Foi desenvolvida uma nova metodologia de análise de extratos e partes de plantas medicinais, via espectrometria de massas (MS) com infusão direta de amostra, técnica analítica denominada fingerprinting ou \"impressão digital\" química. Essa abordagem, que envolve mínimo prepraro de amostra, foi aplicada visando detectar as condições e as épocas adequadas para cultivo e/ou coleta de produtos naturais, permitindo a obtenção de uma matéria-prima vegetal com princípios ativos e concentrações padronizadas, assim como auxiliar no reconhecimento e na compreensão das interações ecológicas do vegetal com seu ambiente. A metodologia analítica envolveu MS com fonte de ionização por electrospray (ESI) nos modos positivo e negativo e experimentos de fragmentação de íons de interesse (MS/MS) por inserção direta do extrato diluído e frações ativas de Maytenus ilicifolia, de extratos de Arrabidaea chica de diferentes acessos (origens geográficas), assim como óleos de Pterodon pubescens e as amêndoas e o pedúnculo de diferentes clones de Anacardium occidentale. A caracterização das amêndoas e pedúnculos de A. occidentale, assim como de seus respectivos clones por meio do perfil de seus constituintes químicos foi realizada com sucesso. Na extração da amêndoa empregando-se éter, foi possível caracterizar o perfil de triacilgliceróis (TAG) por ESI(+) e ácidos graxos livres por ESI(-). Na extração do suco do pedúnculo empregando-se isopropanol, foram detectados íons referentes aos ácidos anacárdicos por ESI(-). Foram avaliados os principais parâmetros que possibilitam a ionização por ESI, tais como voltagens do capilar, cone e do cone extrator, e a influência de cada um destes parâmetros no perfil obtido nos espectros de ESI(-) do suco. Para A. chica a metodologia mostrou-se eficiente na bioprospecção de antocianidinas e dentre os nove acessos analisados, foi possível indicar aquele que produziu maior quantidade de material corante em relação a biomassa. Também foram avaliadas metodologias de extração por tratamento enzimático, o qual ocasionou aumento da intensidade de agliconas, provavelmente devido à hidrólise das antocianinas. A ocorrência de hidrólise também foi observada na em diferentes metodologias de secagem das folhas, principalmente na secagem realizada ao sol com borrifação de água. Houve variação sazonal na produção de metabólitos secundários, como pudemos observar nos experimentos realizados com amostras coletadas de 2007 a 2009. Para M. ilicifolia, foi possível caracterizar uma série de compostos relacionados à atividade antiúlcera já conhecidos da literatura, como dulcitol, catequina e derivados e flavonóides glicosilados. A metodologia proposta foi aplicada ainda na avaliação do melhoramento agrícola de M. ilicifolia por comparação dos perfis dos compostos identificados. A metodologia desenvolvida para análise direta de P. pubescens mostrou-se eficiente na detecção e identificação de compostos bioativos, possibilitando a caracterização rápida e sem preparo de amostra do óleo da semente. Em conclusão, a técnica de fingerprinting MS permite de maneira rápida, informativa e com mínimo preparo que amostras, que produtos naturais sejam caracterizados e tenham sua qualidade monitorada. / A new analytical methodology for the analysis of medicinal plant parts and extracts via direct infusion mass spectrometry (MS) has been developed. This analytical approach, named chemical fingerprinting, involves minimal sample preparation and was applied in this work with the aim to detect optimal culture conditions, culture periods and harvest times for obtaining raw natural products with highest active principle and concentrations, as well as to understand and recognizing ecological interactions between plant and its surrounding environment. The analytical methodology included MS with electrospray ionization (ESI) in the positive (+) and negative (-) modes, as well as fragmentation of ions of interest (MS/MS) experiments. The diluted extract and active fractions of Maytenus ilicifolia, extracts of Arrabidaea chica from diverse geographic origins (accesses), as well as the oil from Pterodon pubescens and nuts of various clones of Anacardium occidentale were introduced by direct injection. Characterization of nuts and stems from A. occidentale, as well as of its respective clones by their chemical constituents has been successfully performed. After ether extraction of nuts, it was possible to characterize the triacylglycerols (TAG) by ESI(+) and free fatty acids by ESI (-). After extraction of stem juice with isopropanol, diverse ions were identified as anacardic acids by ESI(-). Also, parameters influencing to the ionization process, such as capillary voltage, cone voltage and cone extraction voltage, have been evaluated for the stem juice at ESI(-). For A. chica, the proposed methodology has been proven to efficiently bioprospect the anthocyanins, and among the nine accesses evaluated, it has been possible to identify the one producing higher amounts of dying material proportionally to the biomass. We also evaluated the enzymatic treatment extraction methodology, which resulted in the increase of aglycones content, probably due to anthocyanins hydrolysis. The occurrence of hydrolysis has been also observed when leaves have been water-sprayed while drying in the sun. Seasonal influence on the production of secondary metabolite has been observed in the samples collected on the experiments performed from 2007 to 2009. For M. ilicifolia, it has been possible to characterize a series of compounds related to the anti ulcer activity and already reported in the literature, such as dulcitol, catechin and derivatives and flavonoid glycosides. The proposed methodology has been applied in the evaluation of genetic improvement of M. ilicifolia by comparing the identified compounds profiles. The developed methodology aimed at direct analyzing P. pubescens has successfully detected and identified bioactive compounds of the seed oil, allowing the fast characterization. In conclusion, the proposed MS fingerprinting methodology allows in an informative, straightforward and with minimal sample preparation the chemical characterization and quality control of natural products.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-25042011-113943 |
| Date | 20 December 2010 |
| Creators | Cabral, Elaine Cristina |
| Contributors | Riveros, Jose Manuel |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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