Objectives: To investigate the effects of serotonin and melatonin (MLT) on the regulation of malignant growth and the activity of serotonin receptors (5HTR1a/-1b) in prostate cancer (PCa) cell lines. Materials and Methods: In four PCa cell lines (LNCaP, 22RV1, PC3, DU145) and two reference cell lines 5HTR1a and -1b, relative mRNA expression levels were assessed. Different serotonin and MLT receptor agonists and antagonists were used in stimulation and inhibition experiments. Results: mRNA expression of 5HTR1b was higher than that of 5HTR1a in all PCa cell lines. Serotonin showed a significant growth stimulatory effect in all PCa lines. The 5HTR1a and -1b agonists/antagonists did not significantly affect viability. MLT inhibited viability only in PC3 cells. Similarly, the 5HTR1a antagonist induced apoptotic changes in PC3 cells only at 10–4M, while the 5HTR1b antagonist induced necrosis at 10–4M in all cell lines. Cell cycle alterations were seen in PC3 and DU145 cells under the influence of the 5HTR1a antagonist. Conclusions: Serotonin receptor antagonists and agonists as well as MLT influence viability and apoptosis of PCa cell lines at supraphysiologic concentrations. In contrast to other reports, our results do not support a regulatory role of serotonin or MLT receptor activation or inhibition in PCa growth. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

Objectives: To investigate the effects of serotonin and melatonin (MLT) on the regulation of malignant growth and the activity of serotonin receptors (5HTR1a/-1b) in prostate cancer (PCa) cell lines. Materials and Methods: In four PCa cell lines (LNCaP, 22RV1, PC3, DU145) and two reference cell lines 5HTR1a and -1b, relative mRNA expression levels were assessed. Different serotonin and MLT receptor agonists and antagonists were used in stimulation and inhibition experiments. Results: mRNA expression of 5HTR1b was higher than that of 5HTR1a in all PCa cell lines. Serotonin showed a significant growth stimulatory effect in all PCa lines. The 5HTR1a and -1b agonists/antagonists did not significantly affect viability. MLT inhibited viability only in PC3 cells. Similarly, the 5HTR1a antagonist induced apoptotic changes in PC3 cells only at 10–4M, while the 5HTR1b antagonist induced necrosis at 10–4M in all cell lines. Cell cycle alterations were seen in PC3 and DU145 cells under the influence of the 5HTR1a antagonist. Conclusions: Serotonin receptor antagonists and agonists as well as MLT influence viability and apoptosis of PCa cell lines at supraphysiologic concentrations. In contrast to other reports, our results do not support a regulatory role of serotonin or MLT receptor activation or inhibition in PCa growth. / Dieser Beitrag ist mit Zustimmung des Rechteinhabers aufgrund einer (DFG-geförderten) Allianz- bzw. Nationallizenz frei zugänglich.

A necessidade de tratamentos mais eficazes e menos invasivos para os pacientes, em adição à capacidade de diferenciação celular da medula óssea sugere que o transplante de células mononucleares totais poderia ser uma das melhores formas de tratamento para as diversas patologias existentes. Entretanto, vários fatores implicam sobre a viabilidade das células da medula óssea dos quais destacamos a ausência de padronização de protocolo de criopreservação que permita a manutenção da viabilidade celular, sendo altamente necessário o desenvolvimento de estudos nesta área. Deste modo, neste estudo, após a anestesia de um grupo de animais foi realizada punção da medula óssea, separação das células mononucleares e avaliação da viabilidade. Foram testados oito meios diferentes para criopreservação das células. O meio de congelamento A é composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento B contém 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento C tem em sua composição 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo, o meio de congelamento D é composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e 80% de plasma autólogo, o meio E constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo, o meio F contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo, o meio G contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino (SFB) e 47,5% de plasma autólogo e o meio H constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO) e 95% de plasma autólogo. Após as análises realizadas pela técnica de citometria de fluxo, o meio mais eficiente na criopreservação das células mononucleares de suínos foi o protocolo D por possuir maior concentração de plasma autólogo e crioprotetor. / The necessity of the most efficient and less invasive treatments for the patients, in addition to the capacity of cellular differentiation of the bone marrow suggests that the transplant of mononuclear total cells might be one of the best treatment for several pathologies. Meantime, several factors influence on the viability of the cells of the bone marrow as the absence of standardization of criopreservação protocol which could allow the maintenance of the cellular viability, being an important issue of investigation. In this study, after the anaesthesia of a group of animals, samples of bone marrow were collected, following the separation of the mononuclear cells and evaluation of the viability. Eight different protocols were tested for cells criopreservation. The protocol A by 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 40% autologus plasma, B protocol conatained 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 40% autologus plasma, the C protocol was composed 20 % dimetilsulfóxido (DMSO), 40% bovine fetal serum (SFB) e 40% autologus plasma, D protocol was made using 20% dimetilsulfóxido (DMSO) and 80% autologus plasma, E protocol was constituted by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 47,5% autólogo plasma, the F contains 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 47,5% autologo plasma, the protocol G was compoed by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de bovine feta serum (SFB) and 47,5% autologus plasma and the H protocol was 5% dimetilsulfóxido (DMSO) and 95% autologus plasma. After flux citometer analyses, the most efficient protocol in criopreservation of the mononuclear cells of pigs was the protocol D which was composed the by the most amount of autologus plasma and crioprotectant.

