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Previous issue date: 2007-07-06 / Hepatitis C virus (HCV), described in 1989, belongs to the
Hepacivirus genus and the Flaviviridae family and possess a genomic RNA
contend 9,600 nucleotides approximately. Due to its high genetic variability
was classified in genotypes (1-6) and subtypes (a, b, c etc.). The genotypes
1a, 1b, 2a, 2b and 3a, have cosmopolitan distribution; whereas in Brazil,
genotypes 1 and 3 are the most prevalent. The incubation period for acute
hepatitis C varies around 6 to 10 weeks and approximately 80% of the acute
infections are asymptomatic. Between 10 and 20 years, about 20% of the
chronic infections evolve for cirrhosis and these can evolve for death due to
complications. In accordance with the World Organization of Health, 3% of
the world-wide population (about 180 million individuals) is infected for the
HCV. Hepatitis C can be diagnosed by means of serological tests and
analyses-based techniques of Molecular Biology. The assay more commonly
used for detention of antibodies anti-HCV is ELISA. This test consists of
antigens fixed in the wells of a microtiter plate. Specific antibodies against
these antigens will adhere to the plate and will be detected by antibodies
anti-human immunoglobulin colorimetric markers. This study aims the
confection of ELISA using a multiepitope protein (MEHCV). The samples
used in the assays are from blood banks. Tests with nickel resin-purified
MEHCV and column-purified MEHCV (desalting and non-desalting) had
been carried through. The tests aimed standardize the concentration of the
protein for well and the dilutions of the serum; to evaluate unspecific
reactions through tests with positive serum for other infections (positive anti-
HBV and HAV) and with negative serum; and to compare ELISA in house
with commercial ELISA. In accordance with the standardization results tests,
how much bigger the protein pureness degree biggest was the protein
concentration necessary in the microplates sensitization to evaluate possible
crossed-reactions. The tests to evaluate unspecific reactions using the resinpurified
MEHCV had presented higher sensitivity (92.86%) and specificity
(82.89%) than the column-purified MEHCV (Sensitivity = 80%; Specificity =
47.5%). In contrast of ELISA in house, commercial ELISA only presented a
result false-positive for sample 5 (anti-HBV positive). To evaluate the
interference of other proteins, it was carried through, an assay using
microplates sensitized with unspecific proteins. These results suggest that
MEHCV protein don t possess yet the ideal pureness degree to be used as
antigen and that possibly, the false-positive reactions occurred had been
caused by unspecific proteins present with the recombinant protein MEHCV. / O vírus da hepatite C (HCV), descrito em 1989, pertence ao gênero
Hepacivirus e à família Flaviviridae e possui um RNA genômico contendo
aproximadamente 9.600 nucleotídeos. Devido à sua alta variabilidade
genética foi classificado em genótipos (1-6) e subtipos (a, b, c etc.). Os
genótipos 1a, 1b, 2a, 2b e 3a, têm distribuição cosmopolita; enquanto que
no Brasil, os genótipos 1 e 3 são os mais prevalentes. O período de
incubação para hepatite C aguda varia em torno de 6 a 10 semanas e
aproximadamente 80% das infecções agudas são assintomáticas. Entre 10
e 20 anos, cerca de 20% das infecções crônicas evoluem para cirrose e
estas podem evoluir para óbito devido a complicações. De acordo com a
Organização Mundial de Saúde, 3% da população mundial, cerca de 180
milhões de indivíduos, está infectada pelo HCV. A hepatite C pode ser
diagnosticada laboratorialmente por meio de testes sorológicos e por meio
de análises baseadas em técnicas de biologia molecular. O ensaio mais
comumente utilizado para detecção de anticorpos anti-HCV é o ELISA. Esse
teste consiste de antígenos virais que são fixados nas cavidades de uma
placa de microtitulação. Anticorpos específicos contra esses antígenos irão
se aderir à placa e serão detectados por anticorpos anti-imunoglobulina
humana contendo marcadores colorimétricos. Esse estudo tem como
objetivo a confecção de um ELISA utilizando uma proteína multiepítopo
(MEHCV). As amostras utilizadas nos ensaios vieram de bancos de sangue.
Foram realizados testes com MEHCV purificada em resina e em coluna de
níquel (dessalinizada e não-dessalinizada). Os testes consistiam em
padronizar a concentração da proteína por cavidade e as diluições dos
soros; avaliar reações inespecíficas através de testes com soros positivos
para outras infecções (anti-HBV e HAV positivos) e com soros negativos; e
comparar o ELISA in house com um ELISA comercial. De acordo com os
resultados dos testes de padronização, quanto maior o grau de pureza da
proteína, maior foi a concentração de proteína necessária na sensibilização
das microplacas para avaliar possíveis reações cruzadas. Os testes para
avaliar reações inespecíficas utilizando a proteína purificada em coluna
apresentaram sensibilidade (92,86%) e especificidade (82,89%) superior aos
realizados com a proteína purificada em coluna (Sensibilidade = 80%;
Especificidade = 47,5%). Ao contrário do ELISA in house, o ELISA comercial
apresentou somente um resultado falso-positivo para a amostra 5 (anti-HBV
positiva). Para avaliar a interferência de outras proteínas, foi realizado ainda,
um ensaio utilizando microplacas sensibilizadas com proteínas
inespecíficas. Esses resultados sugerem que a proteína MEHCV ainda não
possui o grau de pureza ideal para ser utilizada como antígeno e que
possivelmente, as reações falso-positivas ocorridas foram causadas por
proteínas inespecíficas presente junto à proteína recombinante MEHCV.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:ambar:tede/3080 |
| Date | 06 July 2007 |
| Creators | Silva, Marcelo Zanini de Oliveira e |
| Contributors | Pfrimer, Irmtraut Araci Hoffmann, Torres, Fernando Araripe Gonçalves |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Ciências Ambientais e Saúde, PUC Goiás, BR, Ciências da Saúde |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_GOAIS, instname:Pontifícia Universidade Católica de Goiás, instacron:PUC_GO |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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