindern. Nach der „Prion-Theorie“ ist die pathologische Isoform eines zellulären Proteins, des Prion-Proteins, der Hauptbestandteil, wenn nicht sogar die einzige Komponente der TSE-Erreger. Gemäß dieser Theorie lagert sich die pathologische Isoform, PrPSc, an die zelluläre Form, PrPC, an und führt so zu einer Konformationsänderung von PrPC. Bisher lassen sich TSE-Erreger nur im Tierversuch sowie in wenigen überwiegend von Nagetieren stammenden Zelllinien vermehren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war deshalb die Identifikation und Charakterisierung neuer TSE-empfänglicher Zelllinien, wobei vor allem die Infektion oviner und boviner Zelllinien mit Scrapie- bzw. BSE-Feldisolaten im Vordergrund stand. Hierzu wurde zunächst der Einfluss unterschiedlicher Kultur- und Infektionsbedingungen (Nährmedien, Umsetzraten, Temperatur, Herstellung der Inokulate, Inokulationsprotokoll) auf den Infektionserfolg studiert. Basierend auf den dabei gewonnenen Daten wurde ein Infektionsprotokoll erstellt, das im weiteren Verlauf für alle in dieser Studie untersuchten Zelllinien verwendet wurde. Durch die Zellbank des Friedrich-Loeffler-Instituts stand eine Vielzahl unterschiedlicher eukaryotischer Zelllinien zur Verfügung, von denen 53 aus geeigneten Organen und Geweben und größtenteils vom Wiederkäuer stammende Zelllinien ausgewählt wurden. Anschließend wurden diese Zelllinien kultiviert und wiederholt hinsichtlich ihrer PrPC-Expression analysiert. Dabei zeigte sich, dass das PrPC-Expressionniveau für jede Zelllinie sehr individuell und weder spezies- noch gewebespezifisch ist. 34 der 53 Zelllinien exprimierten PrPC in detektierbarer Menge und wurden in den weiteren Infektionsstudien verwendet. Dabei wurden sie mit verschiedenen TSE-Stämmen bzw. -Isolaten (bovines BSE-Material, ovines und caprines Scrapie-Material, mausadaptierte BSE- und Scrapie-Stämme) inokuliert. Der Großteil dieser Zelllinien (30 von 34) zeigte sich gegen alle eingesetzten Prion-Erreger resistent. Zwei Zelllinien konnten transient für 10 (MGbov900) bzw. 32 (Bov11) Passagen mit bovinem BSE-Material infiziert werden. Damit war die prinzipielle Möglichkeit einer BSE-Infektion dieser Zellen gezeigt. Aus bisher ungeklärten Gründen wurde die Prion-Infektion jedoch von beiden Zelllinien wieder verloren und erneute Infektionsversuche blieben erfolglos. Zwei weitere Zelllinien konnten persistent infiziert werden. Die Zelllinie N2a229, eine Sublinie der in der Prion-Forschung weit verbreiteten Neuroblastomzelllinie N2a, war für den mauspassagierten Scrapie-Stamm RML empfänglich. Des Weiteren wurde eine bovine Zelllinie (Bov5; 154PES) identifiziert, die für zwei ovine Scrapie-Feldisolate empfänglich war. Es handelt sich dabei um die erste nicht transgene Zelllinie, die mit einem Scrapie-Feldisolat infiziert werden konnte. Die beiden verwendeten Isolate (S71/04 und S95/04) stammten von Schafen aus einem klassischen Scrapie-Ausbruch aus dem Jahr 2004. In den infizierten Bov5Sc-Zellen steigerte sich die initial schwache PrPSc-Akkumulation über mehrere Passagen zu einem starken Signal, das durch verschiedene Prion-spezifische Antikörper im Dot-Blot, im Western-Blot und mit dem „Zell-ELISA“ nachgewiesen werden konnte. Die Infektion ist bereits seit über 200 Passagen stabil. Sie war mit den besagten Scrapie-Isolaten mehrfach wiederholbar und durch die Selektion von infizierten Einzelzellen konnten