Submitted by MARCIA ROVADOSCHI (marciar@unifra.br) on 2018-08-20T12:27:29Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_DiegoBeckerBorin.pdf: 7060697 bytes, checksum: bbf39761011feb8708ec27ab4968daed (MD5) / Made available in DSpace on 2018-08-20T12:27:29Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_DiegoBeckerBorin.pdf: 7060697 bytes, checksum: bbf39761011feb8708ec27ab4968daed (MD5) Previous issue date: 2017-03-27 / The pathophysiology of neurodegenerative diseases is associated with neuronal loss or dysfunction, whose characteristics are determined due to cerebral area affected and progression of the disease. Creatine has physiological importance as energy buffer and storage having protective effects in animal models of neurodegenerative diseases. However, its permeability through the blood-brain barrier (BBB) is very low. The objective of this study is was developing a nanoliposome carrier to facilitate the delivery of creatine to the central nervous system (CNS), thus could potentiate the effects of creatine. In order to test the safety of liposomes toxicity, assays were performed in cell culture and in vivo, as well as analyzed in streptozotocin-induced (STZ) dementia model. The method of production of liposomes by ethanol injection, proved to be efficient, since particles with a polydispersion index (PDI) of 0,237, negative Zeta potential (-12.5 mV) and average size of 213 nm were obtained. The size was confirmed by transmission electron microscopy where spherical particles of 100-200 nm were observed. In in vitro toxicity assays, blank liposomes (without creatine - BL) as well as creatine liposomes (CrL) at concentrations of 0.02 and 0.2 mg/mL did not alter the viability of VERO cells cultured. It also did not alter viability of neural cells in hippocampal slices from adult rats. In toxicity assays in vivo, subchronic treatment with both liposomes did no changes hematological and biochemical markers in blood of young rats, but an increased in creatine concentrations were observed in the brains of CrL-treated animals was observed. In the animal model of STZ-induced dementia in adult mice, behavioral changes such as habituation memory deficit and long-term aversive memory were reversed by 21 days treatment with free creatine and CrL. The animals of the STZ groups did not present alterations in energetic metabolism enzymes in the hippocampus, but they showed a reduction in creatine levels in cerebral tissue, which was reversed by the treatment with free creatine and CrL. It is suggested from the results that CrL can be used safely, but further studies should be performed to verify its performance in other neurodegeneration models. / A fisiopatologia de doenças neurodegenerativas está associada à perda ou disfunção neuronal, cujas características são determinadas pela região onde ocorre a perda e pela velocidade de progressão da doença. A creatina possui importância fisiológica como mecanismo de reserva e tampão energético tendo efeitos protetores em modelos animais de doenças neurodegenerativas, apesar de possuir baixa permeabilidade através da barreira hematoencefálica (BHE). Assim, o objetivo do presente estudo foi desenvolver um carreador lipossomado para facilitar a entrega de creatina ao sistema nervoso central (SNC), e assim potencializar os efeitos da creatina livre. Com a finalidade de testar a segurança dos lipossomas testes de toxicidade em cultura de células e in vivo foram realizados, assim como testes em um modelo de demência induzido por estreptozotocina (STZ) para avaliar sua funcionalidade, também foi avaliada a concentração de creatina no SNC dos animais. O método de produção de lipossomas por meio da injeção de etanol demonstrou ser eficiente, pois foram obtidas partículas com índice de polidispersão (IPD) 0,237, potencial Zeta de -12,5 mV e tamanho médio de 213 nm. O tamanho foi confirmado por microscopia eletrônica de transmissão onde observou-se partículas esféricas de 100 a 200 nm. Nos testes de toxicidade in vitro, os lipossomas brancos (sem creatina - LB) bem como os lipossomas de creatina (LCr) nas concentrações de 0,02 e 0,2 mg/mL não alteraram a viabilidade de células em cultura da linhagem VERO, e tampouco de fatias da área cerebral hipocampo de ratos adultos. Nos testes de toxicidade in vivo, não foram observadas alterações com o tratamento subcrônico com ambos lipossomas em marcadores hematológicos e bioquímicos em ratos filhotes, porém foi observado um aumento nas concentrações de creatina no cérebro dos animais tratados com LCr. No modelo animal de demência induzido por STZ em camundongos adultos foram observadas alterações comportamentais como déficit de memória de habituação e aversiva de longo prazo ambas revertidas pelo tratamento de 21 dias com creatina livre e LCr. Os animais dos grupos STZ não apresentaram alterações em enzimas do metabolismo energético no hipocampo, porém apresentaram redução nos níveis de creatina, que foi revertido pelo tratamento com creatina livre e LCr. Sugere-se a partir dos resultados obtidos, que os LCr podem ser utilizados com segurança, porém mais estudos devem ser realizados para verificar seu desempenho em outros modelos de neurodegeneração.

