Das Entwicklungsstadium bestimmter Krankheiten ist eng mit der Konzentration diverser Proteine in biologischen Proben verknüpft. Eine sensitive Detektion dieser sogenannten Biomarker kann somit maßgeblich zu einer frühzeitigen Diagnose beitragen. In der vorliegenden Arbeit wurden strukturierte, fluorogene Sonden entwickelt, die die Möglichkeit bieten in einem homogenen Verfahren Zielproteine sensitiv, direkt und in Echtzeit nachzuweisen. Die peptidische Erkennungssequenz für das Zielprotein wurde dabei von zwei zueinander komplementären PNA-Segmenten flankiert. Die Sonden besaßen dadurch eine haarnadelförmige Anordnung, die kontrolliert eingebaute Reporter in eine enge Proximität zwang und ein minimales Hintergrundsignal im ungebundenen Zustand gewährleistete. Durch die Wechselwirkung mit dem Zielprotein erfolgte eine Reorganisation der Sondenstruktur, die fluoreszenzspektroskopisch verfolgt werden konnte. Für den Einbau der fluorogenen Einheiten wurden verschiedene Strategien entwickelt und die resultierenden Architekturen bzgl. ihres Einsatzes als sensitives Detektionssystem validiert. Als Zielproteine wurden die intrazellulären SH2-Domänen der Src- und Lck-Kinase sowie die extrazelluläre Matrix-Metalloprotease MMP-7, ein proteolytischer Biomarker für Krebs, untersucht. Besonders die neuartigen In-Stem Hairpin Peptide Beacons (IS-HPBs), bei denen fluorogene Pseudonukleobasen in die PNA-Stammregion eingebaut wurden, zeichneten sich als sensitive Proteasereporter mit einer bis zu 50-fachen Signalverstärkung aus. Mit einem excimerbasierten IS-HPB und einer zeitaufgelösten Fluoreszenzmethode konnte die direkte Detektion von MMP-7 bei einer kritischen Konzentration von 1 nM im humanen Blutserum erreicht werden. Eine mögliche Anwendbarkeit in der medizinischen Diagnostik wurde somit bekräftigt. Weiterhin wurden erste Hinweise mithilfe thermodynamischer Untersuchungen erhalten, dass die Strukturierung einer peptidischen Sonde zu einer erhöhten Selektivität beiträgt. / The developmental stage of certain diseases is closely linked to the concentration of various proteins in biological samples. A sensitive detection of these so-called biomarkers can thus significantly contribute to an early diagnosis. In the present work, structured, fluorogenic probes were developed that offer the possibility of a sensitive, direct and in real-time detection of target proteins in a homogeneous process. The peptidic recognition sequence for the target protein was thereby flanked by two self-complementary PNA segments. As a result, the probes possessed a hairpin-type arrangement, in which suitable appended labels are forced into close proximity and guaranteed a minimal background signal in the unbound state. By interacting with the target protein a reorganization of the probe structure occured, which could be followed by fluorescence spectroscopy. To embed the fluorogenic units different approaches were developed and the resulting architectures were validated relating to their use as a sensitive detection system. As target proteins the intracellular SH2-domains of the Src and Lck kinase and the extracellular matrix metalloprotease MMP-7, a proteolytic biomarker for cancer, were investigated. In particular, the new In-Stem Hairpin Peptide Beacons (IS-HPBs), in which fluorogenic pseudo nucleic acids were incorporated into the PNA-stem region, proved as sensitive protease reporters with an up to 50-fold signal amplification. By using an excimer-signaling IS-HPB and a time-resolved fluorescence method the direct detection of MMP-7 with a critical concentration of 1 nM within complex human blood serum was achieved. A possible application in medical diagnostics was thus confirmed. Furthermore, initial indications were obtained using thermodynamic studies that the structure of a peptide-based probe contributes to increased selectivity.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:HUMBOLT/oai:edoc.hu-berlin.de:18452/17957 |
| Date | 17 September 2015 |
| Creators | Fischbach, Melanie |
| Contributors | Seitz, Oliver, Hackenberger, Christian |
| Publisher | Humboldt-Universität zu Berlin, Mathematisch-Naturwissenschaftliche Fakultät |
| Source Sets | Humboldt University of Berlin |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralThesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | Namensnennung - Keine kommerzielle Nutzung - Keine Bearbeitung, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de/ |
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