hochpositive Sublinien erhalten werden. Infizierte Bov5Sc-Zellen führten nach Inokulation in transgene Rinder- oder Schaf-PrPC überexprimierende Mäuse zu Scrapie-Erkrankungen und der Bildung von PrPSc im Gehirn der Mäuse. Die Infektion von Rinderzellen mit einem ovinen TSE-Isolat bedeutete die Überwindung einer Speziesbarriere. In weiteren Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine Adaptation des Erregers an die Zellen stattgefunden hatte, welche sich z. B. in einem veränderten Glykosylierungs-profil darstellt. Verglichen mit zwei murinen TSE-infizierten Zelllinien zeigten die Bov5Sc-Zellen ähnliche Eigenschaften hinsichtlich ihrer Proteinase K-Resistenz, aber eine deutlich verlängerte Reaktionszeit gegenüber PrPSc inhibierenden Substanzen. Neben den Infektionsstudien an den „Zellbank-Zelllinien“ wurden transgene Zelllinien hergestellt, die auf der Basis von RK13-Zellen (Nierenzellen aus dem Kaninchen) und Hpl3-4-Zellen (neuronale Zelle aus PrP-defizienten-Mäusen) das PrPC von Maus, Schaf, Nerz, Hund sowie zwei chimären Konstrukten aus Maus/Rind/Maus bzw. Maus/Schaf/Maus exprimierten. Ein Großteil dieser transgenen Zelllinien war gegenüber einer Infektion und insbesondere einer Infektion mit TSE-Feldisolaten resistent. Durch Infektionsstudien mit dem mausadaptierten murinen Scrapie-Stamm RML konnten jedoch interessante Einblicke in die Hintergründe der zellulären TSE-Empfänglichkeit gewonnen werden. So zeigte sich, dass die Expression eines chimären PrP-Konstruktes aus Maus und Schaf (Mushp) nur in RK13-Zellen, nicht aber in Hpl3-4-Zellen zu einer für den Scrapie-Stamm RML empfänglichen Zelllinie führte. Dagegen konnten murines PrPC exprimierende Hpl3-4-Zellen erfolgreich mit RML, nicht aber mit dem Stamm Me7 infiziert werden. Diese Versuche unterstützen die Annahme, dass für eine Zellinfektion weitere zelluläre Komponenten eine Rolle spielen und zeigen, dass nur die richtige Kombination aus exprimiertem PrPC und zellulärem Hintergrund die Empfänglichkeit einer Zelllinie für einen speziellen TSE-Erreger bestimmen kann. Weitere Studien mit empfänglichen bzw. infizierten bovinen Zelllinien werden zu einem besseren Verständnis der zellulären Pathogenese bei BSE und Scrapie führen, woraus sich möglicherweise auch ein therapeutischer und diagnostischer Nutzen ziehen lässt.

Die Krebsentstehung wurde vor rund 80 Jahren auf veränderten zellulären Energiestoffwechsel zurückgeführt. Diese Hypothese konnte bisher weder experimentell bewiesen noch widerlegt werden. Durch den Einsatz zweier Modellsysteme mit unterschiedlicher Expression des mitochondrialen Proteins Frataxin konnte in der vorliegenden Arbeit <br> gezeigt werden, dass der mitochondriale Energiestoffwechsel einen Einfluss auf die Tumorentstehung zu besitzen scheint. Eine Reduktion des mitochondrialen Energiestoffwechsels wurde durch die hepatozytenspezifische Ausschaltung des mitochondrialen Proteins Frataxin in Mäusen erreicht. Der durch das Cre-/loxP-Rekombinasesystem erreichte organspezifische Knock-out wurde auf Transkriptions- und Translationsebene nachgewiesen. Anhand verminderter Aconitaseaktivität, geringeren Sauerstoffverbrauches und reduzierten ATP-Gehaltes im Lebergewebe wurde ein signifikant verminderter Energiestoffwechsel dargestellt. Zwar entsprach die Genotypenverteilung in den Versuchsgruppen der erwarteten Mendelschen Verteilung, dennoch war die mittlere