A necessidade de tratamentos mais eficazes e menos invasivos para os pacientes, em adição à capacidade de diferenciação celular da medula óssea sugere que o transplante de células mononucleares totais poderia ser uma das melhores formas de tratamento para as diversas patologias existentes. Entretanto, vários fatores implicam sobre a viabilidade das células da medula óssea dos quais destacamos a ausência de padronização de protocolo de criopreservação que permita a manutenção da viabilidade celular, sendo altamente necessário o desenvolvimento de estudos nesta área. Deste modo, neste estudo, após a anestesia de um grupo de animais foi realizada punção da medula óssea, separação das células mononucleares e avaliação da viabilidade. Foram testados oito meios diferentes para criopreservação das células. O meio de congelamento A é composto por 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco´s Modified Eagle´s Médium (DMEM) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento B contém 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 40% de Plasma Autólogo, o meio de congelamento C tem em sua composição 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% soro fetal bovino (SFB) e 40% plasma autólogo, o meio de congelamento D é composto de 20% dimetilsulfóxido (DMSO) e 80% de plasma autólogo, o meio E constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) e 47,5% de plasma autólogo, o meio F contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) e 47,5% de plasma autólogo, o meio G contém 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de soro fetal bovino (SFB) e 47,5% de plasma autólogo e o meio H constitui-se de 5% dimetilsulfóxido (DMSO) e 95% de plasma autólogo. Após as análises realizadas pela técnica de citometria de fluxo, o meio mais eficiente na criopreservação das células mononucleares de suínos foi o protocolo D por possuir maior concentração de plasma autólogo e crioprotetor. / The necessity of the most efficient and less invasive treatments for the patients, in addition to the capacity of cellular differentiation of the bone marrow suggests that the transplant of mononuclear total cells might be one of the best treatment for several pathologies. Meantime, several factors influence on the viability of the cells of the bone marrow as the absence of standardization of criopreservação protocol which could allow the maintenance of the cellular viability, being an important issue of investigation. In this study, after the anaesthesia of a group of animals, samples of bone marrow were collected, following the separation of the mononuclear cells and evaluation of the viability. Eight different protocols were tested for cells criopreservation. The protocol A by 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 40% autologus plasma, B protocol conatained 20% dimetilsulfóxido (DMSO), 40% Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 40% autologus plasma, the C protocol was composed 20 % dimetilsulfóxido (DMSO), 40% bovine fetal serum (SFB) e 40% autologus plasma, D protocol was made using 20% dimetilsulfóxido (DMSO) and 80% autologus plasma, E protocol was constituted by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Dulbecco\'s Modified Eagle\'s Médium (DMEM) and 47,5% autólogo plasma, the F contains 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) and 47,5% autologo plasma, the protocol G was compoed by 5% dimetilsulfóxido (DMSO), 47,5% de bovine feta serum (SFB) and 47,5% autologus plasma and the H protocol was 5% dimetilsulfóxido (DMSO) and 95% autologus plasma. After flux citometer analyses, the most efficient protocol in criopreservation of the mononuclear cells of pigs was the protocol D which was composed the by the most amount of autologus plasma and crioprotectant.