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Previous issue date: 2014 / The mycobacterial DNA-binding protein 2 (MDP2) of Mycobacterium tuberculosis is a small, basic protein known to bind to DNA in a non-specific manner and to anchor the nucleoid to the plasma membrane, promoting its unpacking. Motivated by a prior intrinsic disorder pre-diction in silico, we have used a complementary set of techniques to characterize this pro-tein, such as heat and chemical stability, gel filtration, limited proteolysis and electrophoret-ic mobility. Our results suggest that the MDP2 is structurally disordered, since it (1) was pre-dicted to be an IDP, having 86 % of its structure disordered; (2) resisted to denaturation in-duced by boiling temperature and to the chemical thrichloroacetic acid (TCA); (3) migrated anomalously on SDS-PAGE, appearing to be 1. 4-fold higher its calculated molecular weight; and (4) was highly sensitive to proteolysis performed by proteinase K in comparison to glob-ular proteins. We also accomplished two experiments to determine the quaternary structure of the MDP2, such as gel-filtration and glutaraldehyde crosslinking. These two experiments showed that the protein has a tendency of self-aggregation, forming large clusters of pro-tein. We also performed the site-directed mutagenesis by allelic exchange in the hns gene, in order to develop a M. tuberculosis strain lacking the protein MDP2. The result of this knock-out showed that the hns gene is not essential for the survival of the mycobacteria, confirm-ing previous results performed by transposon mutagenesis. Combined with previous results related to MDP2 from other works, we speculate that this protein uses its highly disorder N-terminal region to bind to DNA through its KAAK and PAKK sequences in a non-specific man-ner. Thereby the MDP2 may act as a promiscuous protein inside the cell, binding to different regions of nucleoid by forming large clusters of proteins, in order to perform the DNA un-packing and to regulate several genes of the mycobacteria. We hope this work may contrib-ute to a better understanding of the mycobacterial metabolism, since the M. tuberculosis still stands a major global threat. / A proteína micobacteriana ligadora de DNA 2 (MDP2) de Mycobacterium tuberculosis é uma proteína pequena e de caráter básico, conhecida por se ligar ao DNA de uma forma não es-pecífica e de ancorar o nucleóide à membrana plasmática promovendo o seu desempacota-mento. Motivados por uma predição de desordem intrínseca in silico prévia, nós usamos um conjunto de técnicas complementares para caracterizar esta proteína, tais como determina-ção da estabilidade ao calor e a desnaturantes químicos, gel filtração, proteólise limitada e mobilidade eletroforética. Nossos resultados sugerem que a MDP2 é estruturalmente de-sordenada, uma vez que ela (1) foi predita por ser uma proteína intrinsecamente desorde-nada (IDP), possuindo 86 % da sua estrutura desordenada; resistiu à desnaturação induzida por temperatura de fervura e pela ação química do ácido tricloroacético (TCA); (3) migrou anomalamente em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), aparentando ser 1,4 vezes maior que o seu peso molecular calculado; e (4) foi altamente sensível à proteólise realizada pela protei-nase K, em comparação às proteínas globulares.Nós também realizamos dois experimentos para determinar a estrutura quaternária da proteína, como a gel filtração e o crosslinking por glutaraldeído. Estes dois experimentos mostraram que a proteína tem uma tendência a auto agregação, formando grandes aglomerados em solução. Também foi realizada a muta-gênese sítio-dirigida por troca alélica no gene hns, com o intuito de desenvolver uma cepa de M. tuberculosis sem a proteína MDP2. O resultado deste nocaute mostrou que o gene hns não é essencial para a sobrevivência da micobactéria. Combinado com resultados prévios de outros trabalhos relacionados à MDP2, nós especulamos que esta proteína usa sua região N-terminal altamente desordenada para se ligar ao DNA por meio das suas sequências repetiti-vas KAAK e PAKK de uma forma não específica. Desta forma, a MDP2 deve atuar como uma proteína promíscua dentro da célula, ligando-se a diferentes regiões do nucleóide pela for-mação de grandes aglomerados de proteína, com o objetivo de realizar o desempacotamen-to do DNA e de regular diversos genes micobacterianos. Nós esperamos que este trabalho possa contribuir para um melhor entendimento do metabolismo micobacteriano, uma vez que o M. tuberculosis ainda é uma grande ameaça global.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/urn:repox.ist.utl.pt:RI_PUC_RS:oai:meriva.pucrs.br:10923/6702 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Abbadi, Bruno Lopes |
| Contributors | Bizarro, Cristiano Valim |
| Publisher | Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, Porto Alegre |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Unknown |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da PUC_RS, instname:Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul, instacron:PUC_RS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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