Lebenserwartung der <br> Knock-out-Tiere mit ca. 30 Wochen stark reduziert. Bereits in jungem Alter war bei diesen Tieren die Ausbildung von präneoplastischen Herden zu beobachten. Mit proteinbiochemischen Nachweistechniken konnte in Lebergewebe 4-8 Wochen alter Tiere eine verstärkte Aktivierung des Apoptosesignalweges (Cytochrom C im Zytosol, <br> verstärkte Expression von Bax) sowie eine Modulation stressassoziierter Proteine (geringere Phosphorylierungsrate p38-MAPK, vermehrte Expression HSP-25, verminderte Expression HSP-70) aufgezeigt werden. Im inversen Ansatz wurde eine Steigerung des mitochondrialen Energiestoffwechsels durch stabile transgene Frataxinüberexpression in zwei Kolonkarzinomzelllinien erreicht. Diese Steigerung zeigte sich durch erhöhte Aconitaseaktivität, erhöhten Sauerstoffverbrauch, gesteigertes mitochondriales Membranpotenzial und erhöhten ATP-Gehalt in den Zellen. Die frataxinüberexprimierenden Zellen wuchsen signifikant langsamer als Kontrollzellen und zeigten im Soft-Agar-Assay und im Nacktmausmodell ein deutlich geringeres Potenzial zur Ausbildung von Kolonien bzw. Tumoren. Mittels Immunoblot war hier eine vermehrte Phosphorylierung der p38-MAPK festzustellen. <br> Die zusammenfassende Betrachtung beider Modelle zeigt, dass ein reduzierter mitochondrialer Energiestoffwechsel durch Regulation der p38-MAPK und apoptotischer Signalwege ein erhöhtes Krebsrisiko zu verursachen vermag. / Eigthy years ago, it was suggested that impaired energy metabolism might cause cancer. Compelling experimental evidence for this hypothesis is lacking. By use of two different model systems here we show that impaired expression of the mitochondrial protein frataxin leading to impaired mitochondrial energy metabolism appears to be <br> inversely related to tumour growth. To generate mice with reduced mitochondrial energy metabolism the expression of mitochondrial protein frataxin was disrupted in a hepatocyte-specific manner by using the cre/loxP-system. Presence, efficiency and specificity of disruption were shown at transcriptional and translational levels. Decreased activity of aconitase, reduced oxygen consumption and diminished ATP level in the liver revealed diminished energy <br> metabolism. Although knock-out mice were born in the expected Mendelian frequency, they exhibited a significantly decreased life expectancy. Young mice exhibited hepatic preneoplasia. The use of proteinbiochemical techniques revealed activation of apoptotic <br> pathways (cytochrome c in the cytosol, increased expression of bax) and modulation of stress-associated cascades (decreased phosphorylation of p38-MAPK, increased expression of HSP-25 and diminished expression of HSP-70). Inversely, transgenic overexpression of frataxin in colon cancer cell lines lead to increased mitochondrial energy metabolism as demonstrated by elevated activity of aconitase, increased oxygen consumption, elevated mitochondrial membrane potential and increased ATP levels. Frataxin-overexpressing colon cancer cells exhibit a <br> concurrent decrease in replication rate. The colony forming capacity in soft-agar-assay and tumour formation in nude mice were clearly decreased. Immunoblotting revealed elevated phosphorylation of p38-MAPK. Taken together, these models suggest that reduced mitochondrial energy metabolism may promote cancer through regulation of p38-MAPK and apoptotic pathways.