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2017-04-04T13:41:12Z No. of bitstreams: 1 carolinacapobiangoromanoquintao.pdf: 5826645 bytes, checksum: 4f15d7e284831e0765599e53f7e872e8 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2017-04-04T15:37:37Z (GMT) No. of bitstreams: 1 carolinacapobiangoromanoquintao.pdf: 5826645 bytes, checksum: 4f15d7e284831e0765599e53f7e872e8 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-04T15:37:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 carolinacapobiangoromanoquintao.pdf: 5826645 bytes, checksum: 4f15d7e284831e0765599e53f7e872e8 (MD5) Previous issue date: 2009-03-13 / O uso de plantas medicinais para o tratamento de muitas doenças está associado à medicina popular de diferentes partes do mundo. A cada dia, os microrganismos que causam prejuízos à saúde humana e animal têm se mostrado mais resistentes à maioria dos antibióticos conhecidos, fato este que estimula a procura por novas substâncias com potencial antimicrobiano, principalmente de ocorrência natural. O uso na medicina popular das espécies do gênero Pterodon e Lippia, devido aos seus efeitos anti-reumáticos, analgésicos e antiinflamatórios, é amplamente difundido. Para a avaliação da atividade antimicrobiana e análise de citotoxicidade em fibroblastos bovinos foram selecionadas as espécies Pterodon emarginatus Vog., Lippia lacunosa, Lippia rotundifolia e Lippia salvifolia. Os microrganismos-alvo deste estudo (Staphylococcus aureus, Streptocccus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis e Klebsiella pneumoniae) foram obtidos de animais com mastite, oriundos de propriedades rurais no interior de Minas Gerais. De P. ermaginatus, foram testadas as frações hexânica (FH), acetato de etila (FAE), butanólica (FB), metanólica (FM) e etanólica (FE), sendo que a atividade antimicrobiana foi evidenciada para as FH e FE. A menor CIM encontrada foi a da FH contra S. dysgalactiae na concentração de 0,625 mg/mL. Para a obtenção dos peptídeos de Lippia, foram preparados os extratos aquosos (EA) a partir de suas folhas e flores. Os EA de L. lacunosa e L. salvifolia foram bacteriostáticos (CIM = 80 µ g/mL) para S. aureus e S. agalactiae, respectivamente. L. rotundifolia foi bacteriostática contra S. uberis (CIM=10 µ g/mL). O teste de viabilidade celular demonstrou que os extratos obtidos de Lippia lacunosa e Lippia rotundifolia não foram tóxicos quando comparados ao controle, no entanto, foram observadas alterações morfológicas em concentrações >80 µ g/mL. Com esses resultados, pode-se verificar que tais plantas apresentam potencial antimicrobiano e sua utilização pode estar prevista tanto para o tratamento da mastite como em formulações antissépticas utilizadas em laboratórios, como aqueles de cultivo celular. / The use of medicinal plants in the treatment of many diseases is associated with the popular medicine from different parts of the world. Each day, the microrganisms that cause damages to the human and animal health have shown more resistance to most of the known antibiotics, stimulating the search for new antimicrobials substances, mainly from natural occurrence. The use of the specie Pterodon ermaginatus and genus Lippia as anti-inflammatory, antirheumatic and analgesic drugs in the popular medicine is widely spread. For the evaluation of the antimicrobial activity the species Pterodon emarginatus Vog., Lippia lacunosa, Lippia rotundifolia and Lippia salvifolia were selected the microrganisms (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Streptococcus bovis and Klebsiella pneumoniae) which were retrieved from animals with mastitis raised on farms in the country side of Minas Gerais. From P. ermaginatus were tested the hexanic (HF), ethyl acetate (AEF), buthanol (BF), methanol (MF) and ethanol (EF) fractions. The antimicrobial activity was evidenced by the HF and EF. The smallest MIC found was of the HF against S. dysgalactiae in the concentration of 0.625 mg/mL. For the attainment of peptides of Lippia, the aqueous extracts (AE) from its leaves and flowers had been prepared. The AE of L. salvifolia and L. lacunosa were bacteriostatic (MIC=80 µ g/mL) for S. aureus and S. agalactiae, respectively. L. rotundifolia was bacteriostatic against S. uberis (MIC=10 µ g/mL). The test of cellular viability for the extracts of Lippia sp showed that they were not toxic when compared to the control. The morphologic analysis showed that alterations in the format of the cells occurred in a concentration ≥ 80 µ g/mL. These results of this study provide additional evidence that these plants have antimicrobial potential against microrganisms that cause bovine mastitis and suggest its use as a natural antiseptic.

