Der Nachweis einer chronischen Hepatitis-B Infektion hat in der Transfusionsmedizin aufgrund der potenziellen Übertragung durch Bluttransfusionen einen bedeutenden Stellenwert. Das etablierte Screening umfasst einen direkten HBV-DNA Nachweis sowie einen indirekten Virusnachweis über Anti-HBs- und Anti-HBc-Antikörper. Dieses Screening erfasst den Großteil aller Infektionen. Der Nachweis der okkulten Hepatitis B Infektion, einer Form der chronischen HBV-Infektion, stellt sich jedoch herausfordernd dar. Ursächlich dafür ist unter anderem, dass die HBV-DNA im Blut der okkult-Infizierten in sehr geringer Quantität vorliegt und die Anti-HBs-Antikörper im Laufe der Infektion nicht mehr nachweisbar sind.
Eine Erfassung der antigenspezifischen Immunantwort in T-Lymphozyten stellt eine Alternative zu dem beschriebenen Verfahren dar. Etablierte immunologische Verfahren zur Erfassung der antigenspezifischen Immunantwort sind MHC-Tetramer-Messungen und die Detektion, der von T-Lymphozyten produzierten, intrazellulären Zytokine, wie z.B. INF-. In der vorliegenden Arbeit wurde pSTAT5 als neuer intrazellulärer Aktivierungsmarker untersucht, welcher als Teil des JAK-STAT-Signalweges eine prominente Rolle in der T-Zell-Aktivierung nach der Stimulation mit einem Antigen spielt.
Es wurde untersucht, ob T-Lymphozyten aus Blutspenden und daraus hergestellten Buffy-Coats zur Analyse des Aktivierungsmarkers pSTAT5 isolierbar sind und ob dafür, alternativ zu der Dichtezentrifugation, eine auf Fab-Streptameren-basierende Immunaffinitätschromatografie genutzt werden kann. Darüber hinaus wurde überprüft, inwieweit sich die pSTAT5-Bestimmung eignete, um isolierte, mit Peptid stimulierte virusspezifische T-Zellen durchflusszytometrisch zu detektieren. Aufgrund der hohen Seroprävalenz wurde zunächst die T-Zell-Antwort auf Peptide des Zytomegalievirus untersucht. Abschließend erfolgte die Analyse der STAT5-Phosphorylierung an isolierten T-Zellen chronisch HBV-Infizierter.
Die Untersuchungen zeigten, dass die Fab-Streptamer-basierte Immunaffinitätschromatografie die Selektion funktionsfähiger Zellen mit Hilfe von entsprechenden Fab-Fragmenten ermöglicht. In dieser Arbeit wurden CD4+ Zellen und CD81+ periphere mononukleäre Blutzellen isoliert. Um die Qualität und Ausbeute der hergestellten Zellisolate zu untersuchen, erfolgte in einem ersten Schritt die durchflusszytometrische Analyse selektionierter CD4-Zellisolate im Vergleich zum Ausgangsmaterial Buffy-Coat. Die Isolation der T-Lymphozyten erfolgte vergleichend mittels konventioneller Dichtezentrifugation und der Immunaffinitätschromatografie sowohl aus heparinisiertem Vollblut als auch aus Buffy-Coats. Als Positivkontrolle wurden die Zellen zunächst antigenunspezifisch mit PHA und anti-CD3/CD28-Antikörpern sowie in weiteren Versuchen mit CMV-Peptiden (pp65, IE1) sowie HBV-Peptiden (core, envelope, capsid) kurzzeit-kultiviert und durchflusszytometrisch auf die Expression von pSTAT5 untersucht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Fab-Streptamer-Immunaffinitätschromatografie hochreine Präparate lieferte. Im CD4+ Zellisolat waren durchschnittlich 98,2 % CD4+ Zellen nachweisbar, dabei wurden B-Lymphozyten, NK-Zellen und CD8+ T Lymphozyten vollständig depletiert. Die vergleichende Stimulation der T-Zell-Isolate mit Hilfe beider Methoden nach antigenunspezifischer Stimulation führte zu einem signifikanten (p<0,01) Anstieg des pSTAT5 im Vergleich zur unstimulierten Kontrolle. Der Anteil der STAT5+ Zellen lag in den dichtezentrifugierten Präparaten vor und nach Stimulation höher als in den mit Immunaffinitätschromatografie isolierten Proben. Es eigneten sich sowohl heparinisiertes Vollblut als auch Buffy-Coats aus Vollblutspenden zur Isolation der T-Zellen. Die Stimulation dieser Zellen von CMV+-Spendern mit CMV-Peptiden resultierte in einem signifikanten Anstieg (p<0,05) der Frequenz der pSTAT5+ CD4+ T-Lymphozyten in den dichtezentrifugierten Zellen von 9,3 % ± 3,6 % (unstimuliert) auf 21,6 % ± 6,9 %. Im Zellisolat stieg die Frequenz signifikant (p<0,01) von 0,6 % ± 0,7 % (unstimuliert) auf 7,2 % ± 9,8 %. Somit wiesen die dichtezentrifugierten Zellen einen dreifachen und das CD4+ Zellisolat einen siebenfachen Frequenzanstieg nach antigenspezifischer Stimulation gegenüber der Kontrolle auf. Die Stimulation von T-Zellen CMV–-Spender führte hingegen zu keinem nachweisbaren Anstieg der pSTAT5+ T-Zellen im Vergleich zur Kontrollpopulation. In den mit beiden Methoden isolierten T-Zellen chronisch HBV-Infizierter wurden prozentual mehr pSTAT5+ Zellen in den mit HBV-Peptiden stimulierten CD4+ T-Lymphozyten gemessen als in den Kontrollproben. In den dichtezentrifugierten Zellen stiegen die Phosphorylierungsraten signifikant (p<0,01) von 0,6 % ± 0,3 % auf 1,8 % ± 1,2 %, im CD81-Zellisolat signifikant (p<0,05) von 2,3 % ± 3,4 % auf 5,3 % ± 7,8 % an.
In Summe zeigte sich, dass die Fab-Streptamer-Immunaffinitätschromatografie eine hohe Qualität und Standardisierbarkeit der Zellisolation aufweist. Sie könnte als eine Alternative zu der konventionellen Dichtezentrifugation eingesetzt werden. Die durchflusszytometrische Analyse des Aktivierungsmarkers pSTAT5 ermöglichte eine schnelle Erfassung der T-Zell-Aktivierung. In der vorliegenden Arbeit konnten STAT5-Phosphorylierungen sowohl nach antigenunspezifischer Stimulation als auch nach Stimulation mit CMV- und HBV-Peptiden detektiert werden. Dieser immunologische Test ist in der Transfusionsmedizin bisher nicht etabliert und könnte ergänzend zu herkömmlichen Screenings bei der Erfassung von okkult HBV-Infizierten Anwendung finden. Speziell könnte dieses Verfahren bei fraglichen Befunden ausgewählter Spender im Rahmen transfusionsmedizinischer Routine-Diagnostik ergänzend anwendbar sein. Die Eignung des Assays zur Erfassung von T-Zell-Antworten gegen weitere Antigene stellt einen Ausgangspunkt für zukünftige Untersuchungen dar.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:86635 |
| Date | 28 July 2023 |
| Creators | Vanderheyden, Johanna |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
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| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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