Das Harnblasenkarzinom (BCa) ist die zweithäufigste bösartige urologische Tumorerkrankung sowie die siebthäufigste tumorbedingte Todesursache bei Männern. Zur Senkung des erheblichen Rezidiv- und Progressionsrisikos oberflächlicher BCa kommen lokale Immun- oder Chemotherapeutika zum Einsatz, die jedoch starke Nebenwirkungen verursachen können bzw. ungenügende langfristige Effekte bewirken. Eine neuartige Therapieoption besteht in der gezielten Expressionshemmung von Genen, die den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil vermitteln. Hierfür eignen sich besonders synthetische Nukleinsäuren wie Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) und small interfering RNAs (siRNAs). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expressionshemmung des potenziellen Targetgens hTERT (humane Telomerase Reverse Transkriptase) mit AS-ODN und siRNAs in BCa-Zellen untersucht. Die Tumorspezifität der hTERT-mRNA-Expression konnte zunächst an tumor- und tumorfreien Gewebeproben von BCa-Patienten gezeigt werden. Die verwendeten AS-ODN reduzierten die hTERT-mRNA-Expression auf bis zu 40%, womit eine Verringerung der Telomeraseaktivität einherging. Die AS-ODN-Behandlung bewirkte des Weiteren eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion verschiedener BCa-Zelllinien sowie eine verminderte Zellkoloniebildungsrate. Diese antiproliferativen Effekte waren auf eine Apoptoseinduktion zurückzuführen. Durch eine Vorbehandlung von vier BCa-Zelllinien mit hTERT-AS-ODN konnten die zytotoxischen Effekte der für das BCa relevanten Chemotherapeutika Cisplatin, Mitomycin C und Gemcitabin signifikant verstärkt werden. Nach Untersuchung der AS-ODN-Wirkung in vitro erfolgte die Etablierung eines subkutanen Xenotransplantantmodells der Nacktmaus. Die Eignung einer intraperitonealen Applikation wurde mit fluoreszenzmarkierten AS-ODN belegt. In weiteren Zellkulturexperimenten kamen hTERT-siRNAs, als alternative Methode der Geninhibition, zum Einsatz. Die Reduktion der hTERT-mRNA-Expression auf 50% war mit der durch AS-ODN bewirkten Inhibition vergleichbar. Im Gegensatz zur AS-ODN-Behandlung induzierten siRNAs keine unmittelbare Apoptose. Eine Kombination der siRNAs mit Cisplatin und Mitomycin C bewirkte jedoch eine Verdopplung der Apoptoserate. Um die molekularen Mechanismen der Wirkung der nukleinsäurebasierten hTERT-Inhibitoren und den Einfluss targetunabhängiger Effekte zu untersuchen, wurden transkriptomweite Expressionsanalysen mittels Oligonukleotid-Microarrays durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die AS-ODN-Behandlung vorwiegend zu einer gesteigerten Expression von Genen führte, die mit einer zellulären Stressantwort assoziiert sind (u.a. ATF3, EGR1, GADD45). Diese Expressionsmuster stimmten in hohem Maße mit denen überein, die durch Transfektion mit AS-ODN gegen andere Targets erhalten wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine, zumindest teilweise, durch off-Targeteffekte ausgelöste Wachstumshemmung hin. Die siRNA-Behandlungen gegen unterschiedliche Targets zeigten relativ geringe Übereinstimmungen in den Expressionsmustern und somit eine höhere Spezifität. Außerdem wurde erstmalig gezeigt, dass eine hTERT-Inhibition mit siRNAs zur trankriptionellen Hemmung der Onkogene EGFR und FOSL1 führt. Diese Daten sowie die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen deuten auf einen wechselseitigen Zusammenhang zwischen hTERT und EGFR in der Regulation der EGFR-stimulierten Proliferation von BCa-Zellen hin. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass hTERT als tumorspezifisch exprimierter und funktionell relevanter Faktor ein hervorragendes Target für eine nukleinsäurebasierte BCa-Therapieoption darstellt. Im Vergleich zu AS-ODN wirken siRNAs grundsätzlich targetspezifischer. Die therapeutische Wertigkeit der lokal applizierten Inhibitoren, insbesondere in Kombination mit herkömmlichen Chemotherapeutika, sollte in nachfolgenden Experimenten im Rahmen eines orthotopen BCa-Xenotransplantatmodells untersucht werden.