O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Metabolic syndrome (MetS) is a complex disorder represented by a set of cardiovascular risk factors, including endothelial dysfunction, oxidative stress and inflammation. Syzygium cumini has hypoglycemic, anti-inflammatory, antipyretic, hypolipidemic and antioxidant properties, besides antiviral and anticarcinogenic action. Considering the importance of MetS in the current economic and social context, morbidity and complications following this pathology, the aim of this study was to assess biochemical and inflammatory parameters in patients with MetS. Moreover, to check the effect of aqueous extract of Syzygium cumini (ASc), as well as its mechanism of action on the activity of the enzyme adenosine deaminase (ADA) and other biochemical parameters under hyperglycemic and oxidative conditions in vitro. To develop the first step of this work, were obtained samples of serum and whole blood of patients diagnosed with MetS (n=40) before initiating a physical activity program, in which we analyzed biochemical, oxidative and inflammatory parameters. The results showed an increase in ADA, acetylcholinesterase (AChE) and dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) activities in lymphocytes of patients with MetS. Further, in these patients, we observed an increase in the activity of butyrylcholinesterase (BuChE) and ˠ- glutamyltransferase (ˠ-GT) and in C-reactive protein (hsCRP) and nitric oxide (NOx) levels, as well as disturbances in antioxidant defenses and some correlations between the parameters analyzed were obtained. Thus, these results demonstrated that MetS affects the purinergic and cholinergic systems reflecting the inflammatory and immune status of these patients, besides altering the antioxidant defenses of the same. For in vitro determinations, first, erythrocytes (RBCs) from healthy individuals were used. ASc was able to prevent the increase in ADA activity caused by exposure of RBCs to hyperglycemic conditions for 2 hours. Also, ASc acted on the activity of ADA similarly caffeine and insulin, on the other hand, dipyridamole attenuated the effect of ASc by antagonizing its the effect or by competition with the extract. Thus, it can be suggested that the ASc act by influencing the metabolism of adenosine, and its effect is related to the presence of phenolic compounds and the antioxidant properties attributed to this plant. In the next step of this work , we observed an increase in the ADA activity and lipid peroxidation and decreased cell viability after exposure of lymphocytes from healthy subjects to 2,2 ' -azobis -2- amidinopropane dihydrochloride ( AAPH ) by 2 hours in vitro. ASc and gallic acid were able to reduce the ADA activity, but did not alter the lipid peroxidation caused by AAPH . The ASc increased cell viability and reduced the activity of the enzyme lactate dehydrogenase ( LDH ). ASc, by reducing the activity of ADA, may be increasing adenosine levels and helping to maintain the beneficial effects caused by the same, such as antioxidant, anti-inflammatory and antithrombotic actions. Furthermore, the results demonstrate the cytoprotective effect evidenced by the extract. We conclude that the changes found in patients with MetS are related to inflammatory and oxidative processes and may favor the prevention and control of this clinical situation Also, the protective effects demonstrated by ASc contribute to the understanding of the wide use of this plant and its therapeutic value in the treatment of various clinical conditions. / A Síndrome Metabólica (SMet) é um transtorno complexo representado por um conjunto de fatores de risco cardiovascular, entre eles a disfunção endotelial, o estresse oxidativo e a inflamação. O Syzygium cumini, conhecido popularmente como jambolão, é uma planta que apresenta propriedades hipoglicêmicas, antiinflamatórias, antipiréticas, hipolipidêmicas e antioxidantes, além de ação antiviral e anticarcinogência. Considerando a importância da SMet no contexto social e econômico atual, a morbidade e as complicações consequentes desta situação clínica, o objetivo deste estudo foi avaliar parâmetros bioquímicos e inflamatórios em pacientes com SMet. Além disso, verificar o efeito do extrato aquoso de Syzygium cumini (ASc), bem como o seu mecanismo de ação sobre a atividade da enzima Adenosina desaminase (ADA) e outros parâmetros bioquímicos sob condições hiperglicêmicas e oxidativas, in vitro. Para o desenvolvimento da primeira etapa deste trabalho, foram utilizadas amostras de soro e sangue total de pacientes com diagnóstico de SMet (40 pessoas) antes de iniciarem um programa de atividades físicas, nos quais foram analisados parâmetros bioquímicos, inflamatórios e oxidativos. Os resultados demonstraram um aumento na atividade das enzimas ADA, acetilcolinesterase (AChE) e dipeptidil peptidase IV (DPP-IV) em linfócitos de pacientes com SMet. Ainda, nesses pacientes, observou-se um aumento na atividade das enzimas Butirilcolinesterase (BuChE) e gama-glutamiltransferase (GGT), e nos níveis de proteína C reativa (PCR) e óxido nítrico (NOx), bem como alterações nas defesas antioxidantes e algumas correlações entre os parâmetros analisados foram obtidos. Assim, esses resultados demonstraram que a SMet afeta a atividade da ADA e o sistema colinérgico refletindo o estado imune e inflamatório desses pacientes, além de alterar as defesas antioxidantes dos mesmos. Para as análises in vitro, primeiramente, foram utilizados eritrócitos (RBCs) de indivíduos saudáveis. O ASc foi capaz de prevenir o aumento na atividade da ADA causado pela exposição dos RBCs a condições hiperglicêmicas por 2 horas. Ainda, o ASc atuou sobre a atividade da ADA de maneira semelhante a cafeína e a insulina; por outro lado, o dipiridamol atenuou o efeito do ASc por antagonizar o efeito do mesmo ou por competição com o extrato. Assim,pode-se sugerir que o ASc influencia no metabolismo da adenosina, além de seu efeito estar relacionado a presença de compostos fenólicos e às propriedades antioxidantes atribuídas a essa planta. Na etapa seguinte da realização deste trabalho, observou-se um aumento na atividade da ADA e na lipoperoxidação, e redução da viabilidade celular após a exposição de linfócitos de indivíduos saudáveis ao 2,2 -azobis (aminodipropano) dihidrocloreto (AAPH) por 2 horas, in vitro. O ASc e ácido gálico foram capazes de reduzir a atividade da ADA, mas não alteraram a lipoperoxidação causada pelo AAPH. O ASc aumentou a viabilidade celular e reduziu a atividade da enzima Lactato desidrogenase (LDH). O ASc ao reduzir a atividade da ADA, pode estar aumentando os níveis de adenosina e colaborando para a manutenção dos efeitos benéficos provocados pela mesma, como ações antioxidantes, antiinflamatórias e antitrombóticas. Além disso, os resultados demonstraram o efeito citoprotetor evidenciado pelo extrato. Podemos concluir que as alterações encontradas nos pacientes com SMet estão relacionadas aos processos inflamatórios e oxidativos e podem favorecer medidas de prevenção e controle desta situação clínica. Também, os efeitos protetores demonstrados pelo ASc contribuem para o entendimento da ampla utilização desta planta e de seu valor terapêutico no tratamento de diversas patologias clínicas.

O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.