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Objectives: To investigate the effects of serotonin and melatonin (MLT) on the regulation of malignant growth and the activity of serotonin receptors (5HTR1a/-1b) in prostate cancer (PCa) cell lines. Materials and Methods: In four PCa cell lines (LNCaP, 22RV1, PC3, DU145) and two reference cell lines 5HTR1a and -1b, relative mRNA expression levels were assessed. Different serotonin and MLT receptor agonists and antagonists were used in stimulation and inhibition experiments. Results: mRNA expression of 5HTR1b was higher than that of 5HTR1a in all PCa cell lines. Serotonin showed a significant growth stimulatory effect in all PCa lines. The 5HTR1a and -1b agonists/antagonists did not significantly affect viability. MLT inhibited viability only in PC3 cells. Similarly, the 5HTR1a antagonist induced apoptotic changes in PC3 cells only at 10–4M, while the 5HTR1b antagonist induced necrosis at 10–4M in all cell lines. Cell cycle alterations were seen in PC3 and DU145 cells under the influence of the 5HTR1a antagonist. Conclusions: Serotonin receptor antagonists and agonists as well as MLT influence viability and apoptosis of PCa cell lines at supraphysiologic concentrations. In contrast to other reports, our results do not support a regulatory role of serotonin or MLT receptor activation or inhibition in PCa growth. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Objectives: To investigate the effects of serotonin and melatonin (MLT) on the regulation of malignant growth and the activity of serotonin receptors (5HTR1a/-1b) in prostate cancer (PCa) cell lines. Materials and Methods: In four PCa cell lines (LNCaP, 22RV1, PC3, DU145) and two reference cell lines 5HTR1a and -1b, relative mRNA expression levels were assessed. Different serotonin and MLT receptor agonists and antagonists were used in stimulation and inhibition experiments. Results: mRNA expression of 5HTR1b was higher than that of 5HTR1a in all PCa cell lines. Serotonin showed a significant growth stimulatory effect in all PCa lines. The 5HTR1a and -1b agonists/antagonists did not significantly affect viability. MLT inhibited viability only in PC3 cells. Similarly, the 5HTR1a antagonist induced apoptotic changes in PC3 cells only at 10–4M, while the 5HTR1b antagonist induced necrosis at 10–4M in all cell lines. Cell cycle alterations were seen in PC3 and DU145 cells under the influence of the 5HTR1a antagonist. Conclusions: Serotonin receptor antagonists and agonists as well as MLT influence viability and apoptosis of PCa cell lines at supraphysiologic concentrations. In contrast to other reports, our results do not support a regulatory role of serotonin or MLT receptor activation or inhibition in PCa growth. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Das duktale Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) hat aufgrund seines aggressiven Wachstums, seiner frühen Metastasierung und seiner fehlenden Frühsymptome eine sehr schlechte Prognose und ist daher die vierthäufigste Krebstodesursache bei Männern und Frauen in Deutschland. Ein weiteres Charakteristikum von PDAC ist die starke desmoplas-tische Reaktion. Eine Funktion für stromale pankreatische Sternzellen (PSCs) bei der Förderung des Wachstums, der Proliferation und der Metastasierung des Tumors konnte bereits nachgewiesen werden. Für die Beantwortung der Frage, welche molekularen Ursachen einen funktionellen Zusammenhang zwischen