O Transplante de Células Tronco Hematopoiéticas (TCTH) baseia-se no princípio de infusão de Células Tronco Hematopoiéticas (CTH) CD34 + num receptor condicionado. Sabe-se que tais células são capazes de gerar uma nova hematopoiese bem como que o benefício do aumento de dose de CD34 + estende-se de aproximadamente 2 x 106 CD34/Kg a 5 x 106 CD34/Kg do receptor. A determinação do número de CD34 baseia-se no número total de CD34, porém sabe-se que apenas uma pequena porção celular do grupo de CD34 está associada à recuperação medular. Uma maneira de refinar a detecção desse grupo de células quando comparado com a quantificação do CD34 total, é a análise citométrica dos padrões de tamanho e granularidade citoplasmática. No contexto do TCTH autólogo e algumas vezes no TCTH alogênico, onde a infusão das células precursoras é feita com intervalo superior a três dias após a sua coleta, o congelamento das CTH CD34 +as faz-se necessário para que as células permaneçam viáveis. O agente crioprotetor mais comumente usado é o Dimetilsulfóxido (DMSO), que em temperaturas extremamente baixas protege as CTH da morte celular, porém em temperatura ambiente torna-se tóxico. As reações adversas do receptor no momento da infusão são atribuídas, em geral, ao DMSO. Portanto existem diferentes protocolos de congelamento de CTH que usam diferentes concentrações desse agente, com o intuito de reduzir as reações adversas e, ao mesmo tempo, evitar a morte celular decorrente de temperaturas baixas. Alguns estudos concluem que a viabilidade das CTH congeladas pode ser mantida com concentrações baixas de DMSO ou com celularidade elevada nos produtos congelados. Além do DMSO, a albumina e o Hidroxetilamido (HES) são usados como adjuvantes na proteção celular ao frio. Alguns protocolos de criopreservação usam apenas o DMSO enquanto outros indicam a necessidade do uso dos três agentes juntos. Não há consenso a respeito do protocolo de criopreservação ideal. Um expressivo número de trabalhos sugere o uso do DMSO 5 a 10% juntamente com a albumina 20% e HES 6% em enxertos com celularidade até 3 x 108 células nucleadas/ml, porém existem sugestões de protocolos diferentes desse padrão que usam o DMSO como agente único assim como concentrações menores de DMSO. Com relação ao efeito tóxico do DMSO, os eventos adversos do paciente no momento da infusão são atribuídos diretamente a ele. Porém evidências recentes apontam outras possíveis causas: citocinas liberadas durante o período de armazenamento e infundidas com o enxerto e micro-agregados leucocitários decorrentes da elevada celularidade do enxerto. O presente estudo pretendeu verificar a viabilidade das CTH através da medida da Anexina-V e 7-AAD pela técnica de citometria de fluxo usando-se diferentes concentrações de DMSO, bem como comparou tal desfecho entre amostras que foram congeladas apenas com DMSO e amostras congeladas com DMSO, HES e albumina. Além disso, foram verificados os níveis de citocinas inflamatórias nos enxertos e sua relação com a concentração de DMSO. / Bone Marrow Transplantation (BMT) is based on the principle of hematopoietic CD34 stem cells infusion in a conditioned recipient. It is known that such cells are capable of generating a new hematopoiesis, as well as known that the benefit of the increase of CD34 dose is goes best when it is between from 2 and to 5 x 106 CD34 by patient’s body weight. The CD34 determination is based on the total CD34 number. However it is known that only a small portion of the CD34 population is related to the marrow repopulating capacity. An alternative way of detecting such cells when compared to total CD34 dose is the cytometric analysis of citoplasmatic granularity and size patterns. In the autologous BMT context and, sometimes in the allogeneic type where the graft infusion occurs more than three days after the graft harvest, the CD34 cells freezing is necessary to keep their viability. The crioprotective agent most commonly used is the DMSO, which at extremely low temperatures this agent protects the CD34 cells from dying. However at temperatures above 30°C it became toxic and causing adverse events in the patient receiving them. The adverse reactions at the infusion moment in general are linked to DMSO, thus there are some different cryopreservative protocols using different DMSO concentrations aiming to reduce the incidence of collateral damage and at the same time avoid the CD34 from dying at low temperatures. Some studies conclude that CD34 viability can be maintained with the use of high mononuclear cellularity in the graft or with low DMSO concentrations. Besides DMSO, albumin and Hydroxietilstarch (HES) are cryoprotectants adjuvants. Some Cryopreservation protocols only use DMSO as cryoprotective agent, while others indicate the three agents together. There is no consensus about the ideal cryopreservation protocol. An important number of studies suggests the use of DMSO 5 to 10% with albumin 20% and HES 6% in grafts with cellularity number of no more than 3 x 108 cells/ml, however there are some new different protocols that use DMSO alone and at lower concentrations. As to adverse events during the infusion moment, it is known that DMSO causes the effects. However, there are evidences that other causes could cause these events: cytokines released during the storage freezing time and infused with the graft and leukocyte micro-clots caused by the high cellularity in the graft. The present study aimed to study the viability of CD34 cells using the Annexin-V and 7-AAD apoptosis reagents through the flow cytometry technique in different DMSO concentrations as well as compared such outcome among the samples only frozen with DMSO and samples frozen with DMSO, HES and albumin. Besides, it was verified the inflammatory cytokine levels and their relationship with the DMSO concentration.