Tumoraggressivität und Stroma-zellen herstellen könnten, wurden bereits im Vorfeld dieser Arbeit differentielle Genex-pressionsanalysen durchgeführt. Dabei fiel u.a. auf, dass das sezernierte Glykoprotein secreted Frizzled-related protein 1 (SFRP1), im Vergleich zum entsprechenden nicht-tumorigenen Pankreasgewebe, im Stroma von PDAC-Patienten transkriptionell herunterreguliert war. SFRP1 ist bereits bekannt als Tumorsuppressorgen. In den meisten Fällen wird seine Wirkung auf die Hemmung des β-Catenin-abhängigen (kanonischen) Wnt-Signalweges zurückgeführt. Es wurde bereits sehr häufig beobachtet, dass SFRP1 durch eine Hypermethylierung seiner Promotorregion in einer Vielzahl von humanen Tumoren, darunter auch PDAC sowie PDAC-Vorstufen, herunterreguliert ist. Mit dem Abschalten der SFRP1-Expression wurden erhöhte Proliferation sowie verringerte Apoptose bei den betroffenen Zellen, Merkmale des aktivierten kanonischen Wnt-Signalweges, festgestellt. SFRP1 ist jedoch auch in der Lage nichtkanonische Wnt-Signalwege zu modulieren. Das Ziel dieser von der Deutschen Gesellschaft für Forschung geförderten Arbeit war es, die stromale SFRP1-Expression auf Proteinebene in Proben von PDAC-Patienten mit der von Patienten mit chronischer Pankreatitis zu vergleichen bzw. mit deren Überleben zu korrelieren. Ein möglicher Unterschied sollte mithilfe eines Zellkultur-modells auf einen funktionellen Effekt hin untersucht werden. Dafür sollten stabil und regulierbar SFRP1-überexprimierende Zelllinien aus PDAC- bzw. PSC-Zellen für die Einbindung in Migrationsassays etabliert werden. Für die Ergründung der Mechanismen, die zur Herunterregulierung der stromalen SFRP1-Expression führen könnten, sollte der Methylierungstatus der SFRP1-Promotorregion in PSC- sowie vergleichsweise in PDAC-Zellen mittels methylierungsspezifischer PCR und Bisulfitsequenzierung analysiert werden. Desweiteren sollten diese Zellen mit Hilfe eines Reportergenassays auf eine Mikro-RNA-bedingte Modulation der SFRP1-Expression hin untersucht werden. Die immunhistochemische SFRP1-Färbung von PDAC-Patientenproben auf Tissue-Microarrays (TMAs) ergab eine signifikante Reduktion der stromalen SFRP1-Färbung im Vergleich zur entsprechenden Expression im Stroma von Patienten mit chronischer Pankreatitis (CP). Die Ergebnisse der differentiellen Genexpressionsanalyse konnten also auf Proteinexpressionsebene bestätigt werden. Bei der Korrelation der stromalen SFRP1-Färbung mit dem Überleben der entsprechenden Patienten mit R1-Resektionsstatus zeigte sich ein leichter Überlebensvorteil für die Patienten mit positiver SFRP1-Färbung. Bei der Analyse der SFRP1-Expression auf RNA- und Proteinebene in Zellkulturmodellen von PDAC zeigte sich, dass zwei von vier PDAC-Zelllinien sowie die PSCs und normale Pankreasgangzellen SFRP1-RNA exprimierten. Auch bei anderen untersuchten Tumor- oder murinen PDAC-Zelllinien war das Verhältnis zwischen Linien mit SFRP1-RNA und Linien ohne SFRP1-RNA eher gemischt. Keine dieser Zelllinien jedoch exprimierte SFRP1-Protein bis auf eine murine Fibroblastenzelllinie (3T3). Um zu ergründen, wodurch die Diskrepanz zwischen SFRP1-RNA- und fehlender -Proteinexpression zustande kam, wurden Methylierungsanalysen durchgeführt. Dabei ergaben sich individuelle Methylierungsmuster für die verschiedenen DNAs, die eine fehlende Proteinexpression bei nur einem Teil der Zelllinien erklären würden. Daher wurde eine weitere Möglichkeit der Genexpressionsregulation in eukaryontischen Zellen als Ursache in Betracht gezogen, die Hemmung der Translation von SFRP1-mRNA in Protein durch miRNAs. Hierbei konnte mittels Reportergenassays nachgewiesen werden, dass miRNAs in PSCs und PDAC-Zellen eine kleine Stelle in der 3’-untranslatierten Region sowie Stellen in der kodierenden Sequenz von SFRP1 erkennen, daran binden und translational herunterregulieren konnten. Da keine endogene Proteinexpression festgestellt werden konnte, wurden drei PDAC-Zelllinien (PANC-1, AsPC1 und MIA PaCa-2) sowie eine PSC-Zelllinie (Klon2.2) für die stabile Transfektion mit humanem SFRP1 auf einem regulierbaren Vektor ausgewählt. Mithilfe der Lipofektion gelang es jedoch nur bei MIA PaCa-2 und Klon2.2-Zellen, stabile Einzelzellklone anzuziehen, jedoch mit relativ variablen SFRP1-Expressionen und -Regulierbarkeiten. Um noch mehr PDAC-Zelllinien in funktionellen Tests untersuchen zu können, wurden alle vier Zelllinien noch einmal mit einer weiteren Gentransfermethode, der retroviralen Transduktion, in stabil SFRP1-exprimierende Zelllinien umgewandelt. Um zu untersuchen, inwiefern das in den Patienten verlorengegangene SFRP1 das migratorische Verhalten von PDAC- und PSC-Zellen beeinflussen könnte, wurden Scratch- und Invasions- (Migrations) -Assays mit diesen Zellen durchgeführt und mit den Ergebnissen der entsprechenden Leerkontrollen verglichen. Dabei ergab sich für MIA PaCa-2 sowohl mit den durch Lipofektion als auch mit den durch retrovirale Transduktion generierten Klonen/Zelllinien ein signifikant hemmender Einfluss der SFRP1-Überexpression auf das Migrationsverhalten im Scratch-Assay. PANC-1-Zellen schienen mit Lipofektions-SFRP1-Überständen signifikant schlechter durch Membranen zu migrieren und zeigten ebenfalls eine signifikante Migrationshemmung als retroviral transduzierte Zelllinie in Scatch- und Invasionsassay mit endogener SFRP1-Expression. Für PSCs zeigte sich eine SFRP1-abhängige Migrationshemmung im Scratch-Assay und in den Invasionsassays (mit endogener SFRP1-Überexpression und mit SFRP1-Anwesenheit im Überstand), allerdings nur mit Lipofektionsklonen. Es konnte also ein hemmender Einfluss von SFRP1 auf die Migration von PDAC- und PSC-Zellen nachgewiesen werden. Dieser würde theoretisch wegfallen, wenn SFRP1, wie im Tumorstroma von PDAC-Patienten nachgewiesen, herunterreguliert werden würde. Bei der Untersuchung eines Einflusses von SFRP1 auf die Expression weiterer Gene ergab sich, dass SFRP1 bei PDAC-Zellen keine Hemmung des kanonischen Wnt-Signalweges verursacht. Vielmehr scheint seine Überexpression einen positiven Effekt auf die Expression von Mitgliedern des nichtkanonischen planaren Zellpolaritätssignalweges (PCP) zu haben. Die Schlussfolgerung aus diesen Ergebnissen ist, dass ein Wegfall von SFRP1 im Stroma von PDAC in sehr frühen Phasen (und auch in den Tumorzellen selbst) durch miRNAs oder, im Falle der Tumorzellen, durch Hypermethylierung ausgelöst werden könnte. Sezernierte, tumorsupprimierende, parakrine Signale aus dem Stroma und autokrine Signale von den Tumorzellen selbst würden damit wegfallen und die planare Zellpolarität wäre nicht mehr aufrechterhaltbar. Damit würden sich die Polarität und die Migrationsbereitschaft der Tumorzellen so verändern, dass sie ungerichtet wandern könnten, wodurch das Risiko zur Metastasierung zunehmen könnte. Auf diese Weise könnte die stromale Herunterregulierung von SFRP1 bei der Aufrechterhaltung und Progression des PDAC eine Rolle spielen.

Das Harnblasenkarzinom (BCa) ist die zweithäufigste bösartige urologische Tumorerkrankung sowie die siebthäufigste tumorbedingte Todesursache bei Männern. Zur Senkung des erheblichen Rezidiv- und Progressionsrisikos oberflächlicher BCa kommen lokale Immun- oder Chemotherapeutika zum Einsatz, die jedoch starke Nebenwirkungen verursachen können bzw. ungenügende langfristige Effekte bewirken. Eine neuartige Therapieoption besteht in der gezielten Expressionshemmung von Genen, die den Tumorzellen einen Wachstumsvorteil vermitteln. Hierfür eignen sich besonders synthetische Nukleinsäuren wie Antisense-Oligodesoxynukleotide (AS-ODN) und small interfering RNAs (siRNAs). In der vorliegenden Arbeit wurde die Expressionshemmung des potenziellen Targetgens hTERT (humane Telomerase Reverse Transkriptase) mit AS-ODN und siRNAs in BCa-Zellen untersucht. Die Tumorspezifität der hTERT-mRNA-Expression konnte zunächst an tumor- und tumorfreien Gewebeproben von BCa-Patienten gezeigt werden. Die verwendeten AS-ODN reduzierten die hTERT-mRNA-Expression auf bis zu 40%, womit eine Verringerung der Telomeraseaktivität einherging. Die AS-ODN-Behandlung bewirkte des Weiteren eine konzentrationsabhängige Viabilitätsreduktion verschiedener BCa-Zelllinien sowie eine verminderte Zellkoloniebildungsrate. Diese antiproliferativen Effekte waren auf eine Apoptoseinduktion zurückzuführen. Durch eine Vorbehandlung von vier BCa-Zelllinien mit hTERT-AS-ODN konnten die zytotoxischen Effekte der für das BCa relevanten Chemotherapeutika Cisplatin, Mitomycin C und Gemcitabin signifikant verstärkt werden. Nach Untersuchung der AS-ODN-Wirkung in vitro erfolgte die Etablierung eines subkutanen Xenotransplantantmodells der Nacktmaus. Die Eignung einer intraperitonealen Applikation wurde mit fluoreszenzmarkierten AS-ODN belegt. In weiteren Zellkulturexperimenten kamen hTERT-siRNAs, als alternative Methode der Geninhibition, zum Einsatz. Die Reduktion der hTERT-mRNA-Expression auf 50% war mit der durch AS-ODN bewirkten Inhibition vergleichbar. Im Gegensatz zur AS-ODN-Behandlung induzierten siRNAs keine unmittelbare Apoptose. Eine Kombination der siRNAs mit Cisplatin und Mitomycin C bewirkte jedoch eine Verdopplung der Apoptoserate. Um die molekularen Mechanismen der Wirkung der nukleinsäurebasierten hTERT-Inhibitoren und den Einfluss targetunabhängiger Effekte zu untersuchen, wurden transkriptomweite Expressionsanalysen mittels Oligonukleotid-Microarrays durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass die AS-ODN-Behandlung vorwiegend zu einer gesteigerten Expression von Genen führte, die mit einer zellulären Stressantwort assoziiert sind (u.a. ATF3, EGR1, GADD45). Diese Expressionsmuster stimmten in hohem Maße mit denen überein, die durch Transfektion mit AS-ODN gegen andere Targets erhalten wurden. Diese Ergebnisse deuten auf eine, zumindest teilweise, durch off-Targeteffekte ausgelöste Wachstumshemmung hin. Die siRNA-Behandlungen gegen unterschiedliche Targets zeigten relativ geringe Übereinstimmungen in den Expressionsmustern und somit eine höhere Spezifität. Außerdem wurde erstmalig gezeigt, dass eine hTERT-Inhibition mit siRNAs zur trankriptionellen Hemmung der Onkogene EGFR und FOSL1 führt. Diese Daten sowie die Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen deuten auf einen wechselseitigen Zusammenhang zwischen hTERT und EGFR in der Regulation der EGFR-stimulierten Proliferation von BCa-Zellen hin. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass hTERT als tumorspezifisch exprimierter und funktionell relevanter Faktor ein hervorragendes Target für eine nukleinsäurebasierte BCa-Therapieoption darstellt. Im Vergleich zu AS-ODN wirken siRNAs grundsätzlich targetspezifischer. Die therapeutische Wertigkeit der lokal applizierten Inhibitoren, insbesondere in Kombination mit herkömmlichen Chemotherapeutika, sollte in nachfolgenden Experimenten im Rahmen eines orthotopen BCa-Xenotransplantatmodells